DNA提取方法和步骤.ppt

1 植物DNA的提取与纯化DNAextraction 实验一 2 实验原理 植物DNA的分离是分子生物学 遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求 对DNA提取一般有三个要求 1 DNA的纯度可以满足下游操作的要求 2 DNA必须完整 3 DNA应当有足够的量 构建基因组文库 初始DNA长度必须在100kb以上 否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少 RFLP和PCR分析 DNA长度可短至50kb 在该长度以上 可保证酶切后产生RFLP片段 20kb以下 并可保证包含PCR所扩增的片段 一般2kb以下 如果对植物进行大规模筛选 操作程序应当快捷 简便 价格低廉 并尽可能避免使用有毒试剂 3 核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶 DNA则为白色类似石棉样的纤维状物 除肌苷酸 鸟苷酸具有鲜味外 核酸和核苷酸大都呈酸味 DNA RNA和核苷酸都是极性化合物 一般都溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有机溶剂 它们的钠盐比游离酸易溶于水 RNA钠盐在水中溶解度可达40g L DNA在水中为10g L 呈黏性胶体溶液 在酸性溶液中 DNA RNA易水解 在中性或弱碱性溶液中较稳定 天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白 DNP 形式存在于细胞核中 要从细胞中提取DNA时 先把DNP抽提出来 再把蛋白质和糖去除 同时除去RNA及无机离子等 从中分离DNA 4 核酸的提取方法提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法 对它们进行稍加修改就可以应用于DNA的微量提取 两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解 具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨 从而破碎细胞 细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜 使蛋白质变性而沉淀下来 EDTA抑制DNA酶的活性 再用酚 氯仿抽提的方法去除蛋白 得到的DNA溶液经乙醇沉淀 5 实验材料和试剂 实验材料 新鲜植物组织 100mmol LTris HCl pH8 0 50mmol LEDTA500mmol LNaCl1 5 SDS DNA提取缓冲液 实验所需试剂 24 1 氯仿 戊醇其它试剂 液氮 TE缓冲液 无水乙醇 70 乙醇 2 CTABbuffer100mMTrispH8 01 4MNaCl20mMEDTApH8 02 CTAB0 2 巯基乙醇酚 氯仿 1 1 氯仿 50ml无水乙醇 6 实验仪器 7 实验步骤 取新鲜叶片约3g 剪碎 加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中 2 在65 预热的提取液中按3 8g L加入NaBisufite 混匀并调pH至8 0 3 在管中加入适量提取液 60 水浴保温约30min 不时颠倒混匀 4 冷却至室温后加入等体积氯仿 异戊醇 用力摇匀后 放置摇床上摇动15min左右 5 室温下10000rpm离心15min 小心吸上清于新的离心管中 加入两倍体积的冷酒精 20 放置1h或过夜 6 挑出DNA置于新的管中 挑出有困难时可以低速离心后倒去上清 加入适量70 酒精 摇动洗涤10min 重复洗涤2 3次 7 吹干DNA 加入适量TE在65 溶解 完全溶解后离心去除杂质 加入RNase 10mg mL 室温处理0 5 1h 除去RNA 4 或 20 贮存 如需纯化DNA 再加入适量TE 氯仿 异戊醇多次抽提后吸取上清 加入3ml LNaAc和两倍体积的乙醇 20 放置1h或过夜 吹干沉淀后 加入适量TE 65 溶解 4 或 20 贮存 8 1 植物叶子约3g 剪碎置预冷研钵中 加入液氮充分研磨 注意不能干磨 混合球磨仪 9 3 60 水浴保温30 60min 10 加入等体积氯仿 用力摇匀 11 6 再次10000rpm离心5min 将上清小心吸入新的离心管中 12 DNA样品在1 Agarose胶上电泳 例图 13 实验注意事项 微量移液枪的使用一定要规范 吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪