QRT-PCR引物设计protocol.doc

QRT-PCR引物设计概述：在QRT-PCR过程中，由于涉及到模板定量，所以要求引物特异性强，并且不能扩增出基因组DNA（如果用DNA酶处理干净另当别论），所以要求跨外显子设计（可以不用考虑基因组DNA污染），或跨内含子设计（检验DNA酶是否处理干净，即无基因组DNA污染）。下面是自己在设计过程的一些心得体会，与大家分享之！要求：1. 上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2。2. GC=30-80%；3. 应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3端最好不为G或/和C。引物3端的5个碱基不应出现2个G或/和C。4. PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80150 bp最为合适（可以延长至300 bp）；5. 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在；6. 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响； 7. 至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都可以的；8. 关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用；9. 避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。设计方案：I. 跨内含子设计方案（尽量不采用，如果方法II没有合适的引物，在考虑I）1. 上下游引物分别在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物可以检验是否有基因组DNA污染；ExonExonFPRPIntronII跨外显子设计方案（尽量采用这种方案设计）1. 上游（A）或下游（B）或上下游引物（C）跨在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物不能从基因组DNA扩增,从而消除基因组DNA污染的影响（这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较多的选择，引物本身质量可能不好，同时注意：引物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，8bp左右）。ExonIntronExonFPRPExonExonFPRPExonExonFPRPExonIntronIntronIntronABC2. 外显子拼接： 以NM-005101为例，首先把该基因的基因组序列拷入EditSeq软件，根据外显子位置指示，按Ctrl+J，弹出如下框，填入78。按Ctrl+N，弹出一新的序列框，拷贝178位碱基到该新序列框中，然后如法炮制，拷贝4861041位碱基到该新序列框的178后面，即为拼接后的外显子序列，按Ctrl+A，然后按Ctrl+C拷贝该序列到Primer Premier 5软件中，如果有3个以上外显子，也按上述方法拼接起来。3. 引物设计：拷贝待设计外显子序列到Primer Premier 5后，点击Gentank框左上角的Primer按钮，如下图所示：然后出现如下引物设计框，点击Search按钮：然后出现如下参数设定框，我们根据外显子与内含子的接头位置（78）和引物设计条件，将上游引物限定在5590之间，将下游引物设定在90634之间，将引物长度设定在80150之间，将引物长度设定在246。（注：这里要求根据外显子在基因组中的位置计算外显子在mRNA中位置，以便于填写Search Ranges，如：NM-004335的外显子在基因组中的位置分别为：1285、11391205、13871447、17521896、22502630，则其在mRNA中的位置：1285、286352、353413、414558、559939，这一点尤其重要，且工作量很大）点击确定，出现确认框，点击OK，出现如下对话框，每一行代表一对引物，点击引物所在行，即可在引物设计栏中查看该引物的详细情况，按照前面所述引物设计要求选择合适的引物，每个基因设计两对引物。4. 引物保存：点击Primer Premier 5菜单栏的Edit，点击Copy，将上下游引物拷入引物设计结果相应的位置，如下图所示：点击菜单栏的File，点击Print，Current Pair，将引物设计结果打印成PDF文件或直接打印出来，以备后续参考。5. 将设计好的引物在NCBI进行Blast，Blast时，可在上下游引物之间加空格或换行，注意记住上下游引物的长