纤支镜灌洗液搜集方法.doc

支气管肺泡灌洗操作方法：一、术前准备同纤维支气管镜（纤支镜）术前准备，常规在纤支镜气道检查后于活检刷检前做BAF。局部麻醉剂为 2%利多卡因。二、BAF 操作技术灌洗部位选择：对弥漫性间质性肺疾病选择右肺中叶（ B4或 B5）或左肺舌段，局限性肺病变则在相应支气管肺段进行BAF。操作步骤：在灌洗的肺段经活检孔注入2%利多卡因1-2ml 再经活检孔通过硅胶管快速注入37灭菌生理盐水每次25-50ml，总量100-250ml，不超过300ml 用50-100mmHg负压吸引回收灌洗液，收率为40-60% 回收液体立即用双层无菌纱布过滤除去粘液，并记录总量 装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中（减少细胞粘附）置于含有冰块的保温瓶中，立即送往实验室检查支气管肺泡灌洗液实验室检测技术：一、BALF细胞总数和分类计数检测 回收灌洗液l200rmin，在4C下离心10分钟，上清(原液或10倍浓缩) -80储存，用做可溶性成分的检测 经离心沉淀的细胞用Hanks液离心冲洗两次，每次5分钟弃去上清后加Hanks液35ml制成细胞悬液 在改良的Neubauer计数台上计数BALF中细胞总数如果细胞数过高时，再用Hanks液稀释，将试管浸入碎冰块中备用 细胞分类计数，采用细胞离心涂片装置，加入备用细胞悬液100l在4C，1200rmin离心l0分钟 将一定量BALF细胞直接平铺于载玻片上，立即用冷风吹干 置于无水乙醇中固定30分钟 染色（Wright或HE） 在40倍光学显微镜下计数计数200个细胞进行细胞分类计数二、BALF中T淋巴细胞亚群的检测 (一)单克隆抗体间接免疫荧光法 获得的BALF细胞成分加l0%小牛血清RPMI1640培养液35ml制成细胞悬液 倒入玻璃平皿中，置于37C 5%CO2培养箱中孵育2小时贴壁处理，去除肺泡巨噬细胞 用Hanks液冲洗离心一次，弃上清留201001 细胞悬液分装3个小锥形离心管内，每管2030l加单克隆抗体CD3、CD4和CD8各2040l，混匀置于4冰箱中12小时 再用HankS液冲洗离心两次，以12000rmin离心20秒 加羊抗鼠单克隆抗体各2040l，置于4C冰箱作用30分钟 现有标本用Hanks液以同样速度和时间离心冲洗两次弃上清留20l充分混匀细胞 取1滴于载玻片上加盖玻片荧光镜下数200个淋巴细胞并计算出标有荧光的细胞阳性率(二)APAAP桥联酶标法 离心制片(方法同前) 丙酮固定l0分钟 干燥后PBS液冲洗并拭去多余液体分别滴加0KT1、0KT4、0KT8 l0l4冰箱中过夜 PBS冲洗并拭去多余液体，分别滴加二抗GAMl01，室温下作用30分钟 PBS冲洗并拭去多余液体，分别滴加三抗APAAP复合物10l 待APAAP作用20分钟时，配制底物液和坚固红的混合物，lmglml，并充分混匀 APAAP复合物作用30分钟后，PBS液冲洗 拭去多余液体分别滴加配制的坚固红和底物的混合物，30湿盒内作用30分钟 水道冲洗，Mayer一苏木素复染液作用20秒后再水道冲洗 甘油胶封片 光镜下(400)计数400个淋巴细胞阳性细胞识别为淋巴细胞周边呈环状玫瑰红色 算出阳性细胞比率 三、BALF中可溶成分检测常用的检测方法 1放射免疫扩散法主要用于BALF中蛋白质检查，在BALF中某些成分浓度很低时此法不太敏感，需将灌洗液浓缩。 2放射免疫(RIA)和酶联免疫(ELISA)检测方法此两种方法均比