蓝藻化感物质《翻译》.doc

从澳大利亚和亚洲分离出的新的抗菌活性藻类对绿藻和蓝藻的化感作用（翻译）摘要：从澳大利亚、印尼、尼泊尔、泰国和越南的不同生境条件下，新分离出了198种蓝藻门的菌株，他们产生的抗菌活性物不受绿藻门空星藻属、栅列藻属和单针藻属的不利影响。我们发现了侧生藻属的十个菌株、念珠藻属的七个菌株和眉藻属的三个菌株能够产生具有较宽广光谱的抗菌化合物。他们中的有些生物活性的蓝藻细菌能抑制三种藻类，有些只能抑制两种，有些仅仅能抑制一种。另外，这二十种有效的菌株也通过了其他几种蓝藻细菌的筛选。这几种蓝藻细菌包括：在有光的自养条件下和黑暗的异样条件下均生长良好的项圈藻doliolum ；在澳大利亚和世界其他地方产生影响的三种有毒物种Microcytis aeruginosa, Anabaena circinalis 和Nodularia spumigena。至少有一种侧生藻属产生的生物活性物质会阻碍海藻叶绿体中光合作用的电子传递，虽然其他一些种类并不影响光合作用。在大多数情况下，生长抑制效果在有蛋白酶的存在条件下进行测试。本文的结果依据自然中合理的化学抑制、竞争和藻类种群的相互克制而讨论得出的。关键字：筛选、蓝藻、绿藻、抗菌素、生物活性化合物、抗生作用、化感作用简介：微生物群的科学和商业利益被证明是它具有丰富的天然活性产物来源。广泛的蓝藻细菌筛选计划，尤其是在70年代后期开展的计划导致了新型的抗肿瘤、抗菌和抗病毒性质的化合物的发现。(Patterson et al., 1991, 1993, 1994; Moore,1996; Falch et al., 1995; Kulik, 1995). 通常情况下，从蓝细菌中分离出的生物活性化合物主要有两种用途。其一师为了发现能应用于药学、农业和生物控制的新型化合物；另外一种则是为了更好的理解单个有机体和他们所在的自然群落之间的相互作用。两种目的都需要从自然种群中筛选新的可培育有机体，并且要了解生物活性菌株的分布和频率。当前我们主要描述从广泛的生境和地点筛选出的198中独立的蓝细菌对绿藻和蓝藻的抑制作用。材料和方法Cultivation of cyanobacteria蓝细菌培育 主要是从澳大利亚、印尼、尼泊尔、泰国和越南的土壤和淡水样品从分离出来蓝细菌样品放置于Allen and Arnon (1955)中，用NaNO3(10 Mm)和高浓度的NiSO4（四倍标准浓度，aday & Smith, 1983)处理，在斜床上用低连续的cool-white u-orescent 照明条件下生长。通过早期描述方法将蓝细菌基本提纯(de Chazal & Smith, 1996; de Chazal et al., 1992). 不确定的单种藻污染通过显微观察来确定，如果有必要则用深度镀层方法重提纯。一种从Macrozamia中分离出的念珠藻物种作为生产和指示菌株而被测试。接下来的提纯程序中，将固氮微生物培养基上的NaNO3删除。用于筛选的细胞置于锥形烧瓶中，暴露在空气中，在250C连续低光照条件下培养几个星期至几个月后直接应用。用于生理性实验的细胞在置于亮度为110umol辐射量子的喷洒0.3%的CO2空气中，16:8的明暗交替循环中培养。为了能再黑暗下进行自养生长，添加了10mM的果糖（如果是培养集胞藻属和念珠藻属的则可以用葡萄糖代替）到培养基中。光和作用的光是用LI-185 Li-cormeter模型测定的。用于筛选的细胞置于锥形烧瓶中，暴露在空气中，在250C连续低光照条件下培养几个星期至几个月后直接应用。 绿藻及其培养 筛选抗菌活性物质 藻类叶绿素的分离 为了分离藻类叶绿素我们将细胞放在置于亮度为110umol辐射量子的，有磁场震动的0.3%的CO2空气中，16:8的明暗交替循环中培养。在用玻璃球将细胞打破后，用Berzborn和Bishop的微调方法来准备叶绿体。 氧气交换氧气交换是通过一个3mL的氧气电极来测定的。为了完整细胞的氧气变化，将细胞生长介质加入到培养基中。为了光依赖型的氧气变化（希尔反应）和通过梅勒反应摄取分离藻类的叶绿素，我们增加了适当的电子供体和受体。结果:抑制绿藻的生物活性蓝细菌的筛选我们分离出了198种蓝细菌的菌株，大部分是从澳大利亚和印尼所采集的样品中分离出来的，当然也有一些事来自尼泊尔、泰国和越南。新菌株包括了巴斯德协会分类系统的五种典型蓝藻。(Rippka et al., 1979).包括两种新增的菌株在内，所有的菌株均通过细菌培养获得，并且通过了绿藻门的三个物种的筛选（这三种分别为尖细栅藻、小空星藻and Monoraphidium convolutum）。有二十中蓝细菌抑制绿藻的生长。十种是侧生藻属的物种，其中五种来源于印尼（瓜哇岛和龙目岛），一种来自越南，一种来自尼泊尔（加德满都），两种来自于澳大利亚首都直辖区，一种来自其北部地区。 七种是念珠藻属的物种，三种来自于印尼（龙目岛），三种来自于西澳洲，一种来自于新南威尔士洲。 同时也有三种从西澳洲和澳大利亚首都直辖区分离出的眉藻属物种。大部分分离出的具有生物活性的菌株是固着生长的，他们主要是从坚硬的土壤表面、建筑物墙体、排水管和海贝中分离出来的。通过蓝细菌清除绿藻被分离出的二十种生物活性蓝藻主要影响的藻类列在表2中，并附着筛选试验的结果。同时也显示了添加蛋白酶K对含高琼脂含量的藻类培养基的影响。通过蛋白酶阻碍清除表明一种缩氨酸是活化剂，虽然因为很多蓝细菌的缩氨酸是由不寻常的氨基酸构成而未能被证实。清除模式表明在自然和专一的蓝藻活性物质对藻类的影响上都有相当大的变异。例如：侧生藻JAVA 94/20和眉藻 WA 96/8 清除三种藻类不是通过影响蛋白酶的活动。侧生藻 NEP 95/1 在蛋白酶存在的情况下彻底的摧毁 Monoraphidium, 同时清除空星藻是在不受蛋白酶的影响活动产生的。它对栅藻的生长不产生影响。不管是否有蛋白酶存在，侧生藻LOM 95/17 只清除空星藻的物种。有趣的是，没有一种念珠藻属的物种能清除空星藻，然而空星藻却被所有的侧生藻和眉藻菌株所清除。然而，大部分念珠藻属的菌株却活跃的对抗另外两种藻类；在一种情况下（念珠藻WA 96/19 对抗栅藻)的清除只有在有蛋白酶的情况下才会出现。一般来说，值得注意的是清除活性与菌株的培养年龄和加入培养基中的材料的数量有关。 有些情况下在一个试验中观察到藻类清除的断言在接下来的试验中却不明显了，直到这些变量的改变。因此，有可能筛选结果是低估了生物活性菌株数量的代表。蓝细菌清除其他在自养和异样条件下的蓝细菌这二十种分离出来对绿藻有活跃抗性的菌株也进行了对其他蓝细菌成长的杀害和抑制性测试。从苏铁属植物Macrozamia communis L. Johnson 中分离出的A. doliolum ATCC 43530, 集胞藻属PCC 6803 和念珠藻属物种最初选择为指示菌株，因为他们能够在黑暗进行非自养生长。这样的有机体为我们演示了清除活动是否直接影响光合作用提供了可能。对A. doliolum影响的整套观察活动见表3.如绿藻，对不同菌株多种模式的清除被观察，其中一种情况（念珠藻属NSW 95/10在光合自养条件下地生长），只有在有蛋白酶的情况下有显著的活动。A. doliolum在光合自养生长期间被侧生藻属JAVA 94/20清除，但是在黑暗中异样生长却不被清除。令人惊讶的是我们也观察到，当镀成试验设置在黑暗中时，仅仅在开灯以后清除影响就开始启动。这表明这种生物产生的生物活性物直接影响光合作用机制的一些部分，尽管一种可选择的解释是侧生藻在阳光下产生更多的生物活性物。侧生藻 NEP 95/1 在有光和黑暗条件下都活跃对抗项圈藻，而在蛋白酶的影响下却消失了，这表明某种缩氨酸是活化剂且它不指导对抗光合作用的生物化学过程。另外侧生藻 sp. JAVA 94/20, NEP 95/1, LOM 95/17 and 眉藻 WA 96/8 也进行了对来自在光和自养条件下生长的普通大泽米属的集胞藻 PCC 6803和念珠藻的对抗测试。 与之相反，眉藻仅仅只清除A. doliolum. 最后，对这二十中生物活性菌株也进行了杀害有毒蓝细菌能力的测试。铜绿微囊藻、卷曲鱼腥藻和泡沫节球藻。如表4所见，14中被分离出的蓝细菌能杀死其中一种或多种菌株，有些具有巨大的潜力。抑制含氧的光和作用为了证实光依赖型清除能光合自养生长的A. doliolum ，（表3）就抑制光合作用电子传递进行了解释，藻类叶绿素的氧气交换测量值的测定通过对侧生藻物种JAVA 94/20的可溶解行细胞提取物来测定。分离的叶绿素被应用是因为观察到对完整细胞氧气变化的测量没有影响，可能是由于很短时间的这种实验相对于完整细胞内活性物质扩散时间对电子传递位置的抑制。通过甲醇（30mL）提取冻干细胞（0.5g）30分钟，提取两次。将提取液进行离心后将上层清液蒸干。将残渣再溶解与1.5mL的甲醇后能整除的部分用于实验，干燥后在溶解于50uL的乙醇。细胞提取液等同来源于23mg的冻干粉末。在培养十分钟后测定比率。在对照实验中，Mehler 和Hill 反应速率分别为 76 和 32 umol h1 (mg chloroplast)1. 提取液的数据表明分别被抑制了75%和68% 。相比之下，光下和黑暗下生长的具有抑制性的侧生藻NEP 95/1 的光和作用活性没有影响。通过蛋白酶抑制清除flores和wlok提出有些蓝细菌菌株，例如Nostoc sp.ATCC29132,通过产生一种隐藏的蛋白质来抑制抗菌素的活性来保护他们自己和其他物种。在本实验中可以明显看出在蛋白酶K的存在下，同样的念球藻清除眉藻WA96/8，在没有蛋白酶K的条件未进行测定。和上述提到的一样（念珠藻属WA96/19抑制栅列藻属，念珠藻NSW95/10抑制在自养生长条件下的A.doliolum），这样的现象在我们分离的两种念珠藻属中也可以看到。讨论蓝细菌能产生广泛的生物活性物质，其中包括藻类对抗物。在目前的工作中，有198种新分离出的蓝细菌被测试（表1），二十种能产生能抑制绿藻生长的生物活性物质（表2）。分离出的生物活性菌株的比例（约为10%）与更早出版的其它种类的筛选进行了比较（11%，Flores and Wolk , 1986; 7%, Patterson et al., 1993)因为诸葛工作最初的目的是测试哪种蓝细菌能杀害绿藻，所以我们没有对所有的蓝细菌做抵抗测试 ；Flores 和 Wolk在1986年已经通过一系列的生产和目标有机体的研究对这样的筛选性实验进行了报道。可以预计在这198种分离的菌株中会有更多对蓝细菌长生活跃抵抗的菌株。由于这些分离的菌株是为了表明清除绿藻而做了抵抗蓝细菌的测试，所以关于生产性菌株对蓝细菌的清除频度是无可奉告的，除此之外Flores and Wolk在1986年发现的11%的价值可能更接近。 做生物活性菌抵抗蓝细菌测试的部分原因是为了找到有活性，能杀害有毒蓝细菌的菌株。有毒蓝细菌对世界上很多地方的公共安全具有相当大的威胁 (Carmichael, 1992, 1997; Falconer,1998), 这三项研究在澳大利亚形成了相当严重的问题，详见(Blackburn etal., 1997)。据Bagchi 等 1993研究：一种颤藻能产生对铜绿微囊藻抗菌活性抵抗的物质。一些大型植物也作为这样的生物活性合成的资源被报道(Nakai等，1996). 由表4可见，侧生藻、可能也有念珠藻的一些物种似乎能产生具有控制有毒有机体的生物活性物质的潜能。值得注意的是，具有抵抗绿藻的生物活性物只在侧生藻、念珠藻和眉藻中被发现。从其它物种中找到杀藻活性生物的机会看起来更低，尤其是在LPP 有机体中, 它的65种已经被测试。专一性清除这三种绿藻也是有趣的。6种侧生藻物种可以清除所有的这三种藻类，只有两个眉藻的物种能做到。其它几种侧生藻的物种要么清除一种，要么清除两种。7种念珠藻物种中没有一种能同时清除三种绿藻的，它们中的6种能清除两种绿藻，另外的只能清除一种。念珠藻物种根本就不能抑制空星藻的生长；也不能抑制A. doliolum ，除了两种情况，其中一种是在蛋白酶处理以后。这种专一性可能有不同的解释，例如有可能是取决于测试生物对活性物质的渗透性不同。同时也必须考虑到 一种有机体可能产生不止一种的生物活性物质来针对不同的生物化学过程。侧生藻NEP 95/1也许能作为这种说法的一个例子；它清除空星藻是通过产生一种不受蛋白酶影响的物质而清除Monoraphidium 却刚好相反。结果本分提到:不断的实验观察发现有一些变化，但是很清楚地是一种分离的生物活性菌株并没有在所有时候展示其清除作用。抗菌素的生产广泛是众所周知的，生物活性的表达取决于生理因素，比如生长阶段，对于一种给定的有机体，这样的因素应该被系统的评估。物理性的培养条件似乎也产生重要的影响。Chetsumon 等 (1994)指出：例如与非最适光照条件下相比在最适的光照条件下抗菌素的产量增加到两倍。对蓝细菌提纯的工作标准是：被分离的菌株是单一物种、能不受由于放线菌酮处理而引起的真核污染物的影响和显微镜观察。没有详细的计划要获得纯培养物，尽管所有的都认真地清洗和选择了三次，观察到的细菌污染在所有情况下都是很低的。所有分离的生物活性菌株都是能固氮的且能在没有有机C源和N源存在的条件下生长；没有一个伴随固着N源生长的是有生物活性的。因此生物活性不大可能是由于污染的细菌引起的。Keating 在1978年也报道了说细菌的出现并不会从性质上影响筛选性实验的结果。 蛋白水解酶的测试结果的解读必须要非常小心。一种蛋白酶的抑制活动可能预示活化剂是缩氨酸。然而，蓝细菌的许多生物活性缩氨酸具有与众不同的氨基酸并且可能对蛋白水解酶的钝化不敏感。另一种可能是抗菌素使筛选的有机体对蛋白水解酶更加敏感。这方便我们快速有效的获得下列推论的证据：生物活性物是否抵抗藻类和蓝细菌？哪些是光合作用微生物？是否指导对抗光依赖型生物化学过程？为了这些目的我们寻找指示菌株：它们要么在光下自养生长，要么在黑暗中异样生长；在这方面我们发现A. doliolum是非常有用的。只有两种生产性菌株(侧生藻 JAVA 94/20 and 念珠藻 NSW 95/10)明确的抑制A. dol