甲状旁腺素相关蛋白资料.pdf

生物工程进展 1997 V ol 17 No 4 甲状旁腺素相关蛋白及其临床意义 张 莉 王 学 卢圣栋 审阅 中国科学院微生物研究所 北京 100080 中国医学科学院基础医学研究所 北京 100005 甲状旁腺素相关蛋白 Parathyroid Hor mone Related Protein PT HrP 最早发现于恶 性肿瘤致体液性高钙血症 Humoral Hypercal cemia of Malignancy HHM 患者的血浆中 1 具有与甲状旁腺激素 Parathyroid Hormone 相似的生物活性 是引起 HHM 的体液因素之 一 临床上高钙血症表现为无食欲 恶心 多尿 精神异常 甚至昏迷 一般多出现在癌症末期 严重影响预后 肿瘤患者中约有 10 伴发高钙 血症 其中80 属于非骨转移引起的 HHM 几 乎在全部伴有 HHM 的肿瘤患者的血浆中都能 检测到 PT HrP 2 所以 近年来人们对 PT HrP 的研究越来越重视 一 PTHrP 的发现史 在研究 HHM 的同时 发现引起HHM 的主 要因子之一是PTHrP 早在20年代初期人们就 发现并承认有 HHM 的存在 但当时认为它是由 于癌细胞骨转移 破坏了骨结构 使钙释放到血 液中引起的 此后 越来越多的病例表明 没有发 生骨转移的肿瘤也可以产生高钙血症 而切除肿 瘤组织可以使高血钙症状消失 1941 年 Fuller Albright 提出有些肿瘤能分泌甲状旁腺激素或 具有类似功能的物质来引起体液性高钙血症 60 年代 有两种引起 HHM 的机制被接受 一是癌 细胞直接作用使局部溶骨引起的 另一个则是远 离骨的恶变细胞分泌一种物质的作用下导致骨 吸收而产生的 到了 70 年代 人们对引起 HHM 因子的研究给予了高度的重视 提出引起 HHM 的可能因子有维生素 D 类似物 前列腺 E 系列 和 PTH 及其受体 虽然这个时期的报道互有矛 盾 但在目前看 这些因子只是引起很少的个别 病例的 HHM 而从绝大多数具有HHM 的血液 或肿瘤细 胞提取出 了一种 PT H 样物 质 PTHrP 3 在对PTHrP 的研究过程中 发现鳞 状细胞癌 泌尿系统癌 乳腺癌 卵巢癌等肿瘤组 织都能产生 PT HrP 4 二 PTHrP 的基因结构及其在体内的存在 形式 1988 年 Margin 等人用 southern blot 确 定人 PT HrP 基因是位于 12 号染色体短臂 12p12 1 11 2 的单拷贝基因 5 与位于11 号染 色体的PTH 基因位置相同 由于 11 号和 12 号 染色体短臂来源于进化过程中的基因重组 所 以PT H 和PTHrP 的N 末端具有同源性 但是 与 PT H 基因相比 PT HrP 基因是一个更复杂 的转录单位 至少由 6 个外显子组成 经过可变 剪切 Alternative splicing 可以产生三种成熟 的 mRNA 鼠 牛等物种中没有外显子 5 只产 生一种 PT HrP mRNA 6 人的肿瘤或正常组 织对 PT HrP mRNA 进行组织特异性的转录调 节和转录后加工 产生一至二种转录产物 分子 量约 18KDa 转录产物除了共同拥有一段 36 个氨基酸的前体原序列 prepro sequence 外 成熟的 PTHrP 分别长为 139 141 和 173 个氨 基酸 与 PT H 同源的N 末端决定了PTHrP 的 生物活性 去掉 N 末端两个氨基酸能极大地降 低 PT HrP 激 活 腺 苷 酸 环 化 酶 的 功 能 1 PTHrP 35 111 有多个蛋白水解位点 两个酰 胺化位点和多个 O 糖基化位点 是一个高度保 守域 在不同物种中差异极小 表明 PT HrP 可 能具有目前仍未知的更重要的功能 112 氨基 酸之后的序列在不同物种中差异很大 低等生 23 物中只有 139个氨基酸 人的 PT HrP 还有第 5 外显子转录的 141 173 氨基酸 人的不同组织 的表达产物可能与该组织的进化程度有关 三 PTHrP 的作用及其与甲状旁腺激素的 关系 PT HrP 可以与甲状旁腺激素受体结合 除 了 N 末端 13 个氨基酸中有 8 个氨基酸与PTH 相同外 PT HrP 在一级结构上与 PT H 完全不 同 所以绝大部分 PTHrP 抗血清不与 PT H 反 应 这种有限的同源性已经足够使 PTHrP 结 合于细胞膜上的 PT H 受体 与 PTH 一样 激 活腺苷酸环化酶 Adenylyl cyclase 刺激肾源 性 cAMP 形成 调节骨和肾的钙磷代谢 促进 骨基质再吸收释放出钙盐 抑制骨合成 钙由骨 进入血液 正常情况下 机体通过肾脏排出过多 的钙 血钙浓度降低时引起甲状旁腺合成和释 放 PTH PT H 作用于其受体 又使血浆钙浓度 恢复正常 所以 在正常人中 PTH 对维持血钙 平衡起主要作用 据报道 在正常人体中例如骨 肾 血管 胎 盘 胰腺 心脏 肺 子宫 脑等组织也可表达 PT HrP 或 PT HrP mRNA 但是正常人血浆中 的 PTHrP 浓度很低 很难检测出来 PT HrP 在 人体内一般以自分泌和 或旁分泌方式作用于 PT H 靶 器 官 如 胃和 子 宫 等 局部 产 生 的 PT HrP 可以使这些器官的平滑肌舒张 只有以 下几种情形下 在血浆中能检测到 PT HrP 1 HHM 患者的肿瘤细胞分泌 PT HrP 作用于 骨和肾 2 哺乳期妇女的乳腺分泌 PTHrP 到 体循环中影响骨合成 可能也有调节乳汁分泌 的 作 用 3 在 胎 儿 期 胎 甲 状 旁 腺 合 成 PT HrP 可能调节母婴间钙运输 胎盘的钙转 移 4 还有一种情况是慢性肾功能不全患者的 血浆中 PT HrP C 末端的堆积 可能是因为正 常的肾有代谢 PT HrP 的功能 而肾功能不全 导致 PT HrP 代谢障碍 移植了人肾癌细胞的 裸鼠分泌 PTHrP 并发生高钙血症 7 HHM 患 者尿中 cAMP 和 1 25 二羟维生素 D 的浓度增 加 钙滤过减少或近曲小管钙吸收增加 血中 钙 磷代谢异常 发生高血钙 6 Benitez 等的实 验表明 在 HHM 动物模型中 PTHrP N 末端 能刺激 DNA 合成 而 PT HrP 1 34 的中和抗 体能抑制肿瘤的生长 四 PTHrP 的检测及清除 测定人体内 PT HrP 的浓度有助于了解 HHM 的病理特征和 PT HrP 在病理和生理上 的作用 PT HrP 的生物活性就目前所知集中在 N 末端 从理论上说 N 末端或完整的 PTHrP 最能反应其病理 生理特点 且测定值不受肾功 能的影响 但是PTHrP N 末端半衰期短 数量 少 标本不易保存 很难测到正常人血浆中 PTHrP 浓度 C 末端在血液中存在时间较长而 且稳定 可以得到 PTHrP 的正常值 但是 C 末 端 PTHrP 的浓度受肾功能的影响 肾功能异 常的病人血浆 PTHrP 109 138 浓度增高 10 倍 而 PTHrP 1 74 浓度正常 推测是 PTHrP 在正常人时进入血液循环被肾脏代谢掉 而肾 功能异常导致 C 末端片段的堆积 6 有些实验 室发现中段 PTHrP 的浓度高于 N 末端 几种 肿瘤组织在体外培养中分泌的 PT HrP 中段 Ala 38之后 与 HHM 患者体内的 PTHrP 中段 相同 8 Care 等人认为中段 PT HrP 与胎盘钙 转移有关 9 Burtis 等人用抗体双位点免疫放射法 IR MAs 测定 PTHrP 1 74 和 PTHrP 1 86 8 以 及放免法 RIA 测定 C 端 109 138 但是该方 法受体内其它因子影响较大 如肾源性 cAMP Brandt 10 Rabbani 1 Henderson 13 等人也分 别用放免法测定了 PT HrP N 端肽段 但是这 种测定方法步骤繁琐 灵敏度低 不宜测正常人 血浆 PTHrP 浓度而未能在临床上推广使用 由 Daiichi 放射同位素实验室开发的免疫药盒 D0102 是利用抗 PTHrP 109 141 抗体来测 定 PTHrP C 端的放免法 能测定尿及乳汁的 PTHrP 由于其灵敏度高 特异性强 国外已应 用于临床及生理作用的研究 11 治疗肿瘤相关的高钙血症 降低血钙浓度 主要有以下两种途径 1 当前临床上常用的第 24 二代二磷酸盐类化合物 如二磷酸丙烯羟胺 二 氯甲叉二磷酸是破骨细胞抑制剂 抑制骨吸收 直接降低血钙浓度 2 作用于引起高钙血症的 细胞因子或细胞因子受体的药物 Broadus 等人根据 PTHrP 的氨基酸序列 合成 1 36 肽 在体内和体外实验中均可以升高 1 25 二羟维生素 D 的浓度 与天然 PTHrP 活 性相同 7 Ratcliffe 等人用人工合成的 PT HrP 1 34 作抗体 得到 5 株高亲和力 Ka 4 10 10 1 9 1011L M 的人 PT HrP 单克隆抗体 由 于 PTHrP N 端在物种间高度保守 人 PT HrP 1 34 单抗可以识别各种来源的天然 PT HrP 甚至与牛PTHrP 也发生中和反应 12 Hender son 等人给 HHM 大鼠和对照大鼠分别注射 PT HrP 1 34 抗体和 PT H 1 84 抗体进行被 动免疫 几小时后 HHM 大鼠的血浆钙浓度降 至正常 而且能保持几天 注射 PT H 抗体的对 照组有轻微和短暂的低钙血症 对肾远曲小管 无 影响 13 Burton 等人用多克隆抗血清对 SKRC 1 细胞分泌的 PT HrP 进行免疫中和 可 以 抑 制 该 肿 瘤 细 胞 的 生 长 14 Benitez Vergnizas 等人报道 PT HrP 1 34 的中和抗体 能抑制 HHM 动物的肿瘤的生长 降低血浆钙 浓度 15 这些实验表明 PT HrP 是产生 HHM 的主 要因素之一 天然的和人工合成的 PTHrP 具 有相同的生物功能 合成的 PT HrP 产生的抗 体也可以降低血浆钙浓度 抑制肿瘤生长 提示 PRHrP 中和抗体是治疗肿瘤相关的高钙血症 的有效途径之一 近年来发展起来的人源噬菌 体抗体库克服了人 鼠杂交瘤单克隆抗体或多 克隆抗体具有免疫原性和人 人杂交瘤建株难 不稳定的缺点 成为抗体工程方面的一大突破 我们用人工合成的 PT HrP 从人源噬菌体抗体 库中经过多次免疫亲和 洗脱 扩增 筛选到高 亲和力的中和抗体 在体外和体内实验中可以 和天然 PTHrP 发生免疫中和反应 为从人源 噬菌体抗体库中筛选 PTHrP 中和抗体用以临 床治疗高钙血症打下了基础 参考文献 1 Rabbani SA Mitchell J Roy DR et al Endoctinology 1988 123 2709 2716 2 Stewart AF Horst R Deftos LJ et al N Eng J M ed 1980 303 1377 1381 3 Moseley JM Kubota M Diefenbach Jagger H et al Proc Natl Acad Sci U SA 1987 84 5048 52 4 T abuenca A Mohan S Garberog lio CA et al World J Surg 1995 M ar Apr 19 292 297 5 Mangin M Ikeda K Dreyer BE et al Proc Natl Acad Sci U SA 1989 86 2408 2412 6 Burtis WJ Brady TG Orloff JJ et al N Engl J M ed 1990 322 1106 1112 7 Broadus AE M angin M Insogna KL et al N Engl J Med 1988 319 556 563 8 Brutis WJ Clin Chem 1992 38 2171 2183 9 Care AD Abbas Sk Pickard DW et al Q J Exp Physi ol 1990 75 605 608 10 Brandt DW Burton DW Gazdar AF et al Endocrinolo gy1991 129 2466 2470 11 Orloff JJ Soifer N Dann P et al Kidney Int 1993 43 1371 1376 12 Ratcliffe WA Hughes S Gilligan M G et al J Im munol M ethods 1990 127 109 116 13 Henderson J Bernier S D amour P et al Endocrinol 1990 127 1310 1318 14 Burton PB Moniz C Knight DE et al Biochem Bio phy Res Commun 1990 167 1134 1138 15 Benitez Verguizas J 198 1281 1289 下转第 13 页 25 属离子价数和强度的关系 早有人以质子泵效 率为指标 进行了有关的研究 研究结果表明 金属离子的价数和强度将对质子泵效率产生影 响 3 本实验结果与该研究结果较为相似 在与 离子强度的关系上 两者都呈非线性关系 在与 离子价数的关系上 两者都随离子价数的提高 其响应峰值的位置向低浓度发展 鉴于离子浓 度只影响 H 的产率 而不影响菌紫质光循环 M 态的产量 4 因此 本实验和 质子泵效率 的实验从不同的角度说明了 菌紫质的质子迁 移 光循环等与金属离子的价数和强度有关 本研究结果还将为菌紫质光电池的设计 和以菌紫质为基础的视觉功能模拟和人工视觉 研究提供有价值的数据 参考文献 1 D oesterhelt W stodeenius Methods Enzymol 1974 31 667 678 2 王敖金等 薄膜科学与技术 1993 4 342 345 3 施桦等 生物物理学报 1992 8 2 221 225 4 Donald R Ort et al Biophysical Journal 1979 25 341 354 Nonlinear relation of photovoltage of artificial bacteriorhodopsin membrane with ionic strength Zheng Guohe Wang Aojing Hu Kunsheng Yang Jianhua Lin shuhuang Institute of Bionphyicas Academia Sinica Beijing 100101 Institute of Biological Information Capital Normal University Beijing 100037 Abstract T he effect of ionic strength on the photovoltage from artificial bacteriorhodopsin bR membrane was studied here T his paper verified that the photovoltage nonlinearly changes with the ionic strength and that the location corresponding to the maximum of photovoltage shifts toward lower concentration with increase of ionic valence T he results will provide the sig nificant data for studies of photocycle and H translation the design of the bR photoelectric cell and the studies of artificial visual functions artificial vision Key words bacteriorhodopsin artificial membrane photovoltage H translation 接第 25 页 Parathyroid Hormo