唑来膦酸对骨肉瘤细胞生物学行为的影响论文.doc

唑来膦酸对骨肉瘤细胞生物学行为的影响论文 【摘要】目的研究唑来膦酸对骨肉瘤lm8细胞株黏附、迁移、侵袭和基质金属蛋白酶(mmp2、mmp9)的影响方法不同浓度的唑来膦酸处理lm8细胞用cck8法检测细胞毒作用和lm8细胞的黏附力；细胞划痕试验检测lm8细胞的迁移力；transwell小室模型测定lm8细胞对细胞外基质(ecm)的侵袭力；采用酶联免疫吸附实验(elisa)检测培养上清液中基质金属蛋白酶(mmp2、mmp9)的含量结果经过6.25mol/l、12.5mol/l、25mol/l的唑来膦酸处理后lm8细胞的黏附、迁移和侵袭力均明显下调培养上清液中的基质金属蛋白酶(mmp2、mmp9)的含量也明显下降结论唑来膦酸可抑制骨肉瘤lm8细胞的体外黏附、迁移和侵袭力并同时明显降低lm8细胞分泌基质金属蛋白酶 【关键词】唑来膦酸骨肉瘤黏附迁移侵袭mmp2mmp9 双膦酸盐是一种强有力的骨吸收抑制剂被广泛的应用于治疗骨质疏松症变形性骨炎和恶性肿瘤引起的高钙血症和骨痛症等1除了强大的抗骨吸收功能外,双膦酸盐抗肿瘤作用受到越来越多的重视骨肉瘤是一种转移性的肿瘤本研究探讨第三代双膦酸盐唑来膦酸对骨肉瘤lm8细胞黏附、迁移、侵袭和基质金属蛋白酶(mmp2、mmp9)的影响以评价唑来膦酸抑制骨肉瘤转移的效果 1材料和方法 1.1主要试剂和仪器 唑来膦酸(择泰瑞士诺华制药产品北京诺华公司惠赠)；骨肉瘤细胞株lm8购于第四军医大学实验动物中心；rpmi1640培养液为hyclone公司产品;小牛血清为兰州民海生物公司产品；纤连蛋白（fn）购自sigma公司；基质胶matrigel购自collaborativersearch公司；transwell小室为corning公司产品；cck8试剂盒为日本同仁化学研究所dojindolaboratories产品；mmp2和mmp9elisa试剂盒为oncogene公司产品WwW.133229.Com美国shellab2300型恒温co2细胞培养箱日本olympusbh2型光学显微镜美国biotect2550型自动酶标光度仪等 1.2细胞培养 骨肉瘤细胞株lm8贴壁生长于含10新生牛血清(ncs)rpmi1640培养液中于37、5co2的饱和湿度孵箱中培养生长至7080融合时将细胞用0.25的胰酶消化后传代取对数生长期细胞作后续实验 1.3细胞黏附试验 将10g/ml的fn以50l/孔加入96孔板4包被基膜过夜次日水化基底膜即吸出残余液体每孔加入100l含10g/lbsa的pbs,37孵育1h分别取6.25、12.5、25.50、100mol/l不同浓度唑来膦酸处理24h的lm8细胞经洗涤、消化后用prmi1640液稀释调细胞浓度为5105/ml分别加入到处理后的96孔板每孔100l每组平行设3个复孔37、5co2条件下温育1h温育结束后弃去各孔培养液pbs冲洗除去未黏附细胞弃pbs后加100l培养液和10l的cck8试剂37、5co2条件下孵育4h后用酶标仪测各孔450nmod值黏附抑制率(%)1(实验组od值对照组od值)100 1.4细胞迁移试验 将处于对数生长期的lm8细胞接种于6孔培养板中,置37、5%co2及饱和湿度的培养箱中培养待细胞覆盖孔底80%以上时,在单层细胞表面用200l枪头在孔中划一直线后,用pbs漂洗2次以去除划下的悬浮细胞加入不同浓度的唑来膦酸的培养基继续培养24h;倒置显微镜下观察划痕中细胞迁移情况 1.5细胞侵袭实验 在transwell上室聚碳酸酯膜上涂1mgml的matrigel50l37、30min使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构取指数生长期lm8细胞以0.25胰酶消化、离心、计数后以0.1bsa的rpmi1640培养液调整细胞数1106ml取细胞100l接种于transwell上室内加入唑来膦酸的培养基处理细胞每组3个复室；下室加入含0.1bsa的rpmi1640培养液600l置37、5co2培养箱中48h培养结束将滤膜以甲醇固定棉签擦掉膜表面细胞然后用giemsa染料染色10min200倍光镜下选择膜上下左右中5个不同视野的穿过膜的细胞数,按下式计算药物对肿瘤细胞的侵袭抑制率抑制率(%)1(实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数)100 1.6cck8法检测细胞毒性 取对数生长期lm8细胞以rpmi1640培养基调整细胞浓度至5104ml加入96孔培养板中每孔加细胞悬液100l,24h后吸弃培养基加入含不同浓度唑来膦酸的rpmi1640培养基置于37、5co2的饱和湿度孵箱中培养48h后取出培养板每孔加入10lcck8继续培养4h后,用酶标仪在450nm处测定每孔光吸收值（a值）并计算细胞生长抑制率细胞生长抑制率(%)=（1实验组a值/对照组a值）100% 1.7酶联免疫吸附实验(elisa)检测mmp2和mmp9 0、6.25、12.5和25mol/l浓度的唑来膦酸作用lm8细胞48h后运用elisa试剂盒按其操作说明书对细胞培养的上清液进行检测在酶联免疫检测仪上测450nm波长的吸光度值通过标准品的a值和已知浓度绘制出标准曲线在标准曲线上找出各a值对应的浓度 1.8统计学方法 所有实验数据结果以s表示应用spss11.5统计分析软件,各组间比较行单因素方差分析,p0.05为差异有统计学意义 2结果 2.1唑来膦酸对lm8细胞黏附力的影响 唑来膦酸可以显著抑制lm8细胞在纤连蛋白（fn）的黏附6.25mol/l、12.5mol/l、25mol/l、50mol/l和100mol/l的唑来膦酸作用24h后黏附抑制率分别为（22.13.2）%、（34.73.5）%、（45.92.3）%、(54.32.5)%和(71.72.8)%各组间抑制率比较差异均有统计学意义(f=127.631,p0.05) 2.2唑来膦酸对lm8细胞迁移力的影响 实验组和对照组划线后在镜下视野中可见一条细长等宽的无细胞划痕区24h后对照组细胞运动迁移基本上覆盖了大部分划痕区而实验组随着唑来膦酸的浓度增大lm8细胞向划痕区移动的距离越来越小划痕区依然明显存在见图1可见唑来膦酸能明显抑制骨肉瘤lm8细胞的迁移力且唑来膦酸的浓度越大抑制细胞迁移作用越明显 2.3唑来膦酸对lm8细胞侵袭力的影响 不同浓度唑来膦酸处理的lm8细胞48h后lm8细胞浸润穿过人工基底膜matrigel的能力通过transwell小室得到测定唑来膦酸处理组的lm8细胞浸润穿过matrigel膜的细胞数要比对照组的细胞数明显减少,见图26.25mol/l和12.5mol/l、a为经过划线和给药继续培养时的细胞情况;b、c、d分别为0、6.25和12.5mol/l的唑来膦酸作用24h后的细胞迁移情况(倒置显微镜100) 图1唑来膦酸对lm8细胞迁移力的影响 a、b、c、d分别为0、6.25、12.5和25mol/l浓度的唑来膦酸作用48h后穿过matrigel膜的细胞(giemsa染色,200) 图2唑来膦酸对lm8细胞侵袭力的影响 25mol/l浓度的唑来膦酸对lm8细胞侵袭力的抑制率分别为（25.63.6）%、（42.13.7）%和（70.25.3）%各组间差异具有统计学意义(f=110.909,p0.05)说明唑来膦酸以剂量依赖的方式抑制lm8细胞的浸润能力 2.4唑来膦酸对lm8细胞毒性的测定 结果显示6.25mol/l、12.5mol/l、25mol/l、50mol/l和100mol/l浓度的唑来膦酸对lm8细胞生长抑制率分别为（7.01.4）%、（14.73.0）%、（30.62.2）%、（53.73.4）%和（77.11.7）%组间差异具有统计学意义（f=405.589,p0.05）说明6.25mol/l、12.5mol/l的唑来膦酸作用48h后对lm8细胞的毒性作用相对不明显 2.5唑来膦酸对lm8细胞分泌mmp2和mmp9的影响 结果显示唑来膦酸能显著抑制mmp2和mmp9的分泌其抑制基质金属蛋白酶（mmp2、mmp9）效应和唑来膦酸呈剂量依赖关系各组间两两比较有统计学意义（mmp2组：f=58.959、p0.05；mmp9组：f=73.798、p0.05）见表1 3讨论 肿瘤转移始于恶袭而侵袭是贯穿肿瘤转移全过程的重要步骤已有实验证实肿瘤细胞首先通过膜表面的受体与基底膜、基质成分层粘连蛋白、纤粘连蛋白和胶原蛋白结合；然后肿瘤细胞分泌表1唑来膦酸对lm8细胞分泌基质金属蛋白酶的影响或利用细胞膜上的多种蛋白酶降解基底膜和基质；最后肿瘤细胞定向运动穿越破损的基底膜和基质部位而实现转移2抗肿瘤细胞侵袭及转移药物一般是通过上述各个步骤来发挥作用的 癌细胞侵袭转移中细胞骨架参与配体整合素细胞骨架系统的信息传递通过构型改建调控细胞形态及运动行为的改变,同时还影响着金属蛋白酶的分泌及基因的表达3,4实验显示唑来膦酸能显著下调lm8细胞对fn的黏附力kubista等5报道唑来膦酸明显破坏骨肉瘤细胞的微管等细胞骨架分析其机制我们认为唑来膦酸抑制lm8细胞的黏附力可能和微管系统的破坏密切相关唑来膦酸能够通过破坏微管系统影响细胞骨架构型的改建阻断配体整合素细胞骨架系统的信号传递进而抑制整合素的亲和力及细胞外形的铺展从而下调lm8细胞的黏附能力此外配体整合素细胞骨架系统还可以通过ip3、ca2+等各种信号传递机制来调节细胞的运动性诱发癌细胞的迁移6,7图1显示唑来膦酸破坏微管系统阻断配体整合素细胞骨架系统的信号传递进而抑制lm8细胞的运动能力 本实验中lm8细胞在趋化剂诱导下穿过transwell小室底部涂有matrigel的聚碳酸酯膜通过统计穿过膜的细胞数观察药物对lm8细胞侵袭能力的影响实验结果显示唑来膦酸能显著抑制lm8细胞的侵袭力6.25mol/l、12.5mol/l、25mol/l浓度的唑来膦酸对lm8细胞侵袭力的抑制率分别为（25.63.6）%、（42.13.7）%和（70.25.3）%但是唑来膦酸能抑制lm8细胞增殖从而影响穿过膜的细胞数一定程度上抑制其侵袭力我们实验显示唑来膦酸抑制细胞增的因素虽然存在但是起次要的作用,kubo等8在研究另外一种双膦酸盐min发现甚至在1mol/l的很低浓度也能明显抑制恶性骨肿瘤细胞的侵袭力如用1mol/l的min处理saos2骨肉瘤细胞72h后79.2的肿瘤细胞失去了侵袭力而其活性只降低了0.6这个结论和本实验结果基本一致但是其抑制侵袭力效应的差异可能和不同的双膦酸盐药物、不同的骨肉瘤细胞株有关因此唑来膦酸抑制lm8细胞的侵袭力主要是抑制细胞侵袭过程的本身而不是主要因为唑来膦酸的细胞毒作用 细胞外基质（ecm）降解是肿瘤侵袭的关键步骤而基质金属蛋白酶（包括mmp2和mmp9）是降解ecm的主要酶类9本研究elisa结果提示唑来膦酸能有效抑制基质金属蛋白酶（mmp2和mmp9）的表达这在cheng等10研究中得到了部分的证实阿仑膦酸呈剂量和时间依赖性抑制mmp2mrna的转录和mmp2蛋白的表达从而抑制骨肉瘤细胞的侵袭力 综上所述唑来膦酸显著抑制lm8细胞的黏附、迁移及侵袭力并显著下调基质金属蛋白酶（mmp2和mmp9）的表达实验结果提示唑来膦酸能够有效抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移而唑来膦酸等双膦酸盐对骨组织尤其是骨转换活跃区域具有很高亲和力从一定程度上作为天然的骨靶向剂可以在骨肉瘤中积聚很高的浓度从而发挥细胞毒性作用和抑制骨肉瘤细胞的转移有着广阔的临床应用前景 【参考文献】 1rodanga,martintj.therapeuticapproachestobonediseasesj.science,2000,289(5484):15081514. 2kohnec,liottala.molecularinsightsintocancerinvasion:strategiesforpreventionandinterventionj.cancerres,1995,55(9):18561862. 3giancottifg,egrinsignalingj.science,1999,285(5430):10281032. 4calderwoodda,shattilsj,egrinsandactinfilaments:reciprocalregulationofcelladhesionandsignalingj.jbiolchem,2000,275(30):2260722610. 5kubistab,triebk,seveldaf,etal.anticancereffectsofzoledronicacidagainsthumanosteosaracellsj.jorthopres,24(6):11451152. 6plowef,haasta,zhangl,etal.ligandbindingtointegrinsj.jbiolchem,2000,275(29):2178521788. 7savaresedm,russelljt,fatatisa,etal.typeivcollagenstimulatesanincreaseinintracellularcalcium.potentialroleintumorcellmotilityj.jbiolchem,1992,267(30):2192821935. 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