脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血.doc

www.CRTER.org杜俊文，等. 脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血杜俊文，吴 韬，张 坤，苏白玉，卢彩萍，王伟超，雷 琳，郭静霞(石家庄市第一医院，河北省石家庄市 050000)引用本文：杜俊文，吴韬，张坤，苏白玉，卢彩萍，王伟超，雷琳，郭静霞. 脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血J.中国组织工程研究，2017，21(1):82-86.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.015 ORCID: 0000-0001-8784-8132(杜俊文)文章快速阅读：脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血：效果评价杜俊文，女，1976年生，河北省石家庄市人，汉族，2003年河北医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事内分泌及代谢性疾病研究。通讯作者：王伟超，硕士，石家庄市第一医院，河北省石家庄市 050000中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2017)01-00082-05稿件接受：2016-10-14Du Jun-wen, Master, Associate chief physician, First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, ChinaCorresponding author: Wang Wei-chao, Master, First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China 观察组23例：给予脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞移植治疗对照组24例：给予骨髓干细胞移植治疗结果评价：患肢皮温、经皮氧分压和踝肱指数、疼痛及冷感等临床症状均改善对象分组：下肢缺血性病变患者47例按治疗方法不同分为2组文题释义：联合治疗的理论基础：自身骨髓干细胞的分化、增殖能力显著降低，其黏附和参与血管形成的能力也均显著降低，机体不能为移植后的细胞提供理想的增殖分化环境等造成移植后分化形成血管的能力较弱，因此改善血供的作用也较差。脐带间充质干细胞分化能力强，移植后能够快速分化、增殖形成血管内皮细胞，进而形成血管，恢复下肢血供，改善临床症状。踝肱指数：是血管外科最常用、最简单的一种检查方法，通过测量踝部胫后动脉或胫前动脉以及肱动脉的收缩压，得到踝部动脉压与肱动脉压之间的比值。摘要背景：骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病近年来在临床取得较大进步，但在实践过程中也发现由于老年患者骨髓干细胞数量较少，采集困难，分化能力降低，对临床疗效产生影响。目的：探讨脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血的效果。方法：选择2012年3月至2015年11月在石家庄市第一医院进行干细胞移植治疗的下肢缺血性病变患者47例，根据治疗方法不同分为观察组23例和对照组24例，对照组采用骨髓干细胞移植治疗，观察组采用脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞移植治疗。结果与结论：观察组总有效率显著高于对照组(P=0.039)；观察组患者皮温、经皮氧分压和踝肱指数均显著高于对照组(P 0.05)；观察组患者肢体疼痛、患肢冷感和间歇性跛行评分均显著低于对照组(P 0.05)；由此可见脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血较单独采用骨髓干细胞能够更加有效提高患肢皮温、经皮氧分压和踝肱指数，改善患者疼痛及冷感等临床症状，疗效更佳。关键词：干细胞；移植；脐带间充质干细胞；骨髓干细胞；联合治疗；下肢缺血；效果主题词：下肢；缺血；间质干细胞移植；脐带；骨髓；组织工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Umbilical cord mesenchymal stem cells combined with bone marrow stem cells for treatment of lower limb ischemiaDu Jun-wen, Wu Tao, Zhang Kun, Su Bai-yu, Lu Cai-ping, Wang Wei-chao, Lei Lin, Guo Jing-xia (First Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China)AbstractBACKGROUND: Bone marrow stem cell transplantation has made great progress in the treatment of ischemic disease of the lower limbs. But for the senile patients, the therapeutic outcomes are greatly influenced by few bone marrow stem cells, difficulty in cell collection, and low differentiation ability. OBJECTIVE: To study the clinical efficacy of umbilical cord mesenchymal stem cells combined with bone marrow stem cells in the treatment of lower limb ischemia.METHODS: Forty-seven patients with lower limb ischemia treated with stem cell transplantation in the First Hospital of Shijiazhuang from March 2012 to November 2015 were assigned into either observation group (n=23; transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells combined with bone marrow stem cells) or control group (n=24; bone marrow stem cell transplantation).RESULTS AND CONCLUSION: The total effective rate in the observation group was significantly higher than that of the control group (P=0.039). The skin temperature, percutaneous oxygen branch pressure and ankle brachial index in the observation group were significantly higher than those in the control group (P 0.05). Scores on limb pain, limb coldness and intermittent claudication in the observation group were significantly lower than those in the control group (P 0.05)，具有可比性。诊断标准：下肢缺血性疾病诊断参考杨牟主编的下肢缺血疾病诊断与治疗15。纳入标准：入选病例临床表现与体征符合诊断标准；入选患者符合干细胞移植适应证，且均能耐受干细胞移植；入组患者及家属均签署知情同意书并经医院伦理委员会批准。排除标准：伴有严重心、肝、肾、肺功能不全患者；5年内有明确的恶性疾病及肿瘤病史者。1.4 方法1.4.1 脐带间充质干细胞移植方法 首先制备人脐带间充质干细胞悬液，收集足月顺产或剖腹产健康产妇脐带经前处理后将细胞接种在含有UltraCULTURE培养液的 75 cm2塑料培养瓶中，37 ，体积分数为5%CO2，饱和湿度条件下培养三四天，更换培养基，去除不贴壁的细胞，待细胞生长至80%-90%融合时进行传代培养。取第3代脐带间充质干细胞在显微镜下观察，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达CD105，CD90，CD73，CD44，不表达CD34，CD45，证实为脐带间充质干细胞，见图1。最后将所获取的脐带间充质干细胞制备成1107 L-1细胞悬液待用。观察组患者在硬膜外麻醉下根据缺血范围选取肢体大腿中下段及小腿部前、后、外肌群肌肉注射，每次每个穿刺点注入约0.5 mL细胞悬液，间隔1 cm，多点穿刺注射。1.4.2 骨髓干细胞移植方法 在移植前进行骨髓象评估，术前抽取1 mL进行骨髓涂片排除血液病，之后患者俯卧，接心电血压监护仪，常规消毒，铺创巾后以1%利多卡因进行局部麻醉，采用多侧孔骨髓穿刺针，多点方向以便抽取更多骨髓细胞。骨穿针刺入髂骨骨髓腔后抽取骨髓约 300 mL贴壁注入无菌骨髓保养袋中混匀，在体外以人间充质干细胞分离液(天津市灏洋生物制品公司)处理，离心后提取单个核细胞层，根据所需体积稀释成单个核细胞悬液(细胞浓度1108 L-1)。在DMEM培养基中贴壁生长(图2)，流式细胞仪分析骨髓干细胞表型特征，即CD29、CD44阳性，CD34、CD45阴性。两组患者在硬膜外麻醉下根据缺血范围选取肢体大腿中下段及小腿部前、后、外肌群肌肉注射，每次每个穿刺点注入约0.5 mL细胞悬液，间隔1 cm，多点穿刺注射。1.5 主要观察指标1.5.1 临床症状评分 分别在治疗前，治疗后7 d，2周，3个月和6个月对两组患者进行临床症状评分，评分标准见表1。1.5.2 临床疗效评定 治疗后3个月进行疗效评价。显效：自觉症状消失或不明显，存在足部病变者创面愈合在80%以上；有效：患者自觉症状显著减轻，存在足部病变者创面愈合40%以上；无效：症状改善不明显，存在足部病变者创面愈合不足40%，或病情继续加重，创面扩大。1.5.3 踝肱指数、皮温、经皮氧分压 治疗后3个月采用ES-i000 SPM多普勒血流控测仪检测踝肱指数，采用PICCOLO多功能红外线体温仪检测下肢皮温；采用PF5000经皮氧分压监测仪(瑞典PERIMMED公司)检测经皮氧分压。1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行数据处理，计量资料采用s表示，组间比较采用t 检验，同一指标不同时间点多次测量采用F 检验，有序资料比较采用秩和检验，计数资料采用卡方检验，P 0.05)，具有可比性，见表2。2.3 试验流程图 见图3。2.4 两组患者临床疗效比较 秩和检验结果表明观察组临床疗效优于对照组(u=2.140，P=0.032)；卡方检验结果表明观察组总有效率显著高于对照组(2=4.261，P=0.039)，见表3。2.5 两组患者治疗前后皮温、经皮氧分压和踝肱指数比较 组内比较，治疗后两组患者皮温、经皮氧分压和踝肱指数均较治疗前显著升高(P 0.05)；治疗后观察组患者皮温、经皮氧分压和踝肱指数均显著高于对照组(P 0.05)，见表4。2.6 两组患者治疗前后肢体疼痛、患肢冷感和间歇性跛行评分比较 组内比较，治疗后两组患者肢体疼痛、患肢冷感和间歇性跛行评分均较治疗前显著降低(P 0.05)；治疗后观察组患者肢体疼痛，患肢冷感和间歇性跛行评分均显著低于对照组 (P 0.05)，见表5。2.7 两组患者治疗后不良事件发生情况比较 移植后1周内部分患者自觉移植下肢有发热感，持续2周左右，随访的3个月内两组均未出现死亡病例，无心脑血管急性并发症，肝肾功能，出、凝血时间无特殊改变，未见其他不良反应出现。下肢缺血性病变患者47例回顾性分析对照组(n=24)观察组(n=23)图1 脐带间充质干细胞形态(400)Figure 1 Morphology of umbilical cord mesenchymal stem cells (400)图注：图中A为第1代脐带间充质干细胞，呈星形、多角形等规则形状；B为第3代脐带间充质干细胞，呈长梭形，漩涡状生长。失访(n=0)失访(n=0)纳入分析(n=24)纳入分析(n=23)图2 骨髓干细胞贴壁生长(400)Figure 2 Adherent growth of bone marrow stem cells (400)图3 脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血病变试验流程图Figure 3 Flow chart of the study表注：与治疗前比较，aP 0.05 0.05 0.05 0.05表1 临床症状评分标准 Table 1 Clinical symptom scoring criteria症状0分1分2分3分4分溃疡无单发，直径 2 cm感染无有疼痛无可忍受用止痛药后缓解用止痛药后无效冷感无轻微，保暖后好转保暖后无效麻木感无轻微麻木严重麻木间歇性跛行无400 m200 m100 m50 m或静息痛踝肱指数1 0.6 0.4 0.2 0.25ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH表2 两组基线资料比较 Table 2 Comparison of baseline data between the two groups项目对照组(n=24)观察组(n=23)年龄(s，岁)69.33.968.74.1性别(男/女)18/618/5病因(n)下肢动脉硬化闭塞症糖尿病足192053合并疾病(n)高血压冠心病糖尿病血脂异常12147813111514表5 两组患者治疗前后肢体疼痛，患肢冷感和间歇性跛行评分比较 (s)Table 5 Comparison of limb pain, limb sensation and intermittent claudication score between two groups before and after treatment指标对照组(n=24)观察组(n=23)tP肢体疼痛治疗前治疗后患肢冷感治疗前治疗后间歇性跛行评分治疗前治疗后2.880.712.430.52a3.830.542.730.43a3.510.491.830.24a2.840.641.740.38a3.800.631.030.39a3.480.430.940.17a0.2035.1750.17614.1780.22314.6120.8400.0000.8610.0000.8250.000表3 两组患者临床疗效比较 (n/%)Table 3 Comparison of therapeutic efficacy between two groups组别显效有效无效有效率(n/%)对照组(n =24)106816/67观察组(n=23)165221/91u/2u=2.1402=4.261P0.0320.039表注：与治疗前比较，aP 0.05。3 讨论 Discussion随着近些年来经济的快速发展，人民生活水平显著提高，日常饮食中高脂肪、高蛋白类食物所占比例增加，造成心血管疾病、代谢类疾病风险增加，尤其是糖尿病发生率快速增长，由此并发的周围血管病变的发生率也逐年增加，患者因血管狭窄、闭塞而导致下肢缺血，病情严重者甚至需要截肢治疗。临床对下肢缺血性疾病的治疗主要有两类方法，一类是内科通过药物治疗，另一类是外科通过手术进行血流重建。内科治疗疗效不理想，外科手术治疗风险较大，且由于下肢缺血患者以老年人群居多，身体机能减退，手术风险极大。骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病近年来在临床取得较大进步，成效显著，但在实践过程中也发现由于老年患者骨髓干细胞数量较少，采集困难，且其分化能力降低，对临床疗效产生影响。为此，试验旨在探讨脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血的临床疗效，为提高临床对下肢缺血的治疗成效提供依据。骨髓中含有血管内皮祖细胞和间充质干细胞，在一定条件作用下间充质干细胞能够定向分化形成血管内皮细胞和平滑肌细胞，这是骨髓干细胞能够治疗下肢缺血的基础。近年来多项研究已经表明来源于骨髓的干细胞能够在局部血管损伤位置分化形成新生血管，进而改善肢体血供16-17。与骨髓干细胞相比，脐带间充质干细胞具有资源丰富，采集方便等优势。更为重要的是间充质干细胞更加原始，具有更强的分化增殖能力，诱导分化后能够获得足量的干细胞，具有更加优异的干细胞潜能，免疫原性也较弱。关于脐带间充质干细胞移植在临床方面及动物基础研究的应用为其奠定了坚实的基础18-23。试验结果表明观察组总有效率显著高于对照组(2=4.261，P=0.039)，这说明脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血的临床疗效显著优于单独采用骨髓干细胞，其原因可能有以下2个方面：一方面是老年患者由于身体各项机能衰退，骨髓干细胞的分化、增殖能力显著降低，其黏附和参与血管形成的能力也显著降低，机体不能为移植后的细胞提供理想的增殖分化环境，造成移植后分化形成血管的能力较弱，因此改善血供的作用也较差24-25。另一方面脐带间充质干细胞分化能力强，移植后能够快速分化、增殖形成血管内皮细胞，进而形成血管，恢复下肢血供，改善临床症状。此外，试验结果表明观察组患者皮温、经皮氧分压和踝肱指数均显著高于对照组(P 0.05)，治疗后观察组患者肢体疼痛，患肢冷感和间歇性跛行评分均显著低于对照组(P 0.05)。上述结果的出现主要得益于机体下肢血供的改善，下肢血流通畅，代谢增强，产热增加，因而皮温、经皮氧分压显著升高。由于下肢缺血症状改善，机体下肢疼痛及冷感均明显缓解。综上所述，脐带间充质干细胞联合骨髓干细胞治疗下肢缺血较单独采用骨髓干细胞能够更加有效的提高患肢皮温、经皮氧分压和踝肱指数，改善患者疼痛及冷感等临床症状，疗效更佳。作者贡献：试验设计为杜俊文，试验实施为杜俊文、张坤、苏白玉、王伟超，试验评估为王伟超，资料收集为卢彩萍、雷琳、郭静霞。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：入组患者及家属均签署知情同意书并报经医院伦理委员会批准；脐带获取经产妇及家属知情同意。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References1 倪冷,刘昌伟,刘暴,等.193例45岁以下的下肢缺血患者病因及诊治分析J.中华外科杂志,2010,48(1):15-18. 2 卢勇,郑月宏,刘昌伟,等.我国急性下肢缺血外科治疗现状分析J.临床外科杂志,2011,19(5):302-307. 3 张弘,姜海军,杨植,等.急性下肢缺血67例诊治分析J.山东大学学报:医学版,2012,50(3):87-89. 4 刘子琪,刘爱萍,王培玉.中国糖尿病患病率的流行病学调查研究状况J.中华老年多器官疾病杂志,2015,14(7): 547-550. 5 胡东生,顾东风.中国1980-2010年心血管疾病流行病学研究回顾J.中华流行病学杂志,2011,32(11):1059-1064. 6 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