NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及机制研究

NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及机制研究中南大学湘雅三医院黄东教授 目前 全球癌症患者的数量呈 骨癌痛的具体机制 癌性疼痛成为影响癌症病人生活质量的一个严重问题 在癌痛中又以骨癌痛最为严重和最难以控制 研究背景 癌痛的特点 临床上 癌痛表现为进行性加重 常伴随有爆发痛 癌痛与炎性痛和神经病理性痛存在着不同的外周和中枢机制 1 如癌痛 胶质细胞增生肥大 GFAP 1 HonoreP Neuroscience 2000 98 585 598 NMDA受体活化是反复伤害性刺激诱发中枢敏化的基础 是持续性疼痛产生和维持的关键 2 大量研究证实 NMDA受体的亚基NR2B在炎性痛 神经病理痛中参与了伤害性信息传递 在疼痛调制及痛觉敏化的形成和维持中发挥重要作用 3 疼痛研究进展 2 Petrenko AnesthAnalg 2003 97 4 1108 1116 3 NagyGG EurJNeurosci 2004 20 12 3301 3312 一 研究显示 MAPK信号通路在神经可塑性和炎症反应的细胞信号转导过程中起重要作用 4 增生肥大的星形胶质细胞能释放大量胶质纤维酸性蛋白 GFAP 骨癌痛的产生和维持与脊髓星形胶质细胞结构和功能的变化密切相关 1 4 DeLeoJA Pain 2006 122 122 17221 疼痛研究进展 二 研究癌痛的确切机制 需要适当的动物模型 现有动物模型仍显不足 小鼠骨癌痛模型的优势 肺癌是临床骨转移较多见的一种肿瘤 且小鼠在肿瘤学及神经系统研究方面具有独特的优势 小鼠作为实验模型 较经济适用 本实验参照Schwei等的方法 将Lewis肺癌细胞接种于C57BL 6小鼠股骨骨髓腔 建立一个全新的骨癌痛模型 我们从如下四个方面加以研究 1 建立一个小鼠骨癌痛新模型2 NR2B在骨癌痛小鼠前扣带回和脊髓中的分布与表达3 脊髓NR2B基因沉默对小鼠骨癌痛的影响4 MAPK信号通路介导的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用机制 NR2B是否也参与骨癌痛的发生机制呢 实施方案 检测癌痛小鼠脊髓和前扣带回NR2B的表达和分布 分析小鼠NR2B的表达和小鼠疼痛行为学关系 应用RNA干扰技术 沉默骨癌痛小鼠NR2B基因 通过对比干扰组小鼠与癌痛组小鼠NR2B的表达以及两组小鼠疼痛行为学 从而阐明NR2B是否在癌痛的发生与维持中起重要作用 对比骨癌痛小鼠NR2B基因沉默前后 MAPK信号通路及其介导的下游信号分子表达的相应改变 研究MAPK信号通路中信号分子表达的相应改变与GFAP的关联性 探索MAPK信号通路在小鼠骨癌痛中的可能作用机制 NR2B是怎样参与骨癌痛的发生机制呢 选用清洁级雄性C57BL 6小鼠 模型组 一般情况观察 行为学测定 内容1技术路线 热灭活组 PBS组 正常对照组 放射学检查 组织学检测 自发痛行为观察 机械性触诱发痛 选用清洁级雄性C57BL 6小鼠 癌痛组 一般情况观察 行为学测定 内容2技术路线 假手术组 正常对照组 实时定量PCR检测NR2B的表达 免疫组化检测NR2B的表达及分布 自发痛行为观察 机械性触诱发痛 WesternBlot检测NR2B的表达 选用清洁级雄性C57BL 6小鼠 癌痛组 一般情况观察 行为学测定 内容3技术路线 干扰组 干扰对照组 实时定量PCR检测NR2B的表达 自发痛行为观察 机械性触诱发痛 WesternBlot检测NR2B的表达 选用清洁级雄性C57BL 6小鼠 正常组 一般情况观察 行为学测定 内容4技术路线 干扰组 干扰对照组 实时定量PCR检测NR2B SP c fos和GFAP基因的表达 自发痛行为观察 机械性触诱发痛 WesternBlot检测NR2B p ERK p p38和GFAP的表达 癌痛组 结果 体重和一般状况 图1 观察期内各组小鼠体重的变化 2 行为学测试 图2 自发痛行为观察图3 机械性触诱发痛测定 3 放射学检测 图4 模型组小鼠不同时间段术侧股骨X片结果 A为肿瘤细胞接种前摄片 B为接种后第7天 C为接种后第15天 D为接种后第23天 组织学观察 骨髓腔破坏 肿瘤细胞穿破骨组织 A 接种第7天模型组小鼠股骨切片B 接种第15天模型组小鼠股骨切片 C 1接种第23天模型组小鼠股骨切片 C2 接种第23天模型组小鼠股骨周围肌肉组织病检结果 图6 模型组小鼠术侧股骨下段不同时间段的HE染色 HE 400 行为学 放射学 组织学三方面证实 C57BL 6小鼠股骨骨髓腔接种Lewis肺癌细胞 能成功制备小鼠骨癌痛模型 且此模型稳定 重复性好 与人类骨癌痛高度相似 本研究我们首次选用来源广泛 致瘤作用强的Lewis肺癌细胞 接种于C57BL 6小鼠股骨骨髓腔 建立了一个新的小鼠骨癌痛模型 5 实时荧光定量PCR检测前扣带回和脊髓NR2B的表达 前扣带回NR2B的表达 前脑扣带回NR2BmRNA相对表达量 脊髓NR2B的表达 图5 脊髓NR2BmRNA相对表达量 第14天前扣带回NR2B的表达A癌痛组前扣带回100倍 B癌痛组前扣带回区域200倍C正常组前扣带回100倍 D正常组前扣带回区域200倍E假手术组前扣带回100倍 F假手术组前扣带回区域200倍 6 免疫组化检测前扣带回和脊髓NR2B的表达 前脑扣带回NR2B的表达 L4 L6脊髓NR2B的表达 L4 L6脊髓NR2B的表达 200倍 术后第14天 L4 L6脊髓NR2B的表达 术后第18天 L4 L6脊髓NR2B的表达 癌痛组 假手术组 正常组 癌痛组 假手术组 正常组 L4 L6脊髓NR2B的分布 癌痛组正常组假手术组 L4 L6脊髓NR2B的分布 接种后14天 脊髓各层NR2B表达量在中央导水管 背角浅层 前角依次增多 7 WesternBlot检测L4 6段脊髓NR2B的表达 术后第14天各组小鼠脊髓NR2B术后第18天各组小鼠脊髓NR2B的表达 A 癌痛组B 假手术组C 正常组的表达 A 癌痛组B 假手术组C 正常组 1 癌痛组小鼠脊髓和前扣带回中NR2B表达均明显增加 脊髓各层表达量由大到小依次为前角 背角浅层 中央导水管周围 且癌痛组NR2B表达上调的同时 疼痛行为学也有相应的改变 初步表明脊髓和前扣带回中的NR2B表达增加与小鼠骨癌痛产生和维持存在一定相关性 2 同一癌痛模型中观察到NR2B在脊髓和前扣带回同时高表达 提示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢 而且有脑部中枢的参与 3 本研究初次发现NR2B在脊髓前角细胞表达呈强阳性 为下一步研究提供了新的思路 图3 癌痛组 干扰组和干扰对照组小鼠脊髓NR2BmRNA的相对表达量 8 实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓L4 6节段NR2B的表达 9 WesternBlot检测小鼠脊髓L4 6节段NR2B的表达 WesternBlot检测接种术后第14天小鼠脊髓L4 6节段NR2B的表达A 干扰组 B 干扰对照组 C 癌痛组 NR2BGAPDH ABC WesternBlot检测接种术后第18天小鼠脊髓L4 6节段NR2B的表达A 干扰组 B 干扰对照组 C 癌痛组 NR2BGAPDH 1 PEI NR2B siRNA复合物鞘内注射后能使骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表达下调 2 骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表达下调与小鼠疼痛行为学减轻相一致 进一步证明NR2B在癌痛发生过程中起重要作用 可能是癌痛治疗的有效靶点 10 实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓NR2B SP c fos和GFAP基因的表达 接种术后第14天 实时荧光定量PCR检测各组小鼠脊髓NR2B SP GFAP c fos的相对表达量注 图示中NR2B组放大100倍 c fos放大10倍 11 实时荧光定量PCR检测小鼠脊髓NR2B SP c fos和GFAP基因的表达 接种术后第18天 实时荧光定量PCR检测各组小鼠脊髓NR2B SP GFAP c fos的相对表达量注 图示中NR2B和c fos组均放大100倍 图5 WesternBlot检测接种术后第18天小鼠脊髓NR2B的表达A 正常组 B 癌痛组 C 干扰组 D 干扰对照组 图6 WesternBlot检测接种术后第14天小鼠脊髓p ERK的表达A 正常组 B 癌痛组 C 干扰组 D 干扰对照组 3 1接种术后第14天 检测NR2B和p ERK蛋白表达 NR2B GAPDH p ERKGAPDH 12 WesternBlot检测接种术后第14天小鼠脊髓的NR2B p ERK p p38和GFAP蛋白表达 WesternBlot检测接种术后第14天小鼠脊髓p p38的表达A 正常组 B 癌痛组 C 干扰组 D 干扰对照组 WesternBlot检测接种术后第14天小鼠脊髓GFAP的表达A 正常组 B 癌痛组 C 干扰组 D 干扰对照组 13 接种术后第14天 检测p p38和GFAP蛋白表达 GAPDH GFAP GAPDH WesternBlot检测接种术后第18天小鼠脊髓NR2B的表达A 正常组 B 癌痛组 C 干扰组 D 干扰对照组 WesternBlot检测接种术后第18天小鼠脊髓p ERK的表达A 正常组 B 癌痛组 C 干扰组 D 干扰对照组 接种术后第18天 检测NR2B和p ERK蛋白表达 14 WesternBlot检测接种术后第18天小鼠脊髓的NR2B p ERK p p38和GFAP蛋白表达 NR2BGAPDH p ERK GAPDH WesternBlot检测接种术后第18天小鼠脊髓p p38的表达A 正常组 B 癌痛组 C 干扰组 D 干扰对照组 WesternBlot检测接种术后第18天小鼠脊髓GFAP的表达A 正常组 B 癌痛组 C 干扰组 D 干扰对照组 接种术后第18天 检测p p38和GFAP蛋白表达 p p38 GAPDH GFAP GAPDH 1 癌痛小鼠的MAPK通路中相应信号分子p ERK p p38 c fos表达明显上调 而NR2B的沉默可以下调MAPK通路中相应信号分子p ERK p p38 c fos表达 2 GFAP在癌痛小鼠中高表达 同时NR2B的调控可以影响GFAP的表达 解除Mg2 对NMDA受体离子通道的阻断作用 结合到突触后膜上配体门控离子型谷氨酸受体 AMPA受体 Na 内流 NMDA受体激活 Ca2 内流增加 激活ERK p38 c fos转录因子激活 NR2B表达 伤害性信号传入脊髓背角 释放大量谷氨酸 SP表达 神经元下游相关基因表达变化 神经胶质细胞GFAP表达 结合到胶质细胞上AMPA受体 激活ERK p38 直接导致胶质细胞内的GFAP大量表达 导致癌痛 我们推测癌痛产生的可能机制 因此 结论 1 C57BL 6小鼠股骨骨髓腔接种Lewis肺癌细胞能成功制备小鼠骨癌痛新模型 此模型与人类骨癌痛具有相似性 2 NR2B在小鼠骨癌痛模型中呈高表达 且同一癌痛模型中观察到NR2B在L4 L6段脊髓和前扣带回同时高表达 提示在癌痛的产生和维持中不仅激活了脊髓低位中枢 而且有脑部中枢参与 3 本