抗体HRP标记方法.doc

HRP标记抗体的方法(戊二醛二步法和简易过碘酸钠法)一、戊二醛二步法戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。二、简易过碘酸钠法本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。1. 原理戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。2. 标记步骤（1）称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。（2）反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。（3）将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。（4）用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。（5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 1小时。（7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。3. 结果判定（1）定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。（2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。酶量(mg/ml)OD403nm0.4IgG量(mg/ml)(OD280nm-OD403nm0.42)0.940.62（3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶与蛋白质结合。4. 试剂及器材（1）0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。（2）1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS 1ml混合。（3）1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。（4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。（5）0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。（6）PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 （7）萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。（8）纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。（9）HRP(RZ3.0)。（10）Sephadex G-25层析柱(2cm50cm)。（11）搅拌器，分光光度计，离心机。（12）透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。二、简易过碘酸钠法本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的 HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。1. 原理经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的-和氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。2. 标记步骤（1）称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。（2）于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。（3）将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。（4）加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA 5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。（5）加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4 2小时。（6）将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4过夜。其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。3. 结果判定 除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量(mg/ml)(OD280nm-OD403nm0.3)0.624. 试剂及器材（1）0.1M NaIO4：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。（2）1mM PH4.4醋酸钠缓冲液：0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml；0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml；加蒸馏水至2,000ml。（3）0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液：Na2CO3 0.32g；NaHCO3 0.586g；加蒸馏水至50ml，再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。（4）NaBH4溶液(4mg/ml)：临用时称取NaBH4 4mg溶于1ml蒸馏水中。（5）其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。三、工作浓度的选择在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。1. 酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。2. 其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10g/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔 0.1ml，37孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，371030分钟。以2M HSO4 0.05ml终止反应。3. 结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值，并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。四、注意事项1. 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高、效价高(最低1:16)、纯度高、亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。2. 所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。4. 浓的标记物相当稳定，常加入30-40%甘油于-10下保存。4(二)HRP标记抗体的方法酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。戊二醛二步法1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。2.标记步骤：(1)称取HRP 25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1min，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置41小时。(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。3.结果判定：(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。(2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。酶量(mgml)OD403nm0.4IgG量(mgml)OD280nm-OD403nm0.42)0.940.62酶量(mgml) IgG量(mgml) 酶量克分子比值 440,000 160,000IgG量(3)本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有24的酶与蛋白质结合。4.试剂及器材：(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。(2)1.25戊二醛液：取25戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。(3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。(5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。(8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。(9)HRP(RZ3.0)。(10) Sephadex G-25层析柱(2cm50cm)。(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。简易过碘酸钠法本法是以NaIO先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70的HRP和Ig结合，99的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的-和氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。2.标记步骤:(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。(4)加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加0.1ml新配的4mgml NaBH液，混匀，再置42小时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4过夜。其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。3.结果判定：除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量(mgml)(OD280nm-OD403nm0.3)0.624.试剂及器材:(1)0.1M NaIO：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc (1.361克50ml) 3.7ml0.2M HAc (0.601ml50ml) 6.3ml加蒸馏水至2,000ml。(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:NaCO 0.32克NaHCO 0.586克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)NaBH溶液(4mgml):临用时称取NaBH4mg溶于1ml蒸馏水中。(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。(三)工作浓度的选择在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10gml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1BSA-PBS