纤维素酶产生菌的筛选_鉴定和产酶条件优化.pdf

第5期 收稿日期 2010 09 17 基金项目 国家自然科学基金青年基金项目 21002092 浙江省自然科学基金项目 Y2100757 2009年浙江省大学生科技创新活动计划 新苗人才计划2009R404013 作者简介 阮周波 1988 女 浙江宁波人 在读本科生 研究方向为应用微生物学 电话电子信箱 907125257 qq com 通讯作者 张应烙 讲师 博士 研究方向为应用微生物学与天然药物化学 电话 0579 82286419 电子信箱 yinglaozhang yahoo com cn 第50卷第5期 2011年3月 湖 北 农 业 科 学 Hubei Agricultural Sciences Vol 50 No 5 Mar 2011 地球上的生物资源主要来自光合生物 其中 90 以上为木质纤维素类物质 它们代表了生态系 统中营养金字塔最庞大的基层 1 天然的木质纤维 素材料含有纤维素 半纤维素和木质素等 其中纤 维素是地球上最丰富的多糖物质 这类物质是植物 细胞壁的主要成分 也是地球上最廉价的可再生资 源 另外 人类活动产生的废弃物中也含有大量的 纤维素 2 目前 人们对纤维素的降解和利用主要通 过纤维素酶的分解来实现 纤维素酶在再生能源利 用方面具有广阔的应用前景 可应用于农业 酿造 工业 发酵工业 食品工业以及其他领域 3 9 因此研 究纤维素酶有着十分重要的意义 昆虫肠道菌是指能定植于昆虫肠道的微生物 包括土著的昆虫肠道菌和能定植于昆虫肠道环境 纤维素酶产生菌的筛选 鉴定和产酶条件优化 阮周波 王忆丽 何未男 郑江燕 张霞 陈琼 胡松英 张应烙 浙江师范大学化学与生命科学学院 浙江 金华321004 摘要 采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌 利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛 选取透 明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛 根据菌株形态 生理生化特征对菌株进行初步鉴定 通过正交法优 化产酶条件 结果表明 经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B 12 经初步鉴定为芽孢杆菌属 Bacillus sp 1 25 麦芽浸粉为碳源 1 5 KNO3为氮源 0 2 的NaCl 0 1 的CMC Na 接种量6 培 养时间44 h为B 12产酶的适宜条件 优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活 CMCA 为 111 710 U mL 较 培养44 h后的酶活提高了8 78 滤纸酶活 FPA 为 35 017 U mL 提高了387 23 葡萄糖苷酶酶活 BGL 为 116 799 U mL 提高了700 38 关键词 马铃薯瓢虫 肠道菌 纤维素酶 优化 中图分类号 Q935 文献标识码 A 文章编号 0439 8114 2011 05 0915 06 Screening Identification and Cultural Condition Optimization of Cellulase producing Strains from the Intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata RUAN Zhou bo WANG Yi li HE Wei nan ZHENG Jiang yan ZHANG Xia CHEN Qiong HU Song ying ZHANG Ying lao College of Chemistry and Life Sciences Zhejiang Normal University Jinhua 321004 Zhejiang China Abstract The bacteria from the intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata were isolated through the pour plate method They were preliminarily screened using Congo red medium plate method and then screened according to their cellulase activ ities by flask shaking fermentation method The strain was identified based on morphological and physiological characters In addition the culture substrates and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment method A high cellu lase producing strain B 12 was screened from the intestine of H vigintioctomaculata and it was identified as Bacillus sp The best culture conditions were as follows substrate were 1 25 malt meal 1 5 KNO3 0 2 NaCl and 0 1 CMC Na inoculation quantity was 6 culture time was 44 h In this condition the enzyme activity of CMCase filter paper enzyme FPA and glucosidase BGL were 111 710 35 017 and 116 799 U mL respectively which were 8 78 387 23 and 700 38 higher than those of the initial strain respectively Key words Henosepilachna vigintioctomaculata intestinal bacteria cellulase optimization 湖北农业科学2011年 的微生物 10 研究表明一些昆虫肠道菌能帮助昆虫 消化食物 10 对喜食含纤维素食物的昆虫 我们推 测其消化纤维素可能与其肠道菌分泌纤维素酶有 关 马铃薯瓢虫主要为害茄科植物 喜食茄科植物 叶片 它消化叶片中的纤维素可能与其肠道菌有 关 本试验从马铃薯瓢虫肠道中分离筛选产纤维素 酶菌株并对其产酶条件进行优化 旨在为发现新的 纤维素酶高产菌株奠定基础 1材料与方法 1 1材料 1 1 1菌株采自浙江省金华市婺城区高村附近 马铃薯田地的马铃薯瓢虫肠道中的菌株 1 1 2培养基 菌种保藏培养基 牛肉膏蛋白胨 培养基 牛肉膏0 30 蛋白胨1 00 NaCl 0 50 琼脂1 50 2 00 pH值7 4 7 6 初筛培养基 米 糠2 00 NaCl 0 10 K2HPO40 50 MgSO4 7H2O 0 02 NH4 2SO40 06 琼脂1 50 2 00 pH值7 0 7 2 刚果红纤维素鉴定培养基 羧甲基 纤维素钠 CMC Na 0 30 NaCl 0 50 牛肉浸膏 0 15 蛋白胨0 50 琼脂1 50 2 00 pH值 7 0 7 2 种子培养液 酵母膏1 00 蛋白胨 1 00 NaCl 0 50 CMC Na 0 50 pH值7 0 7 2 液体产酶发酵培养液 配方同种子培养液 鉴 定用培养基 糖发酵试验培养基 葡萄糖蛋白胨水 培养基 蛋白胨水解培养基 Simons氏柠檬酸盐培 养基 明胶水解试验培养基等 1 1 3主要试剂葡萄糖 pH值4 6的醋酸缓冲 液 DNS 2 CMC Na 底物溶液 0 05 水杨苷的醋 酸缓冲液 蛋白胨 牛肉膏等 1 1 4主要仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅 上海 中安医疗器械厂生产 LRH 250生化培养箱 上海 一恒科技有限公司生产 D 78532台式冷冻离心机 德国Hettich公司生产 UV 7504紫外可见分光光 度计 上海欣茂仪器有限公司生产 SW CJ 1B型单 人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司生产 电子天平 赛多利斯科学仪器 北京 有限公司生 产 HH 4数显恒温水浴锅 山东鄞城科源仪器设备 厂生产 远红外快速恒温干燥箱 上海跃进医疗器 械厂生产 1 2方法 1 2 1纤维素酶产生菌的分离 纯化和初筛马铃 薯瓢虫饥饿24 h后 无菌条件下在75 酒精中表面 消毒2 min 去离子水漂洗3次 采用稀释平板法分 离肠道菌 待菌长出后用无菌牙签挑选单菌落于刚 果红纤维素鉴定培养基上影印2 3皿 37 下培养 2 3 d 取其中1皿采用刚果红染色法鉴定其产酶 能力 11 对产生透明圈的菌株进行测量并记录D d 值 D为透明圈直径 d 为菌落直径 下同 挑选 D d值大于1的菌株作为初筛菌种 通过连续划线 法 分离纯化 得到的初筛菌株转接到保藏斜面 4 条件下保藏备用 1 2 2纤维素酶产生菌的复筛将初筛到的菌株 活化后接种于30 250 mL 250 mL三角瓶装30 mL 培养液 下同 种子培养基中 37 180 r min摇床 培养过夜 以2 接种量转接于30 250 mL产酶培 养基中 37 180r min培养2 3 d 10 000 r min 冷 冻离心10 min 取上清液测定酶活 筛选产纤维素 酶最高的菌株 1 2 3酶活力测定测定方法参照文献 12 16 修 正得到 1 标准曲线绘制 反应的总体系为3 5 mL 1 mg mL葡萄糖溶液和去离子水共2 mL DNS试剂 1 5 mL 取10支试管编号分别为1 10 分别吸取0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 mL葡 萄 糖 溶 液至1 10号试管中 然后分别吸取2 0 1 8 1 6 1 4 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 mL去离子水至相应的 1 10号试管中 向1 10号试管中分别加入1 5 mL DNS试剂 将上述试管一同沸水浴5 min 冷却后稀 释至10 mL 在540 nm下用分光光度计测吸光值 绘制葡萄糖标准曲线 2 内切葡聚糖酶活力 CMCase activity CMCA 测定 取4支干净试管 编号 分别为1 4 后加入 1 5 mL底物溶液 并向1号试管中加入1 5 mL DNS 溶液以钝化其中的纤维素酶 作为空白对照 比色 调零 4支试管置于50 水浴中预热5 min 再加入 0 5 mL酶液 液体发酵液的离心上清液 50 水浴 30 min后立即向2 3 4号试管加入1 5 mL DNS溶 液以终止酶反应 充分摇匀后沸水浴5 min 取出冷 却后 加入去离子水定容至10 mL 充分混匀 以1 号试管为空白对照 540 nm测吸光值 2 3 4号3支 试管数值取平均值 3 滤纸酶活力 FPA 测定 方法同上 将底物溶 液换成1 mL缓冲液和50 mg滤纸 加入的酶液量为 1 mL 反应时间为1 h 4 葡萄糖苷酶活力 BGL 的测定 方法同上 将底物溶液换成1 5 mL含0 05 水杨苷的醋酸缓 冲液 反应时间为1 h 5 酶活定义 在上述条件下 1 mL粗酶液所产 生的1 g葡萄糖定义为一个酶活力单位 U 以上 的测定中均已扣除了粗酶液中所含有的还原糖量 1 2 4产纤维素酶菌株的鉴定 菌株的形态特 916 第5期 征 菌株平板培养2 3 d 观察菌落形态特征 菌体 形态经染色 革兰氏染色 鞭毛染色 芽孢染色等 后 于显微镜的100倍油镜下观察并照像 菌株 的生理生化特性 生理生化试验包括糖发酵试验 V P试验 甲基红试验 吲哚试验 柠檬酸盐利用试 验 淀粉水解试验 明胶水解试验等 1 2 5产酶条件的优化对复筛得到的菌株进行 产酶条件的优化试验 1 摇瓶生长曲线的测定 在基础培养基的基础 上 对复筛得到的菌株测定其在摇瓶培养中的生长 曲线和产酶曲线 考察菌体生长状况与菌株产酶能 力在时间上的相关性 2 接种量的确定 将培养12 h的种子液分别以 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 的接种量转接入30 250 mL产酶培养基中 置于37 180 r min摇床培养 测定酶活 考察不同接种量对菌株产酶的影响 3 培养基成分的优化 碳源种类对菌株产酶 的影响 分别以1 的CMC Na 葡萄糖 蔗糖 乳 糖 酵母膏 牛肉膏 酵母粉 麦芽浸粉 秸秆汁 米 糠作为碳源 摇瓶培养后测定酶活 考察碳源种类 对菌株产酶的影响 氮源种类对菌株产酶的影 响 分别以1 的 NH4 2SO4 NH4NO3 KNO3 蛋白胨 尿素 酵母膏 酪蛋白胨作为氮源 以1 葡萄糖作 为碳源 摇瓶培养后测定酶活 考察氮源种类对菌 株产酶的影响 NaCl浓度水平对菌株产酶的影 响 在原始液体产酶培养基的基础上分别加入 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 1 0 的NaCl 摇瓶培养后测定酶活 考察NaCl 浓度水平对菌株产酶的影响 底物 CMC Na 浓 度水平对菌株产酶的影响 在原始液体产酶培养基 的基础上分别加入0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 1 0 的CMC Na 摇瓶培养 后测定酶活 考察底物浓度水平对菌株产酶的影 响 根据上述试验得到的最适培养基组成 选取 L9 34 型正交表设计正交试验 试验因素和水平见 表1 以上清液酶活大小为指标 选择最优培养基组 成 2结果与分析 2 1纤维素酶产生菌的初筛 采用刚果红染色法从瓢虫肠道中分离纯化得 到16株透明圈较大的细菌 细菌编号及其D d值 分 别 为 B 1 6 167 B 35 5 667 B 11 5 000 B 19 4 750 B 9 4 000 B 26 3 750 B 37 3 000 B 27 1 833 B 53 3 000 B 47 2 714 B 36 2 667 B 42 2 571 B 32 2 500 B 46 2 429 B 12 2 083 B 10 1 420 2 2纤维素酶产生菌的复筛 对初筛得到的16株菌株进行摇瓶复筛 以 CMCA为指标 筛选出B 12 B 10 B 53 B 11等4 株产纤维素酶活力较高的菌株 CMCA 3次测定的 平均值 分别为76 85 68 85 53 94 71 27 U mL 菌 株B 12的CMCA最高 该菌株用以后续的试验 2 3DNS法葡萄糖标准曲线 葡萄糖标准曲线如图1所示 得到方程y 0 916 9x 0 110 4 r2 0 991 4 2 4菌株B 12的初步鉴定 2 4 1形态特征菌株B 12在牛肉膏蛋白胨琼脂 培养基上菌落较大 圆形 边缘整齐 不透明 乳白 色 微隆起 湿润 生长较快 显微镜观察细胞呈杆 状 两头稍平 周生鞭毛 革兰氏染色呈阳性 芽孢 椭圆形或柱状 中生或偏端生 芽孢囊不膨大 2 4 2生理生化特征V P反应为阴性 吲哚反应 甲基红反应为阳性 该菌株可利用葡萄糖产酸 能 水解淀粉 分解明胶 不能利用柠檬酸盐 结合形态 特征和生理生化特征 参考 伯杰细菌鉴定手册 第 八版 将菌株B 12鉴定为芽孢杆菌属 Bacillus sp 2 5产酶条件的优化 2 5 1摇瓶生长曲线的确定在原始培养基基础 上从发酵开始至72 h 连续取样 在600 nm下测定 生物量 离心后取上清液测定酶活 得到与时间相 关的该菌株的生长曲线以及产酶曲线 图2 图3 由图2 图3可知 在3 h左右菌株进入对数生长 表1正交试验因素和水平 水平 1 2 3 麦芽浸粉 0 75 1 00 1 25 KNO3 0 5 1 0 1 5 NaCl 0 1 0 2 0 3 CMC Na 0 1 0 2 0 3 因素 1 8 1 6 1 4 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 0 2 OD540 0 00 51 01 52 0 葡萄糖 mg 图1葡萄糖标准曲线 阮周波等 纤维素酶产生菌的筛选 鉴定和产酶条件优化917 湖北农业科学2011年 期 16 h左右菌株生长开始进入稳定期 44 h 以后 开始进入衰亡期 CMCA FPA BGL开始时增长较 为缓慢 CMCA BGL在44 h时达到最大值 FPA 在 47 h时达到最大 综合考虑将最佳培养时间定为44 h 总体趋势表明菌株B 12的产酶能力与菌体生长 状况有耦连相关性 在44 h时CMCA为102 694 U mL FPA为7 187 U mL BGL为14 593 U mL 2 5 2不同接种量对菌株酶活力的影响不同接 种量对菌株酶活力的影响结果见图4 综合考虑 在 接种量为6 时3个酶活指标 均较高 CMCA为 73 901 U mL FPA为8 232 U mL BGL为7 140 U mL 因此最佳接种量选择6 2 5 3不同碳源对菌株B 12酶活力的影响碳源 对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞碳架 细 胞生命活动所需的能量以及合成产物的碳架 根据 微生物所能产生的酶系不同 不同的微生物可利用 的碳源不同 在产酶培养基的基础上改变不同的碳 源检测菌株B 12的产酶情况 由图5可知 不同种 类的碳源对菌株产纤维素酶影响不同 其中麦芽浸 粉 作 为 碳 源 时3个 酶 活 指 标 均 较 高 CMCA为 74 592 U mL FPA为6 778 U mL BGL为7 667 U mL 因此确定麦芽浸粉作为菌株B 12的产酶培 养基的适宜碳源 2 5 4不同氮源对菌株酶活力的影响氮源是合 成菌体蛋白质 核酸及其他含氮化合物的重要组成 成分 不同种类的氮源对菌株的产酶影响结果见图 6 当KNO3作为氮源时 3个酶活指标均较高 CMCA为230 080 U mL FPA为101 636 U mL BGL为93 009 U mL 因此确定该菌株的产酶培养 基的适宜氮源为KNO3 图 6 2 5 5NaCl浓度对菌株酶活力的影响试验设置 了0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 1 0 等10个NaCl浓度梯度 在不同NaCl浓 度下测定纤维素酶的3个酶活指标 由图7可知 当NaCl浓度为0 2 时 CMCA活性最高 为75 137 U mL FPA和BGL活性相对较高 分别为5 533 U mL和7 485 U mL 因此 NaCl浓度为0 2 时菌 株B 12的酶活较大 2 5 6底物 CMC Na 含量对菌株酶活力的影响 试验测定CMC Na不同添加量 0 1 0 2 0 3 10 8 6 4 2 0 OD600 01020304050607080 培养时间 h 图3菌株B 12的产酶 FPA BGL 曲线 140 000 120 000 100 000 80 000 60 000 40 000 20 000 0 000 OD600 CMCA 图2菌株B 12的摇瓶生长曲线和产酶 CMCA 曲线 30 000 25 000 20 000 15 000 10 000 5 000 0 000 FPA U mL CMCA U mL 20 000 18 000 16 000 14 000 12 000 10 000 8 000 6 000 4 000 2 000 0 000 BGL U mL 01020304050607080 培养时间 h FPA BGL 图4接种量对菌株B 12酶活力的影响 80 000 70 000 60 000 50 000 40 000 30 000 20 000 10 000 0 000 CMCA U mL 20 000 18 000 16 000 14 000 12 000 10 000 8 000 6 000 4 000 2 000 0 000 FPA BGL U mL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 接种量 CMCAFPABGL 80 000 70 000 60 000 50 000 40 000 30 000 20 000 10 000 0 000 酶活 U mL CMC Na 蔗糖 乳糖 葡萄糖 牛肉膏 酵母膏 酵母粉 麦芽浸粉 秸秆汁 米糠 碳源 CMCA FPA BGL 图5不同碳源对菌株B 12酶活力的影响 图6不同氮源对菌株B 12酶活力的影响 250 000 200 000 150 000 100 000 50 000 0 000 酶活 U mL 蛋白胨 尿素 NH4 2SO4 酵母膏 KNO3 NH4NO3 酪蛋白胨 氮源 CMCA FPA BGL 918 第5期 表2正交试验结果 CMCA FPA BGL 试验 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 x1 x2 x3 R x1 x2 x3 R x1 x2 x3 R 麦芽浸粉 1 1 1 2 2 2 3 3 3 21 793 47 799 123 052 101 259 11 071 12 465 16 549 5 478 19 273 26 447 53 106 33 833 KNO3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 57 033 73 320 62 292 16 287 12 489 9 144 18 451 9 307 23 732 17 576 57 517 39 941 NaCl 1 2 3 2 3 1 3 1 2 71 841 53 010 67 794 18 831 13 252 19 081 7 751 11 330 27 465 51 604 19 757 31 847 CMC Na 1 2 3 3 1 2 2 3 1 66 000 66 655 59 989 6 666 21 020 10 211 8 853 12 167 53 397 30 906 14 522 38 875 CMCA 24 023 22 133 19 224 25 186 62 268 55 942 121 889 135 558 111 710 FPA 17 748 9 423 6 042 12 804 10 296 14 295 6 915 7 714 35 017 BGL 25 041 20 533 12 244 17 479 18 352 43 509 28 676 13 844 116 799 因素试验结果 U mL 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 1 0 时菌株 B 12的产酶水平 由图8可知 当CMC Na浓度达 到0 2 时 CMCA活性最高 为90 043 U mL FPA 和BGL活性相对较高 分别为7 287 U mL和7 213 U mL 表明菌株B 12适宜底物 CMC Na 浓度为 0 2 2 5 7最适培养基组成确定选取L9 34 型正交表 设计正交试验 以上清液酶活大小为指标 选择最 优培养基组成 对正交试验结果进行极差分析 表 2 可以发现对于CMCA酶活而言 主要因素的影响 顺序为 麦芽浸粉 NaCl KNO3 CMC Na 最佳组合 为 1 25 麦芽浸粉 1 0 KNO3 0 1 NaCl 0 2 CMC Na 对于FPA酶活 主要因素的影响顺序为 CMC Na NaCl KNO3 麦芽浸粉 最佳组合为 1 25 麦 芽 浸 粉 1 5 KNO3 0 2 NaCl 0 1 CMC Na 对于BGL酶活 主要因素的影响顺序为 KNO3 CMC Na 麦 芽 浸 粉 NaCl 最 佳 组 合 为 1 25 麦芽浸粉 1 5 KNO3 0 2 NaCl 0 1 CMC Na 综合考虑 最终确定最佳培养基配方为 1 25 麦芽浸粉 1 5 KNO3 0 2 NaCl 0 1 CMC Na 此 时 CMCA FPA 和BGL分 别 为111 710 U mL 35 017 U mL和116 799 U mL 较菌株培养44 h时 的酶活分别提高了8 78 387 23 和700 38 3讨论 利用刚果红平板法初筛得到的透明圈比值大 的菌株 其酶活并不一定高 试验中我们发现菌株 B 1的透明圈比值高达6 167 而菌株B 12的透明 圈比值仅为2 083 但从摇瓶发酵复筛结果看 菌株 B 12的酶活要高于B 1的 因此 在筛选纤维素酶 高产菌株时 摇瓶发酵复筛是必要的 我们首次从马铃薯瓢虫肠道中分离得到多株 产纤维素酶肠道菌并筛选到1株酶活性较高的菌 株B 12 产酶条件经优化后 其CMCA为111 710 U mL FPA为35 017 U mL BGL为116 799 U mL 而采用同样的酶活测试方法 林祥木等 17 从土壤中 分离得到的最好的菌株其CMCA为36 U mL FPA 为31 U mL BGL不足41 U mL 昆虫是地球生物圈 中已知种类最多的一群生物 18 19 昆虫种类 数量及 分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性 20 研究表明昆虫肠道菌是微生物新种的潜在资源 21 22 因此 昆虫肠道菌可能是新高产纤维素酶的广泛来 源 而从昆虫肠道菌分离产纤维素酶菌还鲜有报 道 亟待研究开发 参考文献 1 TOMME P WARREN R A J GILKES N R Cellulose hy drolysis by bacteria and fungi J Advances in microbial phys iology 1995 37 1 1 81 2 李燕红 赵辅昆 纤维素酶的研究进展 J 生命科学 2005 17 4 392 397 3 张大羽 诸永 程家安 黄胸散白蚁和台湾白蚁不同品级虫体 80 000 70 000 60 000 50 000 40 000 30 000 20 000 10 000 0 000 CMCA U mL 16 000 14 000 12 000 10 000 8 000 6 000 4 000 2 000 0 000 FPA BGL U mL 0 00 20 40 60 81 0 NaCl浓度 CMCAFPABGL 图7NaCl浓度对菌株B 12酶活力的影响 图8CMC Na含量对菌株B 12酶活力的影响 100 000 90 000 80 000 70 000 60 000 50 000 40 000 30 000 20 000 10 000 0 000 CMCA U mL 20 000 18 000 16 000 14 000 12 000 10 000 8 000 6 000 4 000 2 000 0 000 FPA BGL U mL CMCAFPABGL 0 00 20 40 60 81 0 CMC Na浓度 阮周波等 纤维素酶产生菌的筛选 鉴定和产酶条件优化919 湖北农业科学2011年 责任编辑应 梅 上接第914 页 与增产效果相比 施肥的经济效应是科学施肥 技术能否得到大面积推广的一个更为重要的指标 本研究结果显示 若以试验年份各试验点小麦及氮 肥的平均价格计算 不同施氮水平下每公顷小麦施 氮的纯利润平均为2 536 3 839元 产投比在3 0 7 7之间 若以产投比2 0作为是否推荐施氮的临界 点 则湖北省95 7 小麦地需推荐施用氮肥 在小麦生产中 除产量和经济效益外 氮肥利 用效率也是衡量施氮是否合理的一个重要指标 12 在山东 河北 江苏等我国小麦主产省份的研究结 果表明 小麦的氮素农学效率为8 0 kg kg 7 明显低 于本研究的14 4 kg kg 产生此差异的原因可能是 氮肥施用量的不同引起 这也说明适宜的氮用量能 实现小麦产量 经济效益及氮素利用效率的协同提 高 5 参考文献 1 高春保 朱展望 刘易科 等 湖北省小麦增产潜力分析和2009 年小麦秋播的主要技术措施 J 湖北农业科学 2009 48 10 2374 2376 2 石江荣 任永康 王芳 氮素营养对超高产小麦调控的研究进 展 J 山西农业科学 2010 38 3 80 82 3 范亚宁 李世清 李生秀 两种种植密度下施肥对冬小麦生物学 性状及产量的影响 J 植物营养与肥料学报 2008 14 3 463 471 4 石玉 于振文 王东 等 施氮量和底追比例对小麦氮素吸 收转运及产量的影响 J 作物学报 2006 32 12 1860 1866 5 叶优良 黄玉芳 刘春生 等 氮素实时管理对冬小麦产量和氮 素利用的影响 J 作物学报 2010 36 9 1578 1584 6 刘学军 赵紫娟 巨晓棠 等 基施氮肥对冬小麦产量 氮肥利用 率及氮平衡的影响 J 生态学报 2002 22 7 1122 1128 7 张福锁 王激清 张卫峰 等 中国主要粮食作物肥料利用率现 状与提高途径 J 土壤学报 2008 45 5 915 924 8 鲍士旦 土壤农化分析 M 第三版 北京 中国农业出版社 2000 9 金继运 李家康 李书田 粮食作物对化肥的需求分析 J 磷肥 与复肥 2006 21 3 1 6 10 陈新平 周金池 王兴仁 等 小麦 玉米轮作制中氮肥效应模 型 的 选 择 经 济 和 环 境 效 益 分 析 J 土 壤 学 报 2000 37 3 346 354 11 宇万太 赵鑫 张璐 等 长期施肥对作物产量的贡献 J 生态学杂志 2007 26 12 2040 2044 12 王旭 李贞宇 马文奇 等 中国主要生态区小麦施肥增产效 应分析 J 中国农业科学 2010 43 12 2469 2476 责任编辑应 梅 内纤维素酶的活性 J 浙江大学学报 农业与生命科学版 2001 27 1 1 4 4 邱雁临 纤维素酶的研究和应用前景 J 粮食与饲料工业 2001 8 30 31 5 乞永立 耿月霞 任