中药复方化学研究思路与实践.pdf

中药复方化学研究思路与实践中药复方化学研究思路与实践 刘斌刘斌 北京中医药大学中药学院北京中医药大学中药学院 2007 072007 07 WWW BLPA COM CN 中药复方中药复方 中医治病的主要临床应用形式 中医辩证论治理论的具体体现 遵循 中医治病的主要临床应用形式 中医辩证论治理论的具体体现 遵循 君臣佐使君臣佐使 的组方原则 体现 的组方原则 体现 理法方药理法方药 的治疗特色 涵盖了药味配伍的精妙 囊括了剂量组合的玄机 的治疗特色 涵盖了药味配伍的精妙 囊括了剂量组合的玄机 WWW BLPA COM CN 中药复方研究中药复方研究 中药现代化研究的一项重要内容中药现代化研究的一项重要内容 中药复方药效药理研究 较多 中药复方质量控制方法研究 较多 中药复方药效物质基础研究 中药复方化学研究 较少 中药复方药效药理研究 较多 中药复方质量控制方法研究 较多 中药复方药效物质基础研究 中药复方化学研究 较少 WWW BLPA COM CN 复方中的化学成分是中药发挥药效作 用的物质基础 复方中的化学成分是中药发挥药效作 用的物质基础 进行中药复方化学研究 在阐明中医 的方药理论 揭示中药的配伍规律和作用 机制 优化制剂工艺 制定质量控制标 准 实现中药现代化并走向国际市场等方 面均具有重要意义 进行中药复方化学研究 在阐明中医 的方药理论 揭示中药的配伍规律和作用 机制 优化制剂工艺 制定质量控制标 准 实现中药现代化并走向国际市场等方 面均具有重要意义 加强中药复方化学研究 并以此为基 础 进行创新药物的开发研制 是摆在我 们面前的一项重要而紧迫的任务 加强中药复方化学研究 并以此为基 础 进行创新药物的开发研制 是摆在我 们面前的一项重要而紧迫的任务 WWW BLPA COM CN 内容提要内容提要 中药复方化学中药复方化学 研究目的研究目的 研究现状研究现状 研究思路研究思路 研究实践研究实践 研究成果研究成果 结束语结束语 1 2 3 4 5 6 WWW BLPA COM CN 化学和药理学化学和药理学 有效部位和有效成分 药效物质基础 有效部位和有效成分 药效物质基础 药理活性 作用机理 构效关系 药理活性 作用机理 构效关系 配伍规律 处方 配伍规律 处方优化优化 制剂工艺 质量标准 制剂工艺 质量标准 开发研制创新药物开发研制创新药物 促进和实现中药现代化促进和实现中药现代化 一 中药复方化学研究目的一 中药复方化学研究目的 WWW BLPA COM CN 1 复方主要指标性成分定性定量 2 复方化学成分提取 分离和鉴定 3 复方有效部位和有效成分筛选 二 中药复方化学研究现状二 中药复方化学研究现状 WWW BLPA COM CN 1 复方主要指标性成分定性定量 单味药研究概况单味药研究概况 主要有效成分或指标性成分主要有效成分或指标性成分 定性定量指标定性定量指标 分离分析技术分离分析技术拆方分析方法拆方分析方法 配伍规律配伍规律 制备工艺制备工艺 质量标准质量标准 主要有效成分 或指标性成分 质和量的变化 主要有效成分 或指标性成分 质和量的变化 WWW BLPA COM CN 单煎 分煎 合煎单煎 分煎 合煎 四 物 汤 四 物 汤 小 青 龙 汤 小 青 龙 汤 阿 魏 酸 阿 魏 酸 麻 黄 碱 麻 黄 碱 合煎液含量合煎液含量最高最高 合煎液含量合煎液含量最低最低 甘草酸与 麻黄碱产 生沉淀 甘草酸与 麻黄碱产 生沉淀 WWW BLPA COM CN 泻心汤类方泻心汤类方 复方中同时含有大黄或甘草时 煎 液中小檗碱的强烈苦味消失 不含 大黄或甘草的煎液仍有强烈的苦味 复方中同时含有大黄或甘草时 煎 液中小檗碱的强烈苦味消失 不含 大黄或甘草的煎液仍有强烈的苦味 小檗碱与大黄鞣质 甘草酸结合 生成了难溶性沉淀物 小檗碱与大黄鞣质 甘草酸结合 生成了难溶性沉淀物 甘草酸与小檗碱产生沉淀导致黄连 抑菌活性降低以至丧失 甘草酸与小檗碱产生沉淀导致黄连 抑菌活性降低以至丧失 原因原因 WWW BLPA COM CN 四逆汤四逆汤 附子附子 干姜 甘草 干姜 甘草 乌头碱乌头碱 含量含量升高升高 含量含量降低降低 WWW BLPA COM CN 生脉散生脉散 比较比较合煎液分煎液 人参总皂苷 人参皂苷Rg3 人参皂苷Rh1 血流动力学 对心肌作用 临床疗效 合煎液分煎液 人参总皂苷 人参皂苷Rg3 人参皂苷Rh1 血流动力学 对心肌作用 临床疗效 低低高 高 高 高低低 高高低 低 在煎煮过程 中发生了人 参皂苷的水 解转化 原 来在单味药 中属微量成 分的Rg3和 Rh1在复方中 成为主要成 分 在煎煮过程 中发生了人 参皂苷的水 解转化 原 来在单味药 中属微量成 分的Rg3和 Rh1在复方中 成为主要成 分 WWW BLPA COM CN 枳术丸枳术丸 采用GC MS法测定了制备过程中苍术酮 苍术内 酯 羟基苍术内酯和脱水羟基苍术内酯等4种有 效成分的含量动态变化 采用GC MS法测定了制备过程中苍术酮 苍术内 酯 羟基苍术内酯和脱水羟基苍术内酯等4种有 效成分的含量动态变化 结果发现在炮制时白术中的苍术酮可氧化生成苍 术内酯和羟基苍术内酯 而在与枳实组方时苍术 内酯和羟基苍术内酯又可还原成苍术酮 结果发现在炮制时白术中的苍术酮可氧化生成苍 术内酯和羟基苍术内酯 而在与枳实组方时苍术 内酯和羟基苍术内酯又可还原成苍术酮 说明组方和制剂工艺可以对复方中的有效成分产 生质和量的双重影响 使之成为不同于单味药的 新体系 产生特定的治疗作用 说明组方和制剂工艺可以对复方中的有效成分产 生质和量的双重影响 使之成为不同于单味药的 新体系 产生特定的治疗作用 WWW BLPA COM CN 白头翁汤白头翁汤 白头翁 黄连 黄柏 秦皮白头翁 黄连 黄柏 秦皮 汤剂中小檗碱 七叶树碱 七叶树内 酯含量较单味药降低 汤剂中小檗碱 七叶树碱 七叶树内 酯含量较单味药降低 黄连与方中各味药配伍煎煮 均会产 生含小檗碱的沉淀 黄连与方中各味药配伍煎煮 均会产 生含小檗碱的沉淀 WWW BLPA COM CN 2 复方化学成分提取 分离和鉴定 中药复方 整体 中药复方 整体 植物化学植物化学 色谱技术 化学方法 色谱技术 化学方法 提取分离提取分离 检识鉴定检识鉴定 复方化学成分复方化学成分 该方法有助于了解中药复方的化学物质基础 通 过与单味药成分的比较 也有可能发现复方配伍 后产生的新化合物等 该方法有助于了解中药复方的化学物质基础 通 过与单味药成分的比较 也有可能发现复方配伍 后产生的新化合物等 WWW BLPA COM CN 四君子汤苍术醚 苍术内酯 四君子汤苍术醚 苍术内酯 羟基苍术内酯 脱水羟基苍术内酯羟基苍术内酯 脱水羟基苍术内酯 芍药甘草汤苯甲酸 甘草苷 芍药苷 甘草酸芍药甘草汤苯甲酸 甘草苷 芍药苷 甘草酸 芒柄花素 异甘草苷元 甘草苷芒柄花素 异甘草苷元 甘草苷 元 4元 4 7 二羟基黄酮 芒柄花 7 二羟基黄酮 芒柄花 苷 没食子酸 异甘草苷苷 没食子酸 异甘草苷 白头翁汤巴马汀 小檗碱 药根碱 七叶内酯 白头翁汤巴马汀 小檗碱 药根碱 七叶内酯 秦皮苷 七叶苷 白头翁皂苷A3 秦皮苷 七叶苷 白头翁皂苷A3 白头翁皂苷B 白头翁皂苷B4 白头翁皂苷B 白头翁皂苷B4 黄柏内酯 liriodendrin黄柏内酯 liriodendrin 上述成分与单味药化学成分基本一致 上述成分与单味药化学成分基本一致 示例 WWW BLPA COM CN 生脉散生脉散 人参 麦冬 五味子人参 麦冬 五味子 水煎剂中发现并分离鉴定了 在煎煮过程中产生的 水煎剂中发现并分离鉴定了 在煎煮过程中产生的新成分新成分5 羟甲基 2 糠醛 5 羟甲基 2 糠醛 并探讨了复方 化学成分动态变化与药效之间 的关系 并探讨了复方 化学成分动态变化与药效之间 的关系 WWW BLPA COM CN 3 复方有效部位和有效成分筛选 活性筛选与化学分离紧密结 合 以药效为指标 追踪分离 复方有效部位与有效成分 活性筛选与化学分离紧密结 合 以药效为指标 追踪分离 复方有效部位与有效成分 WWW BLPA COM CN 根据临床疗 效建立与某 一病症相对 应的药理模 型 根据临床疗 效建立与某 一病症相对 应的药理模 型 确定一种 或多种药 效作用的 观测与评 价指标 确定一种 或多种药 效作用的 观测与评 价指标 对复方及 其各种提 取分离部 位进行活 性追踪 分析其质和量的变化与药 效的关系 在一定程度上 阐明复方组方的配伍规则 及疗效机制 对复方及 其各种提 取分离部 位进行活 性追踪 分析其质和量的变化与药 效的关系 在一定程度上 阐明复方组方的配伍规则 及疗效机制 确定复方 产生某种 药理作用 的有效部 位或有效 成分 确定复方 产生某种 药理作用 的有效部 位或有效 成分 此项工作难度大 涉及面广此项工作难度大 涉及面广 目前尚处于起步和探索阶段目前尚处于起步和探索阶段 WWW BLPA COM CN 示例示例 排脓散排脓散 提取分离和活性追踪结果显示排脓散对角叉菜 胶所致水肿形成的抑制作用 系枳实中的柑桔 苷 新橙皮苷和芍药中的芍药苷等协同作用的 结果 提取分离和活性追踪结果显示排脓散对角叉菜 胶所致水肿形成的抑制作用 系枳实中的柑桔 苷 新橙皮苷和芍药中的芍药苷等协同作用的 结果 二妙散二妙散 以2 4 6 三硝基氯苯所致小鼠迟发性变态反应 为指标 筛选确定其免疫抑制作用的有效部位 是总生物碱类 以2 4 6 三硝基氯苯所致小鼠迟发性变态反应 为指标 筛选确定其免疫抑制作用的有效部位 是总生物碱类 WWW BLPA COM CN 六味地黄汤六味地黄汤 动物模型 评价指标 动物模型 评价指标 六味地黄汤六味地黄汤 抗体生成反应抗体生成反应 环磷酰胺 处理小鼠 环磷酰胺 处理小鼠 免疫调节活性成分免疫调节活性成分 酸性多糖酸性多糖 相对分子量在相对分子量在 5000 40000 之间之间 WWW BLPA COM CN 示例示例 十全大补汤十全大补汤 追踪分离得到具有促进细胞增殖反应 的酸性多糖 追踪分离得到具有促进细胞增殖反应 的酸性多糖 小柴胡汤小柴胡汤 分离获得具有增强NK细胞活性的酸性 多糖 分子量1 2 105 其组成单糖 摩尔比为鼠李糖 阿拉伯糖 甘露糖 半乳糖 葡萄糖 半乳糖醛酸 1 17 3 21 100 87 分离获得具有增强NK细胞活性的酸性 多糖 分子量1 2 105 其组成单糖 摩尔比为鼠李糖 阿拉伯糖 甘露糖 半乳糖 葡萄糖 半乳糖醛酸 1 17 3 21 100 87 WWW BLPA COM CN 中药复方化学研究现状中药复方化学研究现状 以复方中某个或某些药味的有 效成分或指标性成分为指标的 定性与定量分析研究 以复方中某个或某些药味的有 效成分或指标性成分为指标的 定性与定量分析研究 将中药复方作为一个整体 以药 效为指标 对全方进行系统分 离 探讨复方产生某种药理活性 的物质基础的研究 将中药复方作为一个整体 以药 效为指标 对全方进行系统分 离 探讨复方产生某种药理活性 的物质基础的研究 多多 少少 WWW BLPA COM CN 三 中药复方化学研究思路 关于中药复方化学研究 无论在研究思 路上还是在研究技术与方法上 仍处于 探索阶段 关于中药复方化学研究 无论在研究思 路上还是在研究技术与方法上 仍处于 探索阶段 WWW BLPA COM CN 研究思路 一 研究思路 一 首先 首先 视中药复方为一有机整体 视中药复方为一有机整体 第二 第二 药理学或生物活性指标与临床主要治 疗作用吻合 药理学或生物活性指标与临床主要治 疗作用吻合 第三 第三 物质分离与活性筛选同步进行 采用 多种活性筛选指标进行评估 确定目标活性 成分 物质分离与活性筛选同步进行 采用 多种活性筛选指标进行评估 确定目标活性 成分 第四 第四 探讨活性成分在复方及其组成的单味 药中的分布和含量 阐明各单味中药对复方 的贡献大小 探讨活性成分在复方及其组成的单味 药中的分布和含量 阐明各单味中药对复方 的贡献大小 第五 第五 在等剂量条件下进行目标活性成分 单味中药以及复方的药效学对比 探讨复方 配伍规律和优化配方 在等剂量条件下进行目标活性成分 单味中药以及复方的药效学对比 探讨复方 配伍规律和优化配方 WWW BLPA COM CN 选择目标处方选择目标处方 核定标准处方并确认标准汤剂的药效核定标准处方并确认标准汤剂的药效 建立多指标活性筛选体系对目标成分进行系统评估建立多指标活性筛选体系对目标成分进行系统评估 追踪分离目标活性成分并确定其化学结构追踪分离目标活性成分并确定其化学结构 探讨复方药效物质基础及其作用机理探讨复方药效物质基础及其作用机理 阐明复方配伍规律阐明复方配伍规律 基 本 程 序 基 本 程 序 WWW BLPA COM CN 研究思路 二 研究思路 二 中药复方化学研究应严格按照中药传统 用药方式 重点对其水煎剂进行全面系 统研究 中药复方化学研究应严格按照中药传统 用药方式 重点对其水煎剂进行全面系 统研究 WWW BLPA COM CN 复 方 水 煎 剂 复 方 水 煎 剂 有 效 部 位 有 效 成 分 有 效 部 位 有 效 成 分 HPLC 指纹图谱 定性分析 指纹图谱 定性分析 定量分析定量分析 根据有效成分在复方 单味药中的含量进行 配比 在动物模型上 进行实验 并和复方 药理实验结果比较 确定该有效成分是否 全面反映复方的药效 根据有效成分在复方 单味药中的含量进行 配比 在动物模型上 进行实验 并和复方 药理实验结果比较 确定该有效成分是否 全面反映复方的药效 由于复方有效成分的多靶性 用单一 动物模型不能完全反映复方疗效 应 采用多个动物模型进行跟踪筛选 以 保证最大限度地反映复方的全面疗 效 分离鉴定出复方应用过程中全部 的有效成分 由于复方有效成分的多靶性 用单一 动物模型不能完全反映复方疗效 应 采用多个动物模型进行跟踪筛选 以 保证最大限度地反映复方的全面疗 效 分离鉴定出复方应用过程中全部 的有效成分 运用能确切反映 该复方疗效的动 物模型 进行活 性跟踪和筛选 运用能确切反映 该复方疗效的动 物模型 进行活 性跟踪和筛选 WWW BLPA COM CN 研究思路 三 研究思路 三 逆向思维方法 逆向思维方法 首先 首先 通过对血清中存在的复方化学成分的 研究 追踪其来源 通过对血清中存在的复方化学成分的 研究 追踪其来源 其次 其次 设计最佳提取分离方案 对复方或相 应单味中药进行定向提取分离 设计最佳提取分离方案 对复方或相 应单味中药进行定向提取分离 再次 再次 将分离出的各化合物 参考它们在血 清中的含量 配比和复方中药剂量 从动物 的整体行为到细胞水平进行药理实验评价 筛选研究复方有效成分 将分离出的各化合物 参考它们在血 清中的含量 配比和复方中药剂量 从动物 的整体行为到细胞水平进行药理实验评价 筛选研究复方有效成分 最后 最后 以有效成分为指标 研究复方作用机 理和配伍规律 以有效成分为指标 研究复方作用机 理和配伍规律 WWW BLPA COM CN 研究方法研究方法 在中药复方化学研究技术与方法 上 陈耀祖认为中药复方化学研 究应 在中药复方化学研究技术与方法 上 陈耀祖认为中药复方化学研 究应重视实验方法学研究重视实验方法学研究 如果 在方法学上没有突破 则很难达 到预期目标 如果 在方法学上没有突破 则很难达 到预期目标 WWW BLPA COM CN 色谱及其联用技术色谱及其联用技术 是攻克中药复杂体系中分离分析 问题的最有力手段 是攻克中药复杂体系中分离分析 问题的最有力手段 采用以液相 色谱为主的各种色谱手段 配合 质谱和各种光谱的综合分析 建 立中药复方识别指纹和智能统一 信息数据库十分重要 采用以液相 色谱为主的各种色谱手段 配合 质谱和各种光谱的综合分析 建 立中药复方识别指纹和智能统一 信息数据库十分重要 WWW BLPA COM CN 复 方 复 方 色谱数据库 质谱数据库 光谱数据库 色谱数据库 质谱数据库 光谱数据库 化 学 成 分 化 学 成 分 指 纹 和 智 能 统 一 信 息 库 指 纹 和 智 能 统 一 信 息 库 色谱及联用技术色谱及联用技术 信息 提取 加工 综合 信息 提取 加工 综合 HPLC GC CE MS MS MS 免疫亲 和萃取 免疫亲 和萃取 HPLC ISI MS MS WWW BLPA COM CN 生物技术生物技术 用生物活性筛选手段 如有荧光标志化合物的 受体 直接从库中 用生物活性筛选手段 如有荧光标志化合物的 受体 直接从库中 钓钓 出有活性的化合物 出有活性的化合物 采用多维色谱差异显示技术 基因芯片技术和 蛋白质组相关分析技术研究中药复方对细胞基 因表达谱和蛋白质表达谱的影响 将中药复方 多组分 多靶点 多途径作用特点与基因 蛋 白表达关联起来 通过比较各自不同的表达差 异谱 表达的器官特异性及表达水平 阐明复 方药效物质基础及配伍规律 采用多维色谱差异显示技术 基因芯片技术和 蛋白质组相关分析技术研究中药复方对细胞基 因表达谱和蛋白质表达谱的影响 将中药复方 多组分 多靶点 多途径作用特点与基因 蛋 白表达关联起来 通过比较各自不同的表达差 异谱 表达的器官特异性及表达水平 阐明复 方药效物质基础及配伍规律 WWW BLPA COM CN 四 中药复方化学研究实践 近年来 我们课题组在中药复方化学研究方面进 行了大胆而有益的尝试 为建立以现代化学和药 理学为基础 能阐明中药复方有效部位 群 组 成 有效成分 群 结构 药效及机理的方法 进行了大量的实验与探索 近年来 我们课题组在中药复方化学研究方面进 行了大胆而有益的尝试 为建立以现代化学和药 理学为基础 能阐明中药复方有效部位 群 组 成 有效成分 群 结构 药效及机理的方法 进行了大量的实验与探索 通过实践 形成了方 证 病 对应 整方筛选中 药复方有效物质基础的总体思路 以及以中药复 方有效物质为基础研制创新药物的方法和模式 通过实践 形成了方 证 病 对应 整方筛选中 药复方有效物质基础的总体思路 以及以中药复 方有效物质为基础研制创新药物的方法和模式 WWW BLPA COM CN 首先 按照传统用药方式 将中药复方视 为一个有机整体进行有效物质基础研究 首先 按照传统用药方式 将中药复方视 为一个有机整体进行有效物质基础研究 第二 结合主要药效考察 筛选确定复方 有效部位和有效成分 第二 结合主要药效考察 筛选确定复方 有效部位和有效成分 中药复方虽有多方面的药效作用 但在探 讨其物质基础时 不能面面俱到 而应有 所侧重 故选择的活性筛选指标 不宜过 多和分散 而应该与复方疗效一致 目标 明确 重点突出 中药复方虽有多方面的药效作用 但在探 讨其物质基础时 不能面面俱到 而应有 所侧重 故选择的活性筛选指标 不宜过 多和分散 而应该与复方疗效一致 目标 明确 重点突出 WWW BLPA COM CN 第三 对有效部位 有效成分进行药理研究 阐明其作用机制 第三 对有效部位 有效成分进行药理研究 阐明其作用机制 第四 建立完善的有效部位质量控制方法 第四 建立完善的有效部位质量控制方法 多特征有效指标定量多特征有效指标定量 加加 指纹图谱定性指纹图谱定性 其一 有效部位中主要类型成分总含量的测定 其一 有效部位中主要类型成分总含量的测定 其二 有效部位中主要有效成分含量的测定 其二 有效部位中主要有效成分含量的测定 其三 有效部位指纹图谱的建立与定性分析 其三 有效部位指纹图谱的建立与定性分析 WWW BLPA COM CN 第五 以有效部位或有效成分配伍为基 础 进行制备工艺 质量控制方法 药理 和毒理研究 完成中药复方创新药物的基 础研究 第五 以有效部位或有效成分配伍为基 础 进行制备工艺 质量控制方法 药理 和毒理研究 完成中药复方创新药物的基 础研究 WWW BLPA COM CN 苦参汤苦参汤 始载 孙思邈 千金方 始载 孙思邈 千金方 处方 苦参三两 黄芩二两 生地黄八两处方 苦参三两 黄芩二两 生地黄八两 功能 清热燥湿 泄毒养阴功能 清热燥湿 泄毒养阴 主治 热病五六日以上 热交营分彻外壮热 主治 热病五六日以上 热交营分彻外壮热 方解 苦参燥湿除热 搜逐肾家久伏之邪 黄方解 苦参燥湿除热 搜逐肾家久伏之邪 黄 芩泄肌肤之热 生地黄清血脉之邪 芩泄肌肤之热 生地黄清血脉之邪 现代应用 主要用于治疗生殖系与泌尿系炎症 如现代应用 主要用于治疗生殖系与泌尿系炎症 如 阴道炎 尿道炎 淋病等 以及慢性结阴道炎 尿道炎 淋病等 以及慢性结 肠炎 慢性肝炎 病毒性心肌炎 心律肠炎 慢性肝炎 病毒性心肌炎 心律 失常 冠心病 多种皮肤病等 失常 冠心病 多种皮肤病等 目前有关苦参汤的药效物质基础未见研究报道 目前有关苦参汤的药效物质基础未见研究报道 WWW BLPA COM CN 研究内容研究内容 第一部分苦参汤提取分离富集工艺研究第一部分苦参汤提取分离富集工艺研究 第二部分苦参汤化学成分研究第二部分苦参汤化学成分研究 第三部分苦参汤质量控制方法研究第三部分苦参汤质量控制方法研究 第四部分苦参汤配伍化学研究第四部分苦参汤配伍化学研究 WWW BLPA COM CN 第一部分苦参汤提取分离富集工艺研究第一部分苦参汤提取分离富集工艺研究 1 苦参汤提取工艺研究苦参汤提取工艺研究 2 苦参汤分离富集工艺研究苦参汤分离富集工艺研究 WWW BLPA COM CN 1 苦参汤提取工艺研究苦参汤提取工艺研究 选择依据 选择依据 1 单味药主要有效成分理化性质及药理活性 单味药主要有效成分理化性质及药理活性 黄芩 黄酮黄芩 黄酮 苦参 生物碱和黄酮苦参 生物碱和黄酮 生地黄 环烯醚萜生地黄 环烯醚萜 2 传统用药方式 传统用药方式 提取溶剂 水 提取溶剂 水 Q 乙醇 乙醇 提取方法 提取方法 3药分别单提后混合 药分别单提后混合 2药共提 药共提 1 药单提后混合 药单提后混合 3药共提药共提 WWW BLPA COM CN 苦参汤提取工艺研究苦参汤提取工艺研究 1 苦参 苦参13 5 g 黄芩 黄芩9g 生地黄 生地黄36g 2 苦参 苦参13 5 g 黄芩 黄芩9g 生地黄 生地黄36g 3 苦参 苦参13 5 g 生地黄 生地黄36g 黄芩 黄芩9g 4 黄芩 黄芩9g 生地黄 生地黄36g 苦参 苦参13 5g 5苦参苦参13 5 g 黄芩 黄芩9g 生地黄 生地黄36g 6苦参苦参13 5 g 7黄芩黄芩9g 8生地黄生地黄36g 样品样品 WWW BLPA COM CN 筛选指标和评价方法筛选指标和评价方法 测定 测定 总黄酮总黄酮 总生物碱总生物碱 总环烯醚萜总环烯醚萜 黄芩苷 汉黄芩苷 黄芩素 汉黄芩素黄芩苷 汉黄芩苷 黄芩素 汉黄芩素 苦参碱 氧化苦参碱 槐定碱 槐果碱 氧化槐果碱苦参碱 氧化苦参碱 槐定碱 槐果碱 氧化槐果碱 三叶豆紫檀苷 苦参啶三叶豆紫檀苷 苦参啶 计算 计算 提取率提取率 WWW BLPA COM CN 0 20 40 60 80 100 120 提取率 C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 S 8 总黄酮提取率总黄酮提取率 0 20 40 60 80 100 提取率 C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 S 8 总生物碱提取率总生物碱提取率 WWW BLPA COM CN 0 20 40 60 80 100 120 提 取 率 C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 C 7 C 8S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 S 8 总环烯醚萜提取率总环烯醚萜提取率 QQ 乙醇提取 总黄酮和总生物碱提取 乙醇提取 总黄酮和总生物碱提取 乙醇提取 总黄酮和总生物碱提取 乙醇提取 总黄酮和总生物碱提取 率均高于水提取率均高于水提取率均高于水提取率均高于水提取2020 以上 其中三药混合 以上 其中三药混合 以上 其中三药混合 以上 其中三药混合 提取 总黄酮提取率高于水提取约提取 总黄酮提取率高于水提取约提取 总黄酮提取率高于水提取约提取 总黄酮提取率高于水提取约3535 2 2种溶剂对总环烯醚萜的提取率无明显种溶剂对总环烯醚萜的提取率无明显种溶剂对总环烯醚萜的提取率无明显种溶剂对总环烯醚萜的提取率无明显 差异 差异 差异 差异 WWW BLPA COM CN 0 20 40 60 80 100 120 提 取 率 C 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8 总黄酮总生物碱总环烯醚萜 0 20 40 60 80 100 120 提 取 率 S 1S 2S 3S 4S 5S 6S 7S 8 总黄酮总生物碱总环烯醚萜 苦参汤不同组合提取方式主要成分提取率苦参汤不同组合提取方式主要成分提取率 用水或醇提取 用水或醇提取 用水或醇提取 用水或醇提取 3 3药共提药共提药共提药共提 有最高的总黄酮 总生物有最高的总黄酮 总生物有最高的总黄酮 总生物有最高的总黄酮 总生物 碱和总环烯醚萜提取率 其中尤以总黄酮 总生物碱碱和总环烯醚萜提取率 其中尤以总黄酮 总生物碱碱和总环烯醚萜提取率 其中尤以总黄酮 总生物碱碱和总环烯醚萜提取率 其中尤以总黄酮 总生物碱 变化明显 均高于变化明显 均高于变化明显 均高于变化明显 均高于 3 3药分别单提后混合药分别单提后混合药分别单提后混合药分别单提后混合 4040 左右 左右 左右 左右 Q 乙醇 水 乙醇 水 WWW BLPA COM CN 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 提 取 率 C 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8 黄芩苷汉黄芩苷黄芩素汉黄芩素4种总和 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 提 取 率 S 1S 2S 3S 4S 5S 6S 7S 8 黄芩苷汉黄芩苷黄芩素汉黄芩素4种总和 不同样品黄芩主要成分提取率不同样品黄芩主要成分提取率 4 4种黄酮的提取率 醇提较水提 高种黄酮的提取率 醇提较水提 高种黄酮的提取率 醇提较水提 高种黄酮的提取率 醇提较水提 高1414 2525 3 3药共提药共提药共提药共提 较较较较 3 3药分别单提后混合药分别单提后混合药分别单提后混合药分别单提后混合 高高高高2020 左右 左右 左右 左右 Q 乙醇 水 乙醇 水 WWW BLPA COM CN 0 20 40 60 80 100 提取率 C 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8 槐果碱等5种生物碱三叶豆紫檀苷苦参啶 0 10 20 30 40 50 60 70 80 提 取 率 S 1S 2S 3S 4S 5S 6S 7S 8 槐果碱等5种生物碱三叶豆紫檀苷苦参啶 Q 乙醇 水 乙醇 水 不同样品苦参主要成分提取率不同样品苦参主要成分提取率 WWW BLPA COM CN 苦参主要成分提取率苦参主要成分提取率 醇提较水提 醇提较水提 5种生物碱 高种生物碱 高14 33 三叶豆紫檀苷 高三叶豆紫檀苷 高18 27 苦参啶 高苦参啶 高37 49 3药共提药共提 较较 3药分别单提后混合药分别单提后混合 5种生物碱 高种生物碱 高40 三叶豆紫檀苷 高三叶豆紫檀苷 高5 Q 乙醇 或无 乙醇 或无 差异 水 差异 水 苦参啶 高苦参啶 高16 18 WWW BLPA COM CN 总结总结 苦参汤传统的复方煎服 提取方 式 三药共提 得当 进而采用 苦参汤传统的复方煎服 提取方 式 三药共提 得当 进而采用Q 乙醇提取 可提高其化学成分的提取 率 乙醇提取 可提高其化学成分的提取 率 WWW BLPA COM CN 2 苦参汤分离富集工艺研究苦参汤分离富集工艺研究 树脂筛选树脂筛选 供筛选用大孔吸附树脂的基本性质和结构参数供筛选用大孔吸附树脂的基本性质和结构参数 型 号型 号树 脂树 脂 结 构结 构 极 性极 性比表面积比表面积 m2 g 孔 径孔 径 nm 孔 度孔 度 孔 容孔 容 ml g A B C D E F G H 苯乙烯苯乙烯 苯乙烯苯乙烯 苯乙烯苯乙烯 苯乙烯苯乙烯 苯乙烯苯乙烯 苯乙烯苯乙烯 苯乙烯苯乙烯 苯乙烯苯乙烯 非极性非极性 非极性非极性 非极性非极性 非极性非极性 弱极性弱极性 极性极性 极性极性 极性极性 500 600 400 440 540 580 1000 1300 480 520 250 290 160 200 100 120 29 0 30 0 6 5 7 5 10 0 10 5 13 0 14 0 15 5 16 5 14 5 15 5 28 0 30 0 55 59 43 48 74 78 62 66 50 60 46 50 1 20 1 24 0 73 0 77 2 88 2 92 1 25 1 29 0 73 0 77 0 62 0 66 0 78 0 82 WWW BLPA COM CN 不同树脂静态吸附量不同树脂静态吸附量 静态吸附量 原液浓度 滤液浓度 溶液体积静态吸附量 原液浓度 滤液浓度 溶液体积 树脂湿体积树脂湿体积 0 5 10 15 20 25 30 静态吸附量 mg mL CAEGFBDH 总黄酮总生物碱总环烯醚萜 WWW BLPA COM CN 吸附动力学曲线吸附动力学曲线 0 5 10 15 20 25 30 24681224 吸附时间 h 吸附量 mg mL C A E G F B D H 不同树脂对苦参汤总黄酮的吸附动力学曲线不同树脂对苦参汤总黄酮的吸附动力学曲线 WWW BLPA COM CN 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24681224 吸附时间 h 吸附量 mg mL C A E G F B D H 不同树脂对 苦参汤总生 物碱的吸附 动力学曲线 不同树脂对 苦参汤总生 物碱的吸附 动力学曲线 0 5 10 15 20 25 30 35 24681224 吸附时间 h 吸附量 mg mL C A E G F B D H 不同树脂对 苦参汤总环 烯醚萜的吸 附动力学曲 线 不同树脂对 苦参汤总环 烯醚萜的吸 附动力学曲 线 WWW BLPA COM CN 不同树脂动态吸附量不同树脂动态吸附量 0 2 4 6 8 10 12 动 态 吸 附 量 mg mL CAEGFBDH 总黄酮总生物碱总环烯醚萜 WWW BLPA COM CN 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 吸附 解析率 CAEGFBDH 总黄酮总生物碱总环烯醚萜 不同树脂吸附不同树脂吸附 解吸率解吸率 0 5 10 15 20 25 30 35 40 含量 CAEGFBDH 总黄酮总生物碱总环烯醚萜 不同树脂醇洗脱物 主要化学成分含量 不同树脂醇洗脱物 主要化学成分含量 WWW BLPA COM CN 结 论结 论 A E型树脂优于其它树脂 鉴于型树脂优于其它树脂 鉴于E型树脂 对总黄酮 总生物碱和总环烯醚萜的吸附 型树脂 对总黄酮 总生物碱和总环烯醚萜的吸附 解 吸率高于 解 吸率高于A型树脂型树脂10 以上 选择 以上 选择E型树脂 作为苦参汤分离富集用树脂 型树脂 作为苦参汤分离富集用树脂 WWW BLPA COM CN E树脂分离富集工艺条件考察树脂分离富集工艺条件考察 吸 附吸 附 吸附浓度 吸附量 吸附浓度 吸附量 吸附吸附pH值 吸附量 吸附值 吸附量 吸附 解吸率 含量 解吸率 含量 吸附流速 吸附量 吸附流速 吸附量 树脂柱径高比树脂柱径高比 吸附量 吸附 吸附量 吸附 解吸率 含量 解吸率 含量 泄漏曲线 吸光度 香草醛泄漏曲线 吸光度 香草醛 高氯酸显色 高氯酸显色 上样量与树脂体积比例上样量与树脂体积比例 吸附 吸附 解吸率 含量 解吸率 含量 WWW BLPA COM CN 泄漏曲线泄漏曲线 泄漏曲线 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 1 4 30405060708090100110120130140 体积 mL ABS 开始明显泄漏时总 黄酮 总生物碱和 总环烯醚萜的吸附 量分别为 开始明显泄漏时总 黄酮 总生物碱和 总环烯醚萜的吸附 量分别为4 27 1 36和和4 59 mg mL 树脂达 吸附饱和而完全泄 漏时总黄酮 总生 物碱和总环烯醚萜 的吸附量分别为 树脂达 吸附饱和而完全泄 漏时总黄酮 总生 物碱和总环烯醚萜 的吸附量分别为 6 61 2 10和和 7 11 mg mL WWW BLPA COM CN E树脂分离富集工艺条件考察树脂分离富集工艺条件考察 解吸附解吸附 水洗脱体积 吸附水洗脱体积 吸附 解吸率 含量 解吸率 含量 洗脱剂 吸附洗脱剂 吸附 解吸率 含量 解吸率 含量 洗脱流速 吸附洗脱流速 吸附 解吸率 含量 解吸率 含量 洗脱曲线 洗脱量 洗脱曲线 洗脱量 树脂重复使用次数 吸附树脂重复使用次数 吸附 解析率 解析率 WWW BLPA COM CN 洗脱曲线洗脱曲线 洗脱曲线 0 5 10 15 20 25 30 35 306090120150180210240270300 体积 mL 洗脱量 mg 总黄酮总生物碱总环烯醚萜 WWW BLPA COM CN 第二部分 苦参汤化学成分研究第二部分 苦参汤化学成分研究 从苦参汤中分离鉴定出从苦参汤中分离鉴定出39个化合物 其中 黄酮类 个化合物 其中 黄酮类17个 环烯醚萜类 个 环烯醚萜类2个 生物碱类 个 生物碱类8个 有机酸类 个 有机酸类4个 长链烷醇类 个 长链烷醇类2个 甾类 个 甾类2个 香豆素类 个 香豆素类1个 其它类 个 其它类 3个个 WWW BLPA COM CN 类型类型中文名称中文名称英文名称英文名称 木犀草素木犀草素luteolin 白杨素白杨素chrysin 千层纸素千层纸素Aoroxylin A 7 甲氧基黄酮甲氧基黄酮7 methoxyflavone 黄芩素黄芩素baicalein 黄芩苷黄芩苷baicalin 汉黄芩素汉黄芩素wogonin 汉黄芩苷汉黄芩苷wogonoside 黄芩新素黄芩新素 IIskullcapflavone II 5 8 二羟基二羟基 6 7 二甲氧基黄酮二甲氧基黄酮5 8 dihydroxy 6 7 dimethoxyflavone 黄腐醇黄腐醇xanthohumol 苦参啶苦参啶kuraridin 2 4 二羟基二羟基 4 6 二甲氧基查耳酮二甲氧基查耳酮2 4 dihydroxy 4 6 dimethoxychalcone 4 4 二甲氧基查耳酮二甲氧基查耳酮4 4 dimethoxychalcone 三叶豆紫檀苷三叶豆紫檀苷trifolirhizin 芒柄花素芒柄花素formononetin 5 7 二羟基二羟基 6 甲氧基二氢黄酮 二氢千层纸素 甲氧基二氢黄酮 二氢千层纸素A 5 7 dihydroxy 6 methoxyflavanone 梓醇梓醇catalpol 桃叶珊瑚苷桃叶珊瑚苷aucubin 环烯醚萜类环烯醚萜类 黄酮类黄酮类 从 苦 参 汤 中 分 离 鉴 定 出 的 化 合 物 从 苦 参 汤 中 分 离 鉴 定 出 的 化 合 物 WWW BLPA COM CN 类型类型中文名称中文名称英文名称英文名称 苦参碱苦参碱matrine 槐定碱槐定碱sophoridine 槐果碱槐果碱sophocarpine 槐胺碱槐胺碱sophoramine 氧化苦参碱氧化苦参碱oxymatrine 氧化槐果碱氧化槐果碱oxysophocarpine 苦豆碱苦豆碱aloperine 鹰爪豆碱鹰爪豆碱sparteine 4 羟基羟基 3 甲氧基苯甲酸 香草酸 甲氧基苯甲酸 香草酸 vanillic acid 肉桂酸肉桂酸cinnamic acid 丁二酸 琥珀酸 丁二酸 琥珀酸 succinic acid 山梨酸山梨酸sorbic acid 二十八烷醇二十八烷醇octacosanol 三十烷醇三十烷醇triacontanol 谷甾醇谷甾醇 sitosterol 胡萝卜苷胡萝卜苷daucosterol 香豆素类香豆素类伞形花内酯 伞形花内酯 7 羟基香豆素 羟基香豆素 umbelliferon 甘露醇甘露醇mannitol 腺苷腺苷adenosine 苦参汤内酯 苦参汤内酯 LB 20 kushentangolide 其它类其它类 甾类甾类 长链烷醇类长链烷醇类 有机酸类有机酸类 生物碱类生物碱类 从 苦 参 汤 中 分 离 鉴 定 出 的 化 合 物 从 苦 参 汤 中 分 离 鉴 定 出 的 化 合 物 WWW BLPA COM CN 鉴定出的鉴定出的39个化合物均为首次自苦参汤中分离得到 个化合物均为首次自苦参汤中分离得到 其中 其中 化合物化合物LB 20经文献检索确认为新化合物 暂命名为 苦参汤内酯 经文献检索确认为新化合物 暂命名为 苦参汤内酯 kushentangolide 2 4 二羟基二羟基 4 6 二甲氧基查耳酮 苦豆碱和丁二酸 为已知化合物 但属首次在组成苦参汤复方的 二甲氧基查耳酮 苦豆碱和丁二酸 为已知化合物 但属首次在组成苦参汤复方的3味中药苦 参 黄芩 生地黄中发现 味中药苦 参 黄芩 生地黄中发现 通过对苦参汤提取物通过对苦参汤提取物HPLC指纹图谱共有指纹峰化学 成分的归属 确认 指纹图谱共有指纹峰化学 成分的归属 确认2 4 二羟基二羟基 4 6 二甲氧基查耳酮来源 于苦参 苦参汤内酯等的来源还有待于进一步研究确定 二甲氧基查耳酮来源 于苦参 苦参汤内酯等的来源还有待于进一步研究确定 WWW BLPA COM CN 苦参汤内酯 苦参汤内酯 kushentangolide LB 20 无色棱柱状结晶 丙酮 无色棱柱状结晶 丙酮 mp 183 185 c 1 13mg mL 丙酮 丙酮 114 2 UV max nm 208 MeOH 20 D O O O O O H H O O O HH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 MS 1HNMR 13CNMR 1H 1HCOSY HMQC HMBC NOESY 新化合物 命名为苦参汤内酯 新化合物 命名为苦参汤内酯 kushentangolide WWW BLPA COM CN 第三部分 苦参汤质量控制方法研究第三部分 苦参汤质量控制方法研究 1 苦参汤化学成分定量研究苦参汤化学成分定量研究 总黄酮 总生物碱 总环烯醚萜总黄酮 总生物碱 总环烯醚萜 黄芩苷 汉黄芩苷 黄芩素 汉黄芩素黄芩苷 汉黄芩苷 黄芩素 汉黄芩素 槐果碱 苦参碱 槐定碱 氧化槐果碱 氧化苦槐果碱 苦参碱 槐定碱 氧化槐果碱 氧化苦 参碱参碱 三叶豆紫檀苷三叶豆紫檀苷 黄腐醇 苦参啶黄腐醇 苦参啶 2 苦参汤指纹图谱定性研究苦参汤指纹图谱定性研究 WWW BLPA COM CN 苦参汤化学成分定量研究苦参汤化学成分定量研究 UV VIS分光光度法分光光度法 总生物碱总生物碱 酸性染料比色法酸性染料比色法 总黄酮总黄酮 盐酸盐酸 镁粉比色法镁粉比色法 总环烯醚萜总环烯醚萜 香草醛香草醛 高氯酸比色法高氯酸比色法 HPLC法法 黄芩苷 汉黄芩苷 黄芩素 汉黄芩素 同时定量 黄芩苷 汉黄芩苷 黄芩素 汉黄芩素 同时定量 槐果碱 苦参碱 槐定碱 氧化槐果碱 氧化苦参碱槐果碱 苦参碱 槐定碱 氧化槐果碱 氧化苦参碱 同时定量 同时定量 WWW BLPA COM CN 三叶豆紫檀苷含量测定三叶豆紫檀苷含量测定 色谱条件色谱条件 色谱柱 色谱柱 Phenomenex Luna C18色谱柱色谱柱 250mm 4 6mm 5 m 流动相 乙腈流动相 乙腈 磷酸水溶液磷酸水溶液 磷酸磷酸 水 水 2 530 26 74 流速 流速 1 0ml min 检测波长 检测波长 310nm 柱温 室温柱温 室温 WWW BLPA COM CN 对照品溶液色谱图对照品溶液色谱图供试品溶液色谱图供试品溶液色谱图 苦参药材溶液色谱图苦参药材溶液色谱图阴性样品溶液色谱图阴性样品溶液色谱图 WWW BLPA COM CN 黄腐醇 苦参啶含量测定黄腐醇 苦参啶含量测定 色谱条件色谱条件 色谱柱 色谱柱 Phenomenex Luna C18色谱柱 色谱柱 250mm 4 6mm 5 m 流动相 甲醇 流动相 甲醇 磷酸 水溶液 磷酸 水溶液 磷酸磷酸 水水 2 530 75 25 流速 流速 1 0ml min 检测波长 检测波长 365nm 柱温 室温 柱温 室温 WWW BLPA COM CN 黄腐醇黄腐醇HPLC色谱图色谱图苦参啶苦参啶HPLC色谱图色谱图 供试品供试品HPLC色谱图色谱图苦参药材苦参药材HPLC色谱图色谱图 阴性样品阴性样品HPLC色谱图色谱图 WWW BLPA COM CN 苦参汤指纹图谱定性研究苦参汤指纹图谱定性研究 样 品样 品制备用处方 药材 制备用处方 药材 C Z 1Q苦参苦参13 5 g 黄芩 黄芩9g 生地黄 生地黄36g C Z 2KH苦参苦参13 5 g 黄芩 黄芩9g C Z 3KD苦参苦参13 5 g 生地黄 生地黄36g C Z 4HD黄芩黄芩9g 生地黄 生地黄36g C Z 5K苦参苦参13 5 g C Z 6H黄芩黄芩9g C Z 7D生地黄生地黄36g 样 品 简 表 样 品 简 表 WWW BLPA COM CN 色谱条件色谱条件 色谱柱 色谱柱 Phenomenex Luna C18色谱柱色谱柱 250mm 4 6mm 5 m 流动相 流动相 磷酸水溶液磷酸水溶液 水水 磷酸 磷酸 530 2 甲醇 梯度见表 甲醇 梯度见表 流速 流速 1 0mL min 检测波长 检测波长 280nm 365nm 柱温 柱温 室温室温 进样量 进样量 10 L 时间时间 min 磷酸水溶液磷酸水溶液 A 甲醇甲醇 B B 055 45 4055 45 1100 100 1200 100 12155 45 流动相梯度表 WWW BLPA COM CN 指纹图谱指纹图谱 C Z 1Q样品 样品 I HPLC指纹图谱 指纹图谱 280nm WWW BLPA COM CN 指纹图谱指纹图谱 C Z 1Q样品 样品 I HPLC指纹图谱 指纹图谱 365nm WWW BLPA COM CN 检测波长检测波长 280nm检测波长检测波长 365nm 共有峰共有峰相对保留时间相对保留时间共有峰共有峰相对保留时间相对保留时间 黄芩黄芩1 主 主 2 3 4 5 6 主 主 7 辅 辅 8 9 10 11 12 13 14 15 主 主 16 17 18 主 主 0 162 0 211 0 270 0 315 0 459 0 506 0 676 0 745 0 829 0 913 1 1 167 1 306 1 388 1 465 1 556 1 650 1 717