分子技术在林木遗传育种中的应用.doc

林木遗传育种学作业分子技术在林木遗传育种中的应用学 院： 林学院 专 业： 森林培育 学 号： 2010021450 学生姓名： 江旭升 2011年07月20日分子技术在林木遗传育种中的应用江旭升，赵扬*（贵州大学，贵州贵阳 550025）摘要：综述了分子技术（分子标记和基因工程）在林木遗传育种中的应用，分别从遗传图谱的建立、林木遗传多样性的分析、林木辅助选择育种、DNA指纹图谱及抗性生理上进行论述，表明了分子技术与林木遗传育种的关系。关键词：分子标记，基因工程，遗传育种Molecular techniques in forest genetics and tree breedingJiang-Xusheng，Zhao-Yang *(Guizhou university, Guizhou Guiyang 550025,china)Abstract: This paper reviews themolecular techniques(molecular markersand genetic engineering) inforest genetics and treebreeding, we discuss fromthe establishment of genetic maps，forestgenetic diversityanalysis，tree-assisted selection breeding , DNAfingerprintingandphysicalresistance，shows the relationship between the moleculargenetics and breedingtechnology.Keywords：Molecular markers, genetic engineering,genetics and breeding1 引言林木遗传育种学是探索林木遗传改良的理论与技术的科学1。世界林木遗传育种约有200年的发展历史，目前，全球已有约100个国家和地区开展了林木育种工作2-3。分子生物学技术中的分子标记技术、基因工程技术是林木遗传育种研究的关键。分子标记技术可使树种的群体遗传结构和遗传变异研究具有可操作性，而基因工程技术可从各种生物材料中分离提取到更有效的抗性基因，进而改良现有林木品种，满足生态环境建设和木材生产的需求4。2 分子标记的应用 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。我们在常用的分子标记是SSR、ISSR、RAPD等。2.1 遗传图谱的建立遗传图谱就是通过遗传重组所得到的基因线形排列图，它包括将基因定位于某一特定染色体上，以及测定基因在染色体上线形排列的顺序和距离5。遗传连锁图谱的构建是研究基因组结构和功能的基础，也是遗传育种的依据6。目前用于构建遗传图谱的分子标记主要有PAPD、SSR等技术，从作图效率上看，RAPD标记是构建遗传图谱中用的最多的分子标记, 张博7以美洲黑杨为母本，欧美杨为父本得到的F1为材料，利用分离群体混合分析技术建立两个DNA池，筛选出了与抗黑斑病性状基因相连锁RAPD标记：OPAll7一1550，OPAll3900。尹佟明等8以响叶杨银白杨F1群体为材料，利用PAPD标记，按照拟测交的作图策略，获得了中等密度的银白杨连锁图谱（总图距2402.4cm）和响叶杨图谱的一个框架（总图距479.4cm）。虽然目前常使用RFLP、RAPD以及SSR来秦星基因图谱的构建，但是它们存在一个缺点，就是这些标记对增加图谱密度的能力有限，必须应用新的标记，即SRAP。王刚等9应用SRAP标记构建黄瓜连锁图谱，以黄瓜的2个自交系S06与S52杂交产生的F2群体为作图群体，使用筛选出的6个多态性引物组合对F2群体进行检测分析，得到108个多态性位点，获得覆盖7个连锁群、总长1164.2cm的遗传图谱。2.2 林木遗传多样性的分析广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和。但一般所指的遗传多样性是指种内的遗传多样性，即种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。遗传多样性的起源是染色体畸变、基因突变、重组。Bekessy等10利用RAPD标记研究了智利南洋杉13个种群的遗传变异，结果表明：遗传变异主要存在于居群内(872)，而居群间的遗传变异仅有128。虽然各居群在地理位置上加以划分，但这种分组仅解释了总遗传变异的177。研究结果为这一树种的保护和遗传资源的使用提供了依据；W Powell 和Morgante等用叶绿体微卫星(cpSSR)分析了欧洲白皮松7个群体的305个单株，群体内多态性的变化从0.000到0.629，平均为0.320，而用RFLP方法则没有在该群体中检测到任何多态性；Budak等11利用SRAP对53种野牛草进行遗传多样性分析，多态性高达95。所以说通过分子标记可以有效的检测林木遗传多样性，为各种研究提供依据。2.3 林木辅助选择育种分子标记辅助选择育种技术是通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记来判断目的基因是否存在12。标记辅助选择是基因组研究在常规育种中的直接应用，它的建立包括目的基因的定位和精密定位，以及将与目的基因紧密连锁的分子标记转换为以PCR(聚合酶链式反应)为基础的标记13。Scalfi等14通过对山毛榉遗传图谱的构建，利用连锁图谱上的分子标记(RAPD，AFLP和SSR标记)对叶面积、不同年份的叶片数量等特征QTL作图，研究结果共获得了8个数量性状基因位点，其QTL所控制的变异分量占总变异量的15一35。2.4 DNA指纹图谱DNA指纹图谱是指特定DNA样品通过分子标记技术所显示的DNA片段的总称15。指纹图谱一般可以分为10种：FLP指纹图谱、VNTR指纹图谱、RAPD指纹图谱、SSR指纹图谱、SCAR指纹图谱、SPAR指纹图谱、ISSR指纹图谱、AFLP指纹图谱、CAPS指纹图谱、SNP指纹图谱等。在林业上，DNA指纹图谱具有重要的作用：种质资源及其遗传纯度的鉴定、林木群体遗传结构与多样性研究、物种亲缘关系及分类研究、绘制林木遗传连锁图谱。谢黎黎等16从88对橡胶树SSR引物中筛选出5对产物清晰、扩增稳定的引物，采用6变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合速银染检测方法，构建了87份橡胶树的DNA指纹图谱，分析表明应用SSR分子标记技术进行橡胶树无性系的鉴定是可行的。陈晓明等17对桉树尾叶桉广林4号、巨尾桉广林5号、巨尾桉广林9号3种优良品种的研究，构建了DNA指纹图谱，使桉树优良无性系或品种的鉴定更加准确、快捷。张新叶等18应用RAPD分子标记手段绘制了湖北省12个主栽板栗品种的DNA指纹图谱。我国目前已经应用DNA指纹图谱对杨柳科、柳树、尾叶桉和细叶桉、杉木优选树无性系、芒果、杨梅等林木进行了种质资源鉴定19。3 基因工程的应用基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。采用常规育种技术进行新品种选育不仅时间长、见效慢。而且还存在基因源缺乏等制约因素。通过把现代基因工程与常规育种技术相结合，可极大地缩短林木育种周期、加速育种进程对营造优质人工林、缓解木材供需矛盾、保护生态环境具有重要意义4。林木改良的策略和程序，制定育种方案，引种、选择育种、杂交育种（包括产量、品质、抗性和适应性育种等）理论与方法，以及林木良种繁育途径和方法。3.1 在抗虫方面的应用 在林业中虫害是林木生长的一大天敌，如果我们可以通过基因工程将抗虫基因导入林木中来进行遗传育种的话，那将会解决林业中的一大难题。 林木抗虫分子育种研究的基因主要是苏云金杆菌毒蛋白（Bt 毒蛋白）基因、蛋白酶抑制剂（PI）基因。对于淀粉酶抑制剂(aAI) 基因、几丁质酶（Chitinase）基因、以及某些动物所产生的昆虫毒素基因和利用昆虫重组病毒。 McNabb等20已将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因（Pin ）导入杂种杨NC5339。利用电击法将抗虫Bt基因导入银白杨大齿杨（P. alba LP. grandidentata Michx.）和欧洲黑杨毛果杨（P. nigra L. P. trichocarpa Torr），并获得了抗舞毒蛾（Lymantria dispar Linnaeus）和天幕毛虫（Malacosoma neustria Linnaeus）的转基因植株21。 我国已成为杨树抗虫基因工程研究较早的国家之一，目前获得的转基因杨树已相继进入大田试验阶段。3.2 在抗除草剂中的应用杂草对植物的生长危害很大，目前，广泛使用的除草剂大部分为非选择性除草剂，培养抗除草剂转基因植物，可在使用除草剂后，不被危害达到仅杀死杂草而无害于植物的目的，从而提高植物生长速度及培育出无公害产品，还可以降低化学除草剂的施用量，减少环境污染，预计抗除草剂的转基因植物将是最早商业化的工程之一22。用基因工程手段创造的第一个转基因林木是20世纪80年代末获得的抗除草剂杨树23。在针叶树中，获得了抗草甘膦的转基因欧洲落叶松24。用基因枪法成功地将bar基因转入辐射松和挪威云杉，获得了抗实用除草剂Buster的转基因的针叶树25。3.3 在抗逆境中的作用 我们所说的抗逆境一般是指抗旱、抗寒、抗涝等，上述不良环境因素对植物的影响，都不只是局限于某一生理过程，也不限于个别植物，而是对于植物群体和生态系统的严重破坏。它不仅影响农林业的发展，也直接影响人类的居住环境。因此研究植物的逆境生理，在理论和实践上均有重要意义。最近报道的来自拟南芥的转录因子DREB，在转基因植物中的超量表达，可以系统启动与逆境有关的基因表达，较大幅度地增加了植物的抗性26。在植物抗寒、冻基因工程方面，黄永芬等27对鱼类抗冻蛋白基因（afp）做了深入研究，并将其整合在Ti质粒上，用叶盘法转化郁金香、烟草和油菜，使之获得了一定的抗冻能力。4 结语随着分子生物学的发展,DNA分子标记技术必将在果树遗传育种上取得更大的进步, 使种质资源的研究、分子遗传图谱的构建日趋成熟,使遗传群体、基因标记以及基因文库得到充分利用, 绝大多数农艺性状基因得到准确定位,并利用图位克隆技术克隆重要性状基因,实现分子标记的自动化。分子标记一定能在果树上发挥越来越重要的作用。应用基因工程进行林木育种不仅可以缩短育种周期，又可在基因水平上改造林木抗性遗传物质，提高了育种的目的性和可操作性。所以，只要加大研究投入，并有效地与常规的林业技术措施相配合，必将培育出更多更有价值的林木基因工程新品种。参考文献1毕影东，杨传平，等.生物技术在林木遗传育种中的应用，世界林业研究，2007,20（6）：23-282赵勇刚.林木遗传育种学科50年成就与展望，山西林业科技，2004（3）：1-53李悦，瞿超，续九如，等.中国大陆林木遗传育种学科1949-2003年的研究历程.北京林业大学学报，2005,27（1）：79-874刘振盼，分子生物学技术在林木遗传育种研究中的应用，农业科技与装备，2009,5:23-255李继东，桑玉强，李淑玲，张平，等.RAPD技术及其在林木遗传研究中的应用, 河南农业大学学报，2002,36（1）:63-666张志毅，林善枝，张德强，等现代分子生物学技术在林木遗传改良中的应用北京林业大学学报，2002，24：2502617张博，黄敏仁，诸葛强，等美洲黑杨抗黑斑病基因的RAPD标记筛选和连锁分析遗传，2002(5)：5435468尹佟明，黄敏仁，王明庥，等 利用RAPD标记构建响叶杨和银白杨分子标记连锁图谱，植物学报，1999，11（9）：956-9619王刚，潘俊松，李效尊，等黄瓜SRAP遗传连锁图谱的构建及侧枝基因定位中国科学(C辑)，2004，34(6)：5l0-51610Bekessy S A，Allnutt T R，Premoli A C，et alGenetic variation in the vulnerable and endemic Monkey Puzzle tree .detected using RAPDs JHeredity，2002，88(4)：243-24911Budak H， Sheaman R，PaImaksiz I Molecular characterization of Buffalograss permplasm using sequencerelated amplified polymorphism markersJThero Appl Genet，2004，108：328-33412陈少瑜. 分子标记及其在林木种质资源和遗传育种研究中的应用. 云南林业科技，2002,4：63-7013郑康乐，黄宁标记辅助选择在水稻改良中的应用前景遗传，1997，19(2)：40-4414Scalfl M，Troggio M，Piovani P，et alA RAPD，AFLP and SSR linkage map，and QTL analysis in European beech(Fagus sylvatica L)JTheoretical and Applied Genetics，2004，108：433-44115Vos P，Hoger R，et al. 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