沉积物样品中痕量长链烯酮的分析.doc

沉积物样品中痕量长链烯酮的分析项目完成单位：国家地质实验测试中心项目完成人：孙 青摘 要 利用不同溶剂提取和分离长链烯酮，讨论了不同溶剂提取和分离长链烯酮的效率和影响，利用气相色谱和气相色谱/质谱检测长链烯酮。建立了小样量沉积物样品中痕量长链烯酮的分析方法。方法的检出限优于0.016mg/g样品，回收率为85-110%。关键词 长链烯酮；长链烯酮不饱和度 长链烯酮不饱和度是存在于沉积物中两种相似的长链烯酮的相对丰度比，其定义为 =，C37：2和C37：3代表碳链长度为37，分别有2个和3个不饱和键的烯酮类化合物，与藻类生长的水温相关，它不受盐度、碳酸盐溶解作用及长链烯酮丰度等因素的影响1，已经成为继微体化石（有孔虫等）氧同位素之后又一古气候变化的重要替代指标,在海洋中得到广泛应用；一些学者也相继开展了湖泊沉积物中长链烯酮的研究，发现海洋和湖泊中水体温度对长链烯酮不饱和度的控制机制可能相似，长链烯酮的不饱和度有可能成为湖泊领域的古温度研究的重要替代指标。气相色谱在精确测定长链烯酮的含量时存在着共洗脱、不可逆吸附和峰面积，计算误差等因素的影响。对于小样量的样品，随着烯酮进入体系的降低，重复样间的离差增大，当进入系统的长链烯酮绝对含量低于10ng时，与C37：3和C37：2吸附有关的误差很大，小样量、低长链烯酮的样品，温度估计过高4。与温度的关系对应于长链烯酮组成的微小改变，因此，只有精确定量分析长链烯酮的含量，才能可靠估计古温度。长链烯酮的分析流程与有机地球化学中其它类脂生物标志化合物的分析方法类似，包括用有机溶剂提取、皂化、分离、衍生化、气相色谱和气相色谱-质谱进行定性和定量分析。提取的方法有索式抽提、加速溶剂提取和超声波萃取，分离方法有柱色谱、液相色谱、固相萃取和薄层色谱。对于样品中长链烯酮含量低、其它类脂化合物含量高的样品，避免的偏差、降低烷烃醇的干扰十分重要，结合碱解和柱色谱，改变柱色谱分离过程中淋洗液的配比可能是从大量的醇类中有效分离出烯酮的有效方法2，3。针对古气候研究中长链烯酮分析的需要，考察了不同溶剂提取长链烯酮、碱解，以及柱色谱过程中不同配比的淋洗液分离醇和长链烯酮的效果，建立了简便、灵敏的沉积物样品中痕量长链烯酮的分析方法。1 实验部分1.1 仪器及主要试剂仪器：GC-2010型气相色谱仪，氢火焰离子化检测器。试剂：二氯甲烷，三氯甲烷，甲醇，正己烷，乙酸乙酯，甲苯均为Tedia公司色谱纯；氢氧化钾为北京化学试剂公司优级纯；水为蒸馏水；中性硅胶（Kieselgel 40, 70-230 mesh, Merck）用二氯甲烷索氏抽提48小时，溶剂蒸干后脱活储藏。用于分析的沉积物样品由中国科学院储国强提供。用作内标的n-C36烷烃来自Aldrich公司。色谱柱：DB-1(J&W)，30m0.25mm0.25mm。1.2 色谱条件色谱仪条件：程序升温40-180C， 升温速率为4C /min， 恒温20 min， 程序升温180-300C， 升温速率为2C /min， 恒温30 min。1.3 实验方法1.3.1 样品准备和提取样品冷冻干燥， 磨碎， 称取20克， 加入C36正构烷烃作内标，用二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇（1：1），三氯甲烷：甲醇（1：1）、三氯甲烷：甲醇（2：1）、三氯甲烷：甲醇（3：1），正己烷：乙酸乙酯（9：1）几种溶剂，用改良索氏抽提对含有长链烯酮的湖泊沉积物样品中的长链烯酮抽提 48小时，或用上述溶剂超声萃取，用铜片脱硫， 抽提物在氮气下吹干。1.3.2 皂化 加入6%的氢氧化钾甲醇溶液10ml， 过夜， 用正己烷萃取3次。1.3.3 柱色谱 在硅胶柱（30cm0.4cm（i. d.）上用二氯甲烷-正己烷（1：1，8：2，4：6）分离萃取物， 收集馏分， 在氮气下吹干。1.3.4 衍生化 溶于20ml甲苯中， 加入甲基硅烷化试剂BSTFA2。1.3.5气相色谱分析（GC）和气相色谱/质谱分析在岛津GC-2010型气相色谱仪上进行， 色谱柱为DB-1弹性毛细管柱（30m0.25mm0.25mm）， 氮气作载气， FID检测， 程序升温40-180C， 升温速率为4C /min， 恒温20 min， 程序升温180-300C， 升温速率为2C /min， 恒温30 min。气相色谱-质谱分析（GC/MS）采用Fisons MD-800/GC 8060型气相色谱-质谱仪， 氦气作载气， 程序升温和升温速率与GC相同， 起始保留时间5min。质谱条件：采用电子轰击离子源，电离能70ev， 从m/z50到650进行全扫描， 根据质谱的分子离子峰确定长链烯酮4。按长链烯酮各异构体与C36正构烷烃的响应因子为1计算长链烯酮各异构体的浓度，计算公式为：长链烯酮各异构体的浓度=C36正构烷烃含量长链烯酮各异构体的峰面积1/ C36正构烷烃的峰面积。2 结果与讨论2.1 不同溶剂的萃取效率用二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇（1：1），三氯甲烷：甲醇（1：1， 2：1，3：1），正己烷：乙酸乙酯(9:1)，二氯甲烷：甲醇(93:7)几种溶剂，用索氏抽提和超声提取方式提取沉积物中长链烯酮，发现索氏抽提的提取效率高于超声提取方式，尤其是对C37：4的提取效率高。不同溶剂对长链烯酮的提取效率不同，对于索氏抽提1:1和2:1氯仿：甲醇的提取效率最高，对于超声提取3:1的氯仿：甲醇和二氯甲烷的提取效率最高；根据索氏抽提获得的长链烯酮结果差别较大，1:1的二氯甲烷：甲醇溶剂索氏抽提获得的最高，为0.317，9:1的正己烷：乙酸乙酯溶剂超声抽提获得的最低，为0.113。一般地，索氏抽提获得的 高于超声抽提计算的结果（表1）。的结果远远超出了计算末次冰期和近代间冰期间开阔海洋温度变化的最大温度误差。在众多的利用长链烯酮进行古气候古环境研究文献中，运用了不同的提取方式，对古温度的估计将会产生很大的误差。因此，在利用长链烯酮进行古气候古环境研究时有必要对样品的提取方式进行标准化。表1 不同溶剂对沉积物中长链烯酮的萃取效率提取方式 溶剂C37：4C37：3C37：2索氏抽提氯仿：甲醇(1:1)8.961.190.290.196索氏抽提氯仿：甲醇(2:1)6.321.460.330.185索氏抽提氯仿：甲醇(3:1)1.300.450.130.218索氏抽提二氯甲烷0.130.120.040.240索氏抽提二氯甲烷：甲醇(1:1)1.390.050.020.317索氏抽提正己烷：乙酸乙酯(9:1)1.140.980.250.203索氏抽提二氯甲烷：甲醇(93:7)2.921.510.300.166超声抽提氯仿：甲醇(1:1)2.201.800.380.175超声抽提氯仿：甲醇(2:1)2.632.110.460.178超声抽提氯仿：甲醇(3:1)0.993.142.800.471超声抽提二氯甲烷2.952.530.700.218超声抽提正己烷：乙酸乙酯(9:1)0.751.000.130.113超声抽提二氯甲烷：甲醇(93:7)1.251.040.210.1682.2 柱色谱长链烯酮分析的一个重要问题是C37：2和C37：3与其他组分的共淋洗，选择极性适当的色谱柱可以减少它们的干扰，但是当这些酮在类酯抽提物中为微量组分时，预处理是十分重要的，柱色谱是最好的选择（图1）。一系列增加极性的淋洗液可以顺序分离主要的类酯化合物，如正烷烃、芳香烃、酯、酮、醇。应用这种方法同样可以将正烷烃和C37烯酮从抽提物中的其它化合物如醇类分离出来。不同比例二氯甲烷和正己烷淋洗液的分离效果不同。二氯甲烷：正己烷（1：1）分离酮和醇的效果最佳；对C37烯酮的分析不产生干扰，正己烷：乙酸乙酯(9：1) 基本分离酮和醇，二氯甲烷：正己烷（8：2）不能完全分离酮和醇，当淋洗液大于16ml时，大量醇流出。不同淋洗液对C37的回收率和的影响不大（表2）。图1a图1b图1c图1 a 抽提后未经皂化和柱色谱处理， b抽提后经皂化处理， c 抽提后经皂化和柱色谱处理2.3沉积物样品中痕量长链烯酮的分析方法2.3.1 分析流程根据对不同的预处理结果分析，建立沉积物样品中痕量长链烯酮的分析流程如下：样品冷冻干燥， 磨碎， 称取0.1-2克， 加入C36正构烷烃作内标，用1：1、三氯表2 不同淋洗液分离酮和醇的效果淋洗液成分C37回收率/%*醇的干扰二氯甲烷：正己烷（8：2）105.30.173有二氯甲烷：正己烷（1：1）106.80.177无正己烷：乙酸乙酯（9：1）98.90.173少量注：* C37回收率按氯仿：甲醇(1:1)的抽提量计算甲烷：甲醇溶剂，用改良索氏抽提对含有长链烯酮的湖泊沉积物样品中的长链烯酮抽提 48小时，用铜片脱硫， 抽提物在氮气下吹干。加入6%的氢氧化钾甲醇溶液10ml， 过夜， 用正己烷萃取3次。在硅胶柱（30cm*0.4cm（i. d.）上用1：1二氯甲烷-正己烷分离萃取物， 收集馏分， 在氮气下吹干。溶于20ml甲苯中， 加入甲基硅烷化试剂BSTFA，用气相色谱分析（GC）和气相色谱/质谱分析进行定性和定量分析。2.3.1检出限、精密度和加标回收率称取0.2克沉积物样品6个，按上述流程和条件进行分析，计算长链烯酮，C36正烷烃的检出限、精密度（表3）表3 方法的检出限、精密度和加标回收率组分检出限/mg/g精密度（n=6）/%加标回收率C37：4长链烯酮0.0162.4985.2C37：3长链烯酮0.0111.7698.9C37：2长链烯酮0.0032.43108.2C36烷烃98.11.74分别将0.5g，1.0g和2.0g含长链烯酮的沉积物加入1.5g，1.0g和0g不含长链烯酮的沉积物中，分析结果见表3，长链烯酮回收率为85-110%。3 结 论本研究通过对不同抽提方式、不同溶剂提取和分离长链烯酮等预处理方式进行比较，讨论了不同溶剂提取和分离长链烯酮的效率和影响因素，利用气相色谱和气相色谱/质谱检测长链烯酮。建立了小样量沉积物样品中痕量长链烯酮的分析方法。方法的检出限优于0.016mg/g样品，回收率为85-110%。参考文献1 Sikes E. L., Farrington J. W. and Kegwin L. D. Use of alkenone unsaturation ratio ( ) to determine past sea surface temperatures: Core-top SST calibrations and methodology considerations J. Earth. Planet. Sci. Lett., 1991, 104:36-47.2 Villanueva J., Pelejero C. and Grimalt J. O. Clean-up procedures for the unbiased estimation of C37 alkenone sea surface temperatures and terrigenous n-alkane inputs in paleoceanography J. J. Chromatogr. A, 1997, 757: 145-151. 3 J. Villanueva, J. O. Grimalt, Pitfalls in the chromatographic determina