碱裂解法提取质粒.ppt

碱裂解法提取质粒DNA 通过质粒的一些特性 质粒DNA的提取 测定 学习用碱变性法提取质粒DNA的方法 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及操作 一 实验目的 质粒 Plasmid 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子 能稳定地独立存在于染色体外 并传递到子代 一般不整合到宿主染色体上 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在 存在于细菌 放线菌 真菌以及一些动植物细胞中 在细菌细胞中最多 二 实验原理 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子 具有以下特点 易于鉴定 在受体细胞中可以独立复制 易于筛选 易于导入受体细胞 二 实验原理 SDS是一种阴离子表面活性剂 它既能使细菌细胞裂解 又能使一些蛋白质变性 所以SDS处理细菌细胞后 会导致细菌细胞壁的破裂 从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来 释放出来的DNA遇到强碱性 NaOH 环境 就会变性 然后 用酸性乙酸钾来中和溶液 使溶液处于中性 质粒DNA将迅速复性 而基因组DNA 由于分子巨大 难以复性 离心后 质粒DNA将在上清中 而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部 通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来 三 主要试剂及作用 溶液 由葡萄糖 EDTA Tris HCl组成 保护 缓冲 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度 减少抽提过程中的机械剪切作用 防止破坏质粒 保护作用 EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子 防止DNA酶对质粒分子的降解作用 保护作用 Tris HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围 缓冲作用 8 溶液II 由SDS 十二烷基硫酸钠 与NaOH组成 裂解 变性 SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性 裂解细胞和蛋白质变性作用 NaOH PH 12 的作用是破坏氢键 使DNA分子变性 DNA变性作用 9 溶液III HAc和KAc组成的高盐溶液 复性 分离 HAc溶液能中和溶液 的碱性 使染色体DNA变性而发生缠绕 并使质粒DNA复性 KAc会与SDS形成溶解度很低的盐 并与蛋白质形成沉淀而除去 溶液中的DNA也会与蛋白质 SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离 四 试剂配制溶液 50mM葡萄糖 25mMTris HCl pH8 0 10mMEDTA pH8 0 1MTris HCl pH8 0 12 5ml 0 5MEDTA pH8 0 10ml 葡萄糖4 730g 加ddH2O至500ml 高压灭菌15min 贮存于4 溶液 0 2NNaOH 1 SDS 2NNaOH1ml 10 SDS1ml 加ddH2O至10ml 使用前临时配置 3 溶液 醋酸钾 KAc 缓冲液 pH4 8 5MKAc300ml 冰醋酸57 5ml 加ddH2O至500ml 4 保存备用 4 TE 10mMTris HCl pH8 0 1mMEDTA pH8 0 1MTris HCl pH8 0 1ml 0 5MEDTA pH8 0 0 2ml 加ddH2O至100ml 15lbf in2高压湿热灭菌20min 4 保存备用 5 苯酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 6 乙醇 无水乙醇 70 乙醇 7 5 TBE Tris碱54g 硼酸27 5g EDTA Na2 2H2O4 65g 加ddH2O至1000ml 15lbf in2高压湿热灭菌20min 4 保存备用 8 RNaseA RNA酶A 不含DNA酶 DNase free RNaseA的10mg ml TE配制 沸水加热15min 分装后贮存于 20 实验步骤 加1 5ml培养物于EP管 12000g 30S除去上清 加入冰的200 l溶液I 剧烈振荡EP管 室温3min加入300 l溶液II 快速颠倒数次 冰浴3min加入400 l冰溶液III 温和振荡10s 冰浴5min 12000g 5min转移上清到新EP管 加入等体积酚 氯仿 1 1 温和振荡 冰浴3min 12000g 5min上层水相转移到新EP管 加入2倍体积无水乙醇