专题一 兽药的毒理学试验和安全性评价.ppt

1 专题一兽药的毒理学试验和安全性评价 一般毒性试验 急性毒性试验亚慢性毒性试验长期毒性试验特殊毒性试验 三致 试验致畸 致突变 致癌 2 第一节一般毒性试验 一 急性毒性试验 1 经口或注射给药的急性毒性试验 2 经皮给药的急性毒性试验目的 1 求出受试物的半数致死量 LD50 2 阐明受试物急性毒性的剂量 反应关系与中毒特征 为急救治疗措施提供依据 3 为受试物的毒性作出初步判断 为其它毒性试验设计提供依据 3 经口或注射给药的急性毒性试验 1 动物小鼠 体重18 22g 大鼠 体重180 200g 或其他敏感动物 应注明动物的品系 每组小鼠不少于10只 大鼠不少于6只 雌雄各半 雌性应未产无孕 2 供试药物的配制一般用水为溶剂 将药物配成一定浓度的溶液 4 3 给药方式与最大体积灌胃法 一次最大灌胃量1 0ml 只 小鼠 4 0ml 只 大鼠 腹腔注射 一次最大注射量1 0ml 只 小鼠 3 0ml 只 大鼠 4 剂量与分组预试验全部致死的最小剂量LD100和全部存活的最大剂量LD0正式试验5 7个剂量组 组间剂量呈等比级数 其比值为1 2 1 4 5 5 观察指标动物一般健康状况 中毒表现和死亡过程 时间 7天 死亡动物 大体剖检 病理组织学检查 必要时 6 LD50计算寇氏法计算供试药的LD50值及其95 可信限范围 7 结果判定大鼠一次经口LD50在1mg kg以下为极毒 1 50mg kg为剧毒 50 500mg kg为中等毒 500 5000mg kg为低毒 5000mg kg以上者为实际无毒 6 小鼠腹腔注射敌百虫LD50计算表 7 计算LD50 代入下列公式 lgLD50 Xk d Pi 0 5 LD50 Lg 1 Xk d Pi 0 5 式中Xk为最大对数剂量 Pi为死亡率的总和 d为相邻两组剂量比值的对数 d lg1 2 0 0792则 LD50 Lg 1 2 7938 0 0792 2 4 0 5 Lg 12 6433 439 87 mg kg 8 经皮给药的急性毒性试验 1 动物选用健康家兔 2 0 3 0kg 豚鼠 350 450g 或大鼠 200 300g 每组动物不少于6只 雌雄各半 2 供试药物的配制供试药物如是固体 应磨成细粉状 过120目筛 并用适量水或无毒无刺激性赋型剂 橄榄油 羊毛脂 凡士林等 混匀 如为液体 一般不要稀释 9 3 给药方式脱去动物背部脊柱两侧毛发 不得损伤皮肤 脱毛后24小时检查皮肤 如无损伤才能进行试验 将供试药物均匀地涂敷于脱毛区 不应少于动物体表面积的10 用塑料纸和两层纱布覆盖 再用胶布或绷带固定 以防脱落和动物舔食 敷药24小时 试验结束后 用温水或适当溶剂清除残留供试药 大鼠可采用浸尾方法给药 10 4 剂量与分组正式试验前 用少量动物做预备试验 根据24小时内动物死亡情况 估计LD50的可能范围 以确定正式试验的剂量 一般分为4个剂量组 组间剂量呈等比级数 其比值为 1 1 5 3 0 若用赋形剂 需设赋形剂对照组 11 5 观察指标 观察动物的全身中毒表现和死亡情况 观察时间为一周 若给药4天后仍有动物死亡时 仍需继续观察一周 对死亡动物应做大体剖检 必要时进行病理组织学检查 12 6 结果判定兔涂皮LD50在5mg kg以下为极毒 5 44mg kg为剧毒 44 350mg kg为中等毒 350 2180mg kg为低毒 2180mg kg以上者为实际无毒 13 二 亚慢性毒性试验 确定外来化学物质在动物1 10左右的生命时间内 反复多次接触后有无引起损害的观测过程 又称短期试验 亚急性毒性试验 Subchronictoxicitytest 目的 1 毒性确定2 靶器官3 慢性毒性试验依据 14 试验方法 1 动物一般选用大鼠 100 200g 或小鼠 15 20g 有条件时 采用供试药物的靶动物鸡等 外购动物需饲养一周后才能供试验用 15 2 试验周期 16 3 给药方式 17 4 剂量与分组 大鼠20只 组 雌雄各半对照组低剂量组高于有效量 不出现毒性反应中剂量组高剂量组部分动物出现毒性反应或死亡但死亡数不超过20 18 5 观察指标 分六大项 具体指标为 1 健康状况每天 2 体重 饲料消耗2 3次 周 3 血液学检查定期 4 血液生化学检查定期 5 肝 肾绝对重量和脏器指数试验结束时 6 剖检 组织病理学检查试验结束时 19 6 结果处理 试验数据方差分析或X2病理变化照片写出评价报告 20 三 长期毒性试验 1 概念外来化学物质在动物生命期的大部分时间或终生接触于机体时所引起的损害作用 称为长期毒性作用或慢性毒性作用 确定外来化学物质这种慢性毒性作用的动物试验观察方法 称为长期毒性试验 21 2 目的 观测长期反复摄入低剂量的受试物 可能对机体造成的损害 严重程度 停药后的发展和恢复情况 为临床试验提供依据 3 试验方法 1 动物两种动物 啮齿类和非啮齿类 目前要求用一种啮齿类动物进行全面系统的试验 22 2 剂量分组试验组 4 5个 设高剂量组1 2个 中剂量组1 2个 低剂量组1 2个 以LD50的1 10 1 50 1 100 1 1000剂量分组 对照组 1个 3 染毒方式混饲或饮水 由动物自由进食 或涂擦皮肤 23 4 观察指标 一般情况 健康 生长发育 进食量 特别是体重 生物化学指标 肝 肾功能 血液学变化 Hb WBC RBC 病理学检查 病理解剖和病理组织学变化 5 结果评价参考亚急性毒性试验 24 第二节特殊毒性试验 致突变 体外 1 艾母氏 Ames 试验 必做 2 哺乳动物培养细胞染色体畸变 CHO CHL 选做体内 3 微核试验 必做 4 精子畸形试验选做 5 小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验选做 6 显性致死试验若 4 5 任一项为阳性 必做 6 25 致畸 1 传统致畸试验 必做 一般兽药必做 2 喂养繁殖毒性试验 3 喂养致畸试验 2 3 饲料药物添加剂必须增做 26 一 艾母氏 Ames 试验方法 1 原理组氨酸缺陷型 即突变型 鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸的培养基上不能生长 但在加有致突变原的培养基上培养 则可使突变型产生回复突变成为野生型 即恢复合成组氨酸的能力 于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长 根据其生长菌落的数量判断受试物是否具有致突变性 27 野生型 能合成组氨酸 缺乏组氨酸的培养基 加有致突变原的培养基 组氨酸缺陷型 即突变型 鼠伤寒沙门氏菌 28 2 菌种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a TA98 TA100 TA102四个标准株 3 剂量分组每次试验要求4 5个剂量组 每个剂量做三个平行平皿 高剂量以不抑菌为原则 液态受试物 0 05 50ul 平皿固态受试物 0 1 1000ug 平皿 最高剂量可达5000ug 平皿 选定后剂量的药物应配制成适当浓度体积 100ul或200ul 皿 29 4 溶剂水5 对照物每次检测均需要阳性对照 已知的阳性药物阴性对照 溶剂加S9混合液时要同时作不加S9混合液的对照平皿6 S9混合液如果受试物可能是经动物体酶系统活化代谢后才具有致突变作用 则试验过程需要在培养基上同时加入哺乳动物的肝微粒体 S9混合液 使受试物被活化而呈现致突变作用 30 S9制备选体重200g左右成年雄性大鼠 经诱导剂诱导后宰杀 处死前12小时禁食 在低温条件下 无菌操作取出肝脏 用KCI液淋洗后置匀浆器中制成匀浆 低温离心后分装 保存于液氮或 80 冰箱 31 7 试验步骤TA97aTA98TA100TA10237 水浴振荡培养活菌数不得少于1 2x109 ml 增菌培养液 增菌培养液 增菌培养液 增菌培养液 32 试验步骤 受检物 菌液 S9混合液或磷酸盐缓 0 1 0 2ml 0 1ml 0 5ml 37 水浴振荡培养20imns加入45 顶层培养基2ml混匀37 培养48h 无菌小试管 含底层培养基的平皿 33 8 结果评价 受试组的菌落数大于2倍自发回变数 并有剂量反应关系和重现性 判为诱变阳性 34 二 微核试验 原理 骨髓细胞染色体经诱变物作用 发生突变后出现断裂 并有部分断片在有丝分裂后期不移向两极 在有丝分裂的末期不进入分裂的细胞核中 因而存留于细胞浆中 形成一个或几个圆形至杏仁状的结构 并存留一定时间 由于这种圆形结构比普通细胞核小 故称微核 micronucleus 35 图示 原理 诱变物嗜多染红细胞微核直径相当于红细胞直径的1 20 1 5 36 1 动物成年健康小鼠 品系 随机分为受试组和对照组 10只 组 雌雄各半 2 受试物的处理将受试物溶于适宜的溶剂中 以0 1 0 2ml 10g体重的给药体积配制成适当的浓度 3 给药方式给药途径 与临床用药途径相同 内服时需灌胃 给药剂量 以LD50为依据 设三个剂量组 高剂量组LD50的0 8 0 5 低剂量组LD50的0 05 0 1并设阴性对照和阳性对照组 阳性对照物可选用已知的能诱发微核阳性的诱变剂 37 4 试验操作一次给药 24 48 72小时取样制片 二次给药 第二次给药后的6 24小时取样制片 处死小鼠 将股骨骨髓洗入离心管 离心 常规涂片 姬姆萨染色 镜检 5 镜检计数 1000个嗜多染红细胞 PCE 片求出 嗜多染红细胞 正染红细胞 NCE 必要时 丫啶橙染色 荧光显微镜分析计数 38 6 结果评价将数据列表 分别列出嗜多染红细胞数 微核数及PCE NCE之比 所得结果用t检验进行数据分析 经重复试验P 0 01并有剂量反应关系时 判为阳性 39 三 异常毒性检查 一 目的将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口服给药 在规定时间内观察小鼠的死亡情况 以判定供试品是否符合规定的一种方法 40 二 实验动物小鼠健康无伤 体重17 20g 做过本实验的小鼠不能重复使用 41 三 检验方法 取5只小鼠 按药物的给药途径 每只小鼠分别给予供试品溶液0 5ml 静脉注射 尾静脉注入供试品溶液 注射时间一般为4 5秒 规定缓慢注射的药品可延长至30秒 皮下注射 可见注射部位皮下出现泡状隆起 42 四 结果判定 除另有规定外 5只小鼠在给药后48小时内不得死亡 如有死亡 另取体重17 20g小鼠10只复测 全部小鼠在48小时内不得有死亡 否则 判为不合格 43 第三节制剂的安全性评价 一 热原反应试验二 溶血性检查三 局部刺激性试验1 家兔点眼法2 家兔股四头肌法四 过敏性试验五 降压物质检查 44 一 热原反应试验 1 概念是指某些微生物的尸体及其增殖时的产物 主要是细菌的一种内毒素 大多数细菌都能在增殖时产生热原 霉菌与酵母菌也能产生热原 热原随注射液进入动物体后 轻则能引起体温升高 严重的虚脱死亡 45 检查对象 注射用原料溶媒注射液注射器 46 注射剂热原污染的途径 1 溶媒注射用水2 原料适宜微生物生长 生物制品如葡萄糖 水解蛋白 氯化钠3 用具或容器污染4 生产过程中污染及时灭菌 缩短时间 47 热原的性质 1 耐热性60 1小时不受影响 180 200 干热2小时或250 30mins彻底破坏2 滤过性过细菌滤器 不能过透析膜3 水溶性不溶于有机溶媒4 不挥发性但可随水蒸气带入蒸馏水5 被吸附性活性炭 硅藻土 树脂等 48 除去热原的方法 1 防止污染药液 溶媒 24小时内ddH2O 2 清除热原容器用强酸 强碱 干热3 吸附0 1 0 2 活性炭 多层石棉板4 超声波破坏热原5 氧化剂高锰酸钾 双氧水 49 2 热原检查法 本法系将一定剂量的供试品 静脉注射入家兔体内 在规定时间内 观察家兔体温升高的情况 以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定 50 1 选符合规定的家兔 1 健康无伤 体重1 7 3 0kg 同一来源 同一品系 雌兔无孕 2 1兔1笼 标兔号 经7日同一饲养条件饲养 测温条件相同 在此期间 体重应不减轻 精神 食欲 排泄等不得有异常 51 2 试验前的准备 1 试验前1 2日 供试用家兔应处于同一温度的环境中 实验室与饲养室环境温度相差不得大于5 52 2 室温应在17 28 在试验全部过程中 应注意室温变化不得大于3 应避免噪音干扰 3 家兔在试验前停食1小时并置于固定盒内 直至试验完毕 53 4 肛温计插入深度约6cm 不得少于1 5分钟 每隔30分钟测量体温1次 一般测量2次 两次体温之差不得超过0 2 以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温 54 5 试验用的注射器 针头及一切与供试品溶液接触的器皿 应置烘箱中用250 加热30分钟或用180 加热2小时 也可用其他适宜的方法除去热原 55 3 检查方法 1 每个供试样品用家兔3只 在测定正常体温 38 3 39 6 后15分钟内给药 2 供试品注射的体积 按家兔体重不少于1ml kg 不大于10ml kg 体积在5 10ml kg的溶液应在37 38 预热后注射 56 3 耳静脉缓慢注射 但每兔不超过3分钟 4 给药后每隔30分钟测温1次 共测6次 57 5 温差计算 1 以6次体温中最高的一次减去正常体温 即为该兔体温的升高温度 2 以6次体温中最低的一次减去正常体温 即为该兔体温的降低温度 58 4 结果判断 1 判断复试 1 初试3只兔中仅有1只体温升高0 6 或0 6 以上 或3只家兔升温均低于0 6 但升温的总数达1 4 或1 4 以上 应另取5只家兔复试 59 2 含有热原的供试品 一般在给家兔静脉注射后1 2小时出现升温高峰 当第3小时升温大于0 6 时 宜复试后再作判断 3 3只家兔中有1只降温值小于0 6 或3只家兔中有2只降温值在0 45 0 55 应另取3只家兔复试 60 2 判断合格 1 初试3只家兔中 体温升高0 6 以下 并且3只家兔升温的总数在1 4 以下可判断为符合规定 61 2 复试5只家兔中 体温升高0 6 或0 6 以上的家兔数仅有1只 并且初复试合并 8只家兔的升温总数为3 5 或3 5 以下 可判断为符合规定 62 3 判断不合格 1 初试3只家兔中 体温升高0 6 或0 6 以上的家兔数有2只或3只 可判断为不符合规定 63 2 复试的5只家兔中 体温升高0 6 或0 6 以上的家兔数有2只或2只以上 可判断为不符合规定 3 初复试合并8只家兔的升温总数超过3 5 可判断为不符合规定 64 二 中草药注射剂的质量检查 1 急性毒性中草药注射剂的耐受量应为家畜临床用量的100倍为安全 60倍以上者可慎用 65 具体方法 取小鼠5只 尾静脉或腹腔注射0 5ml药液 观察小鼠有无震颤 惊厥 四肢瘫痪 步态不稳 竖毛 呼吸抑制或死亡等反应 一般观察48 72小时 如有死亡 应另取10只重做 不得有死亡 66 2 溶血试验 含皂苷或鞣质或成分尚未十分明确的中草药注射液必须做溶血试验 67 具体方法 1 2 兔的红细胞生理盐水的配制兔耳缘静脉采血1ml 置青霉素小瓶 西林瓶 中 加玻璃珠搅拌除纤维蛋白 用生理盐水离心洗涤至上清液澄清为止 然后配成2 混悬液 68 2 溶血试验设计表 69 取洁净试管7支 按上表排列加入各种溶液 第6管为阴性对照管 第7管为阳性对照管 各管轻轻摇匀后 37 恒温箱或水浴中保温 或25 37 室温下 开始每隔15分钟 1小时后每隔1小时分别观察1次 共3小时 70 3 结果判断 判定标准 1 全溶血 溶液澄明红色 管底无红细胞残留 2 部分溶血 溶液澄明红色或棕色 管底有少量红细胞残留 3 无溶血 红细胞全部下沉 上层液体无色澄明 4 凝集 虽不溶血 但出现红絮状物 振摇后不能分散 将凝集物置于载玻片上 盖上盖玻片 从边缘滴加生理盐水 显微镜下观察 红细胞散开者为假凝集 反之为真凝集 71 结果判定 一般认为 第3管或第3管以前被试药液在30分钟内引起溶血 部分溶血或出现凝集现象的 不宜作静脉注射用 不溶血或出现假凝集现象的才可作注射用 72 三 局部刺激性试验1 家兔点眼法 取健康家兔1只 固定 观察眼结膜色泽和血管分布情况 然后将下眼睑拉成杯状 取被测试药液2