探讨抗肾素对DM大鼠大血管早期AS形成的干预作用 医学论文指导.pdf

探讨抗肾素对探讨抗肾素对 DMDMDMDM 大鼠大血管早期大鼠大血管早期 ASASASAS形成的干预作用形成的干预作用 本文摘自 本文摘自 现代中西医结合杂志现代中西医结合杂志 网址 网址 糖尿病大血管病变是 2 型糖尿病 DM 最常见的慢性并发症之一 是 DM 致残致死的 最主要原因 动脉粥样硬化 AS 是加速 DM 大血管病变产生的主要因素之一 DM 作为一 个独立的危险因素 会加速动脉硬化的进程 而血管内皮细胞的损伤是 AS 发生的初始环节 1 本研究选用与人的 AS 形成过程和病理特征很相似的大鼠作模型 观察 DM 大鼠早期 AS 形成时血清脂联素 ANP 浓度 核转录因子 NF B 活化程度和血管细胞黏附分子 1 VCAM 1 表达及内皮下浸润单核细胞数的变化 探讨抗肾素 血管紧张素系统 RAS 的一线药物血管紧张素转换酶抑制剂贝那普利 Bena 和血管紧张素 1 型受体拮抗剂厄贝 沙坦 Irbe 对 DM 大鼠大血管早期 AS 形成的干预作用及其可能机制 1材料和方法 1 1实验材料 胆固醇 胆酸钠 链脲佐菌素 STZ 均购自祁东同信生化厂 无水乙醚由青岛大学医 学院附属医院提供 ANP ELISA 检测试剂盒购自美国 ADL 公司 EliVision 试剂盒购于福州 迈新生物科技有限公司 兔抗大鼠 NF B VCAM 1 多克隆抗体购于武汉博士德生物工 程有限公司 Bena 由北京诺华公司提供 Irbe由赛诺非 安万特公司提供 健康雄性清洁 级 SD 大鼠 40 只 由青岛大学医学院实验动物中心提供 8 周龄 体质量 180 220 g 标 准化饲养房笼子喂养 每笼 4 只 自由进食饮水 每天光照 12 h 1 2实验方法 1 2 1动物分组及 AS 模型制作将 40 只大鼠 随机分为正常对照 NC 组 DM 组 Bena 组和 Irbe组 每组 10 只 用高糖高脂饮食法制作糖尿病大鼠 AS 模型 2 给予 DM 组 Bena 组 Irbe组喂食高糖高脂饲料 饮用 120 g L 果糖水 1 个月后腹腔注 射 25 mg kg STZ 以pH4 2 的 0 1 mol L 枸橼酸缓冲液配制 NC 组给予普通饮食 注射枸 橼酸缓冲液作为对照 在此基础上 Bena 组给予 Bean 3 mg kg d 灌胃 Irbe 组给予 Irbe 20 mg kg d 灌胃 NC 组 DM 组给予生理盐水灌胃 早晚各灌 1 次 所有大鼠均分笼 按清洁级动物饲养 整个实验周期为 16 周 1 只 DM 组大鼠因神经病变死亡 其他大鼠一 般状况良好 1 2 2血清检测指标和方法实验结束时经左心取空腹血标本 离心 3 000 r min 10 min 在全自动生化分析仪上测定各组稳态血糖 BG 稳态胰岛素 PGI 浓度 与总胆固醇 TC 三酰甘油 TG 低密度脂蛋白胆固醇 LDL C 水平 BG 测定采用葡萄糖 氧化酶法 PGI 测定采用 CIS 放免试剂盒 法国 竞争法 经大鼠内眦静脉采集静脉血 3 mL 室温下静置 3 h 待血液凝固以后再离心 4 500 r min 10 min 取上清液按照试剂盒说明检测 血清 ANP 浓度 1 2 3组织形态学观察大鼠用 10 g L 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后 左胸 切口 经左心室用 8 5 g L 氯化钠灌洗 至损伤的右心耳流出液清亮为止 立即取胸主动脉 剪取同一部位约0 5 cm 长血管段固定于40 g L缓冲甲醛液中过夜 石蜡包埋 横断面行4 m 厚连续切片 苏木精 伊红染色 观察组织形态学改变 1 2 4NF B 和 VCAM 1 表达检测采用免疫组化染色法 取病变部 位血管等距切分 4 5 段 以 40 g L 中性缓冲甲醛固定 石蜡包埋 血管标本横截面连续 切片 厚度 4 m 间隔 100 m 再次切片 共切 3 个层面 采用 EliVision 法分别进行 NF B VCAM 1 免疫组化染色 体积分数 0 03 过氧化氢灭活酶 微波修复 一抗稀释度 均为 1 150 室温孵育 1 h DAB 显色 苏木精复染 NF B 抗体以血管内皮细胞核内 出现棕黄色颗粒物质为阳性 VCAM 1 以细胞膜和细胞质黄染为阳性 高倍镜下计数同一 切片内全部阳性细胞及内皮细胞数 以阳性细胞占内皮细胞百分比表示 NF B 与 VCAM 1 表达的阳性率 1 3统计学处理 本文计量资料均以 s 表示 多组比较采用方差分析 两两比较采用 q 检验 使用 SPSS 11 0 及 PPMS 1 5 统计学软件 3 进行数据处理 2结果 2 1各组血清指标检测结果比较 DM组 Bena组和Irbe组TC TG LDL C与BG水平较NC组显著升高 F 6 18 182 56 q 3 49 28 36 P0 05 DM 组 APN 浓度明 显低于 NC 组 F 65 11 q 19 47 P 0 01 Bena 组和 Irbe组血清 APN 浓度显著高于 DM 组 q 7 37 9 41 P0 05 2 2各组组织形态学改变比较 NC 组大鼠主动脉血管内膜光滑 镜下可见内皮细胞完整 单层紧贴内弹力板 中膜厚 度均一 主要为收缩型平滑肌细胞 DM 组大鼠主动脉管壁可 表 1各组动物血清指标检 测结果比较见有少量黄色脂样斑块向管腔凸出 主要分布于近主动脉弓处 呈片状分布 为 局灶性 镜下见内皮细胞体积增大 部分脱落 连接间隙增大 内皮表面黏附较多单核细胞 内膜有很多单核细胞浸润 并可观察到巨噬细胞和脂肪空泡 胞质中线粒体肿胀 中膜可见 合成型平滑肌细胞 Bena 组和 Irbe 组病变与 DM 组相似 但程度较轻 内膜较完整平坦 内皮黏附及浸润于内膜的单核细胞明显少于 DM 组 内膜增厚明显轻于 DM 组 但两组间 无明显差别 2 3各组免疫组化观察指标的比较 NC 组仅见较少的棕黄色颗粒状阳性染色物质 DM 组可见大量的棕黄色颗粒状阳性染 色物质 部分融合成片 阳性染色百分比明显高于 NC 组 Bena 组和 Irbe组棕黄色颗粒状阳 性染色物质百分比明显低于 DM 组 但高于 NC 组 Bena 组和 Irbe组 NF B 阳性细胞率低于 DM 组 F 37 64 q 9 08 7 58 P 0 01 高 于 NC 组 q 6 01 7 55 P 0 01 Bena 组和 Irbe组 VCAM 1 阳性细胞率明显低于 DM 组 F 255 33 q 20 21 21 03 P 0 01 明显高于 NC 组 q 19 44 18 58 P 0 01 浸 润于内膜的单核细胞数Bena组和Irbe组明显少于DM组 F 176 84 q 22 41 19 82 P 0 01 但多于NC组 q 9 69 12 36 P0 05 见表 2 表 2各组 NF B VCAM 1 阳性细胞率和单核细胞数 比较 3讨论 糖尿病血管病变的病理改变主要是 AS 与非糖尿病血管病变相比 其病理改变重 发 病年龄轻 进展快 RAS 系统参与了 AS 的发病过程 其中 Ang 通过破坏内皮功能 诱 导炎症反应 促进平滑肌细胞的增殖和迁移 促进低密度脂蛋白胆固醇氧化和转移 影响纤 溶等机制 参与 AS 发生和发展 APN 是近年来发现的脂肪细胞因子 是人类脂肪组织中含 量最丰富的转录物质之一 研究表明 APN 可通过抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化 修复损 伤的内皮起到抗 AS 的作用 临床研究发现 APN 水平下降是促使 AS 发生发展的重要因素 NF B 是一种广泛存在于细胞中的多显性转录因子 它调控着细胞黏附分子 细胞因子 生长因子和免疫受体等基因转录 可能是 AS 发生的始动机制之一 在血管内皮早期 AS 病 变发生过程中 NF B 的激活是最早发生的 VCAM 1 可促进单核细胞在血管内皮的 聚集 黏附 迁移进入内皮下层 摄取脂质转化为泡沫细胞 AS 具有炎症的基本特征 有变质 渗出和增生等过程 启动阶段是各种危险因素对血 管内皮的损伤 11 DM 伴随的高糖血症 高脂血症 高胰岛素血症使机体氧化能力增强 从而损伤血管内皮细胞 在内皮细胞被激活后 通过 NF B 使黏附分子如 VCAM 1 E 选择素及 ICAM 1 的 mRNA 表达增加 从而使更多的单核细胞黏附于内皮细胞表面 形成动脉粥样斑块 这是血管性疾病发生发展的关键性步骤 APN 可抑制抵抗素诱导的 VCAM 1 的表达 12 抑制炎症刺激因子对内皮细胞的上述调控过程 从而减少单核细胞 向主动脉内皮细胞的黏附 体外研究显示 APN 还可以通过调节热休克蛋白 90 HSP90 而 促进内皮型一氧化氮合酶 eNOS 的活性 使一氧化氮 NO 生成增加 从而起到保护血管 内皮的作用 13 本实验采用高糖高脂饮食制作 SD 大鼠糖尿病模型 形态学观察显示 DM 组大鼠主 动脉内皮受损明显 大量的单核细胞黏附及浸润于内膜 血管平滑肌细胞 VSMCs 增生 这些都是早期 AS 形成的特征 BG 与血脂水平检测显示 BG 显著升高伴胰岛素敏感性降 低 说明 DM 模型制作成功 2 DM 组 Bena 组 和 Irbe 组血清 TC TG LDL C 水平 较 NC 组均显著升高 但 3 组间血清 TC TG LDL C 与 BG 水平差异无显著性 说明 Bena 和 Irbe 组抗 AS 的作用独立于血糖 血脂改变之外 DM 组 APN 浓度明显降低 Bena 组与 Irbe组 APN 浓度较 DM 组则明显增高 但两组之间无显著差别 主动脉组织免疫组化检测 结果显示 药物干预组血管壁NF B 及 VCAM 1 表达和浸润的单核细胞数明显少于 DM 组 但仍高于 NC 组 说明 Bena 和 Irbe能升高血清中血管保护性因子 APN 的水平 抑制血 管内皮细胞中 NF B 及 VCAM 1 的活化 这可能是其抗 AS 的机制之一 两类药物均 能有效地抑制心肌细胞