（发酵工程专业论文）胆固醇氧化酶的分离纯化及酶学性质的研究.pdfVIP

摘要 为了应用胆固醇氧化酶来降解和转化食品中的胆固醇，以本实验室筛选的青霉t s 4 0 6 菌 株为对象，从诱变育种、胆固醇氧化酶的提纯、胆固醇氧化酶的酶学性质、胆固醇氧化酶 降解蛋黄胆固醇等方面进行了研究。 青霉t s 4 0 6 是一株产生胞外胆固醇氧化酶的菌株，在理化因子单因素诱变的基础上， 通过紫外线联合硫酸二乙酯( 浓度3 ) 和紫外线联合亚硝基胍( 1 2 m g m 1 ) 两次连续复合诱 变，获得了一株高产型突变株，其产酶活力从5 4 6 u l 提高到了1 2 6 7 u l ，酶活提高了2 7 3 ， 并利用s p s s 软件分析证明了突变菌株的产酶稳定性。 通过硫酸铵盐析，s e p h a d e xg 一7 5 凝胶层析，d e a e - s e p h a d e xa 5 0 离子交换层析等方法 分离提纯了菌株t s 4 0 6 产生的胆固醇氧化酶( c o d ) ，其比活力为1 6 0 6 8 u m g ，采用s d s - 聚丙 烯酰胺凝胶电泳测得该胆固醇氧化酶的分子量为3 0 k d ，并且证明了该胆固醇氧化酶为单一 的肽段。 在不同条件下测定胆固醇氧化酶的活性，得到胆固醇氧化酶的最适反应温度为4 5 。c ， 最适p h 值为7 5 ，在4 0 。c 的条件下能够稳定保藏，在不同的反应时间对胆固醇的氧化降 解反应呈现不同的规律，反应的k m 值为5 0 1 0 一。 将胆固醇氧化酶与蛋黄反应，发现作用2 4 t j 、时后蛋黄胆固醇的降解率达到3 3 8 。 关键词：胆固醇氧化酶；分离纯化；凝胶电泳 a b s t r a c t i no r d e rt od e g r a d ea n dt r a n s f o r mt h ec h o l e s t e r o li nf o o ds t u f f , t h es t r a i np e n i c i l l i u m s p t s 4 0 6 ，w h i c hs e c r e tc h o l e s t e r o lo x i d a s ei nf e r m e n t e dc u l t u r i n g ，w a sm u t a t e db yc o m p l e x m u t a g e n e s i s ，c h o l e s t e r o lo x i d a s ew a s i s o l a t e da n d p u r i f i e d ，t h ep r o p e r t ya n d t h ea p p l i c a t i o nt o e g gy o l ko ft h ee n z y m ew a ss t u d i e d t h r o u g hd e s ( 3 ) c o m b i n i n gu vm u t a t e ，h i g h e rp r o d u c t i v i t ys t r a i nw a ss c r e e n e do u t ，t h e n w a st r e a t e db yn t g ( 1 2 m g m 1 ) c o m b i n eu v ，am u t a n t ，n a m e dp e n i c i l l i u mn 81s h o w e dh i g h e s t p r o d u c t i o no fc h o l e s t e r o lo x i d a s e ，w a so b t a i n e d ，t h ee n z y m ea c t i v i t yo ft h es t r a i nw a si n c r e a s e d f r o m5 4 6 u lt o12 6 7 u l g e n e t i cs t a b i l i t yo ft h em u t a t e ds t a i nn 81w a st e s t i f i e dt h r o u g hs p s s a n a l y s i s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h es t r a i nn 8 1i ss t a b l ei np r o d u c i n gc h o l e s t e r o lo x i d a s e 砀ec h o l e s t e r o lo x i d a s ew a si s o l a t e da n dp u r i f i e df r o mt h eb r o t ho fs t r a i nt s 4 0 6b y s e p h a d e xg 一7 5g e lf i l t r a t i o na n dd e a e s e p h a d e xa 一5 0 t h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m ew a s 16 0 6 8 u m g s d s - p a g es h o w e dt h a tc h o l e s t e r o lo x i d a s ec o n s i s to fas i n g l ep e p t i d ec h a i n t h ea c t i v i t yo ft h ec h o l e s t e r o lo x i d a s ew a sd e t e c t e da td i f f e r e n tr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo f t h ee n z y m er e a c t i o ni s4 5 ，a n dp h7 5 ， c h o l e s t e r o lo x i d a s ei ss t a b l ea tt h et e m p e r a t u r el o w e rt h a n4 0 c ，t h ek i n = 5 o x l 0 t h ee g gy o l kw a st r e a t e dw i t hc h o l e s t e r o lo x i d a s e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc h o l e s t e r o li s o b v i o u sr e d u c i n gb y3 3 8 a f t e r2 4h o u r s k e yw o r d s ：c h o l e s t e r o lo x i d a s e ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；g e le l e c t r o p h o r e s i s 科研情况说明以及学位论文使用授权声明 科研情况说明以及学位论文使用授权声明 一、论文发表情况 1 胆固醇氧化酶产生菌t s 4 0 6 的复合诱变育种( 食品科技2 0 0 8 2 ) 2 胆固醇氧化酶的分离纯化及酶学特性研究 二、参与课题情况 研究生期间参与天津市自然科学基金研究项目( 编号：0 5 y f j m j c 0 6 1 0 0 ) “霉 菌t s 4 0 6 转化胆固醇机理的研究 。 学位论文使用授权声明 本人同意授权天津商业大学将论文的全部内容或部分内容提供给有关方 面，编入中国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库、 天津商业大学博硕士学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，并采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和磁盘。 1 毒酮 第一章前言 1 文献综述 第一章前言 1 1 胆固醇及其生理功能 胆固醇是自然界存在最丰富的甾醇化合物，是人体的重要脂类物质之一【l 】，它在神经 组织和肾上腺中含量特别丰富，约占脑固体物质的1 7 t 2 1 。动物组织中的主要胆固醇是两 亲性的，具有一个极性头的基团( 在c _ 3 位上的羟基) 和一个非极性的烃结构( 甾核和 在卜1 7 位上的烃侧链) ，该物质的分子结构如下图。 h 胆固醇在人体内具有重要的生理功能，具体表现在：( 1 ) 胆固醇是细胞膜的重要组成成 分，胆固醇两亲性的特点可能对生物膜的透性有一定的调节作用。( 2 ) 胆固醇是内分泌 腺合成类固醇激素的原料。( 3 ) 胆固醇可在人体内形成7 一脱氢胆固醇，经紫外线照射， 可转变成维生素d 3 。( 4 ) 胆固醇形成的胆酸盐可以乳化脂肪，促进脂肪的消化。( 5 ) 胆 固醇有助于血管壁的修复和保持完整【2 ，3 】。 尽管胆固醇为人体所必需，但在体内过量时也会造成危害，流行病学的观察也同样得 出结论，胆固醇过量与严重的威胁着人类健康和生命的动脉硬化、冠心病、脑中风等心脑 血管疾病有密切的关系，除此之外，胆固醇过多也易引起胆结石等疾病，人体内的胆结石 几乎都是由胆固醇构成的【4 j 。 人体血液中的胆固醇有两种来源：一种是内源性胆固醇，由人体合成，调节胆固醇的 含量稳定；另一种来源是直接来自食物( 如黄油，猪肝，蛋黄等) 中的胆固醇，且p # i - 源性 胆固醇，当摄入的胆固醇超过人体对胆固醇的代谢调节能力时，胆固醇在体内大量积累， 最终会导致心血管疾病的发生。国内外大量的研究资料证实，膳食因素与心血管疾病的发 生关系密切，控制和减少膳食中胆固醇的摄入量，对降低胆固醇水平，预防心血管疾病至 关重要【5 j 。 为消除食物中过多的胆固醇对人体的危害，目前研究主要采用以下几种方法：( 1 ) 限 制食用胆固醇含量高的食物，或食用豆固醇、谷固醇、菜固醇含量高的食物以竞争性抑制 第一章前言 人体对食物胆固醇的吸收；( 2 ) 用物理、化学方法去除食品原料中的胆固醇；( 3 ) 用微生 物转化法降低食品中的胆固醇【6 一，主要是利用微生物代谢产生的酶来转化食品中的胆固 醇。 利用物理或化学法处理食品，降低其胆固醇的含量已有一些报道【8 d 2 1 。但近年来随着 酶法转化食品中胆固醇的研究，发现这种方法具有不干扰人体代谢，不影响食品风味，特 异性较高，副作用小等优点，另外，一些研究证明胆固醇氧化酶氧化胆固醇的产物胆甾- 4 - 烯一3 酮有预防治疗肝病【1 3 】和抗肥胖的作用【1 4 - 16 1 。 1 2 胆固醇氧化酶的来源 胆固醇氧化酶由数种微生物产生，目前在动植物和真核生物中还报道极少。 自t u m i t t 1 7 。1 9 】首次发现n o c a r d i ae r y t h r o p o l i s 产生胆固醇氧化酶以后，人们开始着手 于胆固醇氧化酶的研究。陆续发现了多种微生物均能产生胆固醇氧化酶，s c h a t 等人从分枝 杆菌中分离出胆固醇氧化酶【2 0 】。s t a d t m a n 等人的研究阐明了该氧化酶氧化分解胆固醇的产 物是等摩尔的胆甾一4 烯一3 一酮和h 2 0 。【2 1 1 。从此，该酶在许多微生物中被分离到。研究比较 深入的产胆固醇氧化酶微生物包括：a r t h r o b a c t e r ( 节杆菌) ，c o r y n e b a c t e r i u m ( 棒状杆 菌) ，n o c a r d i ae r y t h r o p o l i s ( 红平诺卡氏菌) ，r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s ( 红平红球 菌) ，m y c o b a c t e r i u m ( 分支杆菌) ，p s e u d o m o n a s ( 假单胞菌) ，b r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u m ( 甾 短杆菌) ，r h o d o c o c c u ss p ( 红球菌) 和s t r e p t o m y c e ss p ( 链霉菌) 。 a r t h r o b a c t e r , r e q u i , n o c a r d i ae r y t h r o p o l i s , m y c o b a c t e r i u m 和n o c a r d i ar h o d o c h r o u s 产生的 胆固醇氧化酶都是细胞内或膜结合的酶，p s e u d o m o n a s , s c h i z o p y l l u mc o m m u n e , b r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u m ，s t r e p t o v e r t i c i l l i u mc h o l e s t e r o l i c u m ，和s t r e p t o m y c e s , v i o l a s c e n s 表达 的酶会分泌到培养基中，s c h i z o p y l l u mc o m m u n e , b r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u m ，和 s t r e p t o v e r t i c i l l i u mc h o l e s t e r o l i c u m 都需要f a d 作为辅基，此外，在酶的生物合成过程中受 各种各样的碳源的影响包括类固醇。碳源测试实验表明胆固醇是诱导该酶产生的最高效的 诱导物。 在已报道的胆固醇氧化酶产生菌中，r e q u i 展示了最高水平的胆固醇氧化酶活性，但 是它的高致病性限制了它的商业开发2 2 乏3 1 。s o j o 等人【2 4 1 的数据表明在适当的条件下，尼 e r y t h r o p o l 括在一个仅包括游离胆固醇和甘三油为碳源的矿物培养基中时，胆固醇能够显著 的诱导产生胆固醇氧化酶。这种酶开始是细胞内表达的，但是之后会进入到生长培养基中。 这种形式的诱导产生的胆固醇氧化酶在一周后会达到最大产量，研究还发现当在培养基中 加入t w e e n 一8 0 后能够促进胆固醇的溶解，从而增大胆固醇的诱导效应。另外，发现改变表 2 第一章前言 面活性剂的量，不会改变胞内酶和细胞外酶的比率。在这些研究路线中，作者们【2 4 】也检测 了来自于兄e r y t h r o p o l i s 中的胆固醇氧化酶的氧化产物的物理学特征。从胆固醇生长培 养基到胆固醇缺乏的培养基上的转移会导致胞外酶的迅速消失，与次同时胞内酶的以一种 较慢的速度减少。k r e i t 【2 5 】也研究- r h o d o c o c c u ss p g k l 胆固醇氧化酶产物的生成，并 且注意到在所确定的条件下，9 5 的添加的甾醇( 5 鲈) 将在4 天内被消耗掉。 r h o d o c o c c u ss p g k l ，一种分离自土壤的菌株【2 5 1 ，它能表达膜结合的和细胞外的胆固 醇氧化酶活性。学者们研究了这种细菌在以植物甾醇或己碳为唯一碳源矿物培养基中的生 长情况，并且发现了碳源与胆固醇氧化酶产量的联系。研究发现在这种条件下，膜结合的 胆固醇氧化酶被大量的诱导，活性超过了l o o u g 干重。 t a k a g ie ta 1 瞄】检测到了油酸对& 厶啤叫，“朋朋埘“玎p 细胞表面上胆固醇氧化酶氧化产 物的吸附作用。 1 。3 胆固醇氧化酶的基本性质 胆固醇降解代谢的第一步就是胆固醇的氧化，在自然界通常由胆固醇氧化酶来催化该 反应进行，胆固醇氧化酶在酶学分类中属于氧化还原酶类，另外根据保守性和序列比较胆 固醇氧化酶应归属于葡萄糖一甲醇一胆碱( g m c ) 氧化还原酶类，有些胆固醇氧化酶以一分 子f a d 作为辅基，胆固醇发生氧化的基团为c 3 碳原子上的i b 一羟基，羟基氧化脱氢后产生 的氢原子经某种方式传递给受体一分子氧，形成过氧化氢，同时，胆甾一5 烯一3 酮异构化形 成胆甾一4 烯- 3 - 酮。该酶有较广的类固醇特异性，但其空间特异性却一定要求存在31 3 羟 基。 胆固醇氧化酶是单体酶，只有一条多肽链，分子量在3 0 6 0 k d 之间，根据存在位置， 可将其分为三种类型：胞外酶、细胞壁或膜束缚酶及胞内酶。前两种属于分泌型，它们的 区别是膜束缚酶具有一个疏水锚定区域可以使酶镶嵌在细胞膜上。一般情况下，在同一个 细胞中往往三种形式的酶共存，而且是由同一个结构基因编码，但是有量上的区别。 人们对不同来源胆固醇氧化酶的基本性质进行了探讨，主要结论见表1 。 表1 1 胆固醇氧化酶的物理性质f 2 7 训】 t a b l e1 1 p h y s i c a lp r o p e r t i e so fc h o l e s t e r o lo x i d a s e 来源分子量等电点最适p h 值酶稳定p h 值 最适温度活力温度 p s e u d o m o n a s6 0 k d 7 04 0 11 06 0 7 0 失活 r h o d o c c u $5 5 k d9 17 8 4 0 1 1 04 7 2 0 - 7 0 n o r c a r d i a 6 4 k d7 05 0 9 0 3 0 2 0 一6 0 3 第一章前言 从表1 中可以看出，胆固醇氧化酶具有以下3 个基本特性： ( 1 ) 胆固醇氧化酶稳定的p h 范围宽， ( 2 ) 发挥活性的最适p h 一般为7 0 7 5 ( 3 ) 胆固醇氧化酶比较耐高温 1 4 胆固醇氧化酶的分离纯化研究 胆固醇氧化酶萃取和纯化的过程大体上与其它酶的过程相似。尽管如此，为了从每 种生产菌株中获得高产量的有活性的胆固醇氧化酶，在纯化过程上也会有一定的差别，实 验流程在很大程度上取决于该酶的存在位置，是细胞内还是细胞外。与胞外酶相比，胞内 酶的萃取比较困难，因为必须首先使细胞裂解释放，但很多研究发现释放的酶量较少，而 且增加了细胞质中杂蛋白和其它污染物的去除难度。 1 4 1 硫酸铵分级沉淀法 硫酸铵分级沉淀的应用主要是进行粗提。大多数应用于去除杂蛋白和得到初提蛋白。 其原理主要是当溶液中离子强度足够高时溶液中水的活度降低，原来溶液中大量的自由水 转变为与盐离子结合，此时蛋白质由于脱去了表面水膜保护，疏水基团开始暴露，由于疏 水作用而凝聚沉淀，最先凝聚的蛋白质是表面疏水残基最多的蛋白质。选择合适的硫酸铵 饱和度去除大量的杂蛋白，得胆固醇氧化酶的沉淀。 f l e g g 首先使用向胞外液中2 h ) k 3 0 的硫酸铵液体沉淀的方法) l n o c a r d i ae r y t h r o p o l i s r 扣 部分的纯化了胆固醇氧化酶 3 2 1 ，随着胆固醇氧化酶性质的研究，目前粗提胞外酶时所选择 的饱和度大多为7 0 、8 0 或8 5 ，这主要是因为胞外的胆固醇氧化酶分子量较小，并且 蛋白含量比较低。 1 4 2 离子交换层析法 粗分离的酶必须经过进一步的提取才能达到更高的纯度，随着层析技术的发展，各种 层析技术应用于蛋白质的纯化后，也逐渐变为胆固醇氧化酶纯化的主要步骤，离子交换层 析是一种简便快速的方法，其原理主要是蛋白质分子与固定相的可解离基团进行交换，吸 附于固定相上，用改变p h 或不同盐浓度的溶液将各组分分别洗脱下来，这样混合物中各组 分即被分开，达到分离纯化的目的。在蛋白质的纯化中主要基于溶液中的各种蛋白质的等 4 第一章前言 电点的不用，因此其特异性较差，但其方法简单快速，适合于大规模的工业生产。 砒c o n d 【3 1 】将酶的粗提取物经d e a e 纤维素柱层析后，经 i r i s h c l 洗脱，胆固醇氧化酶 活性增强4 倍。b u c k l a n de ta 1 【3 副改进了r i c h m o n d 的过程，发明了一种适合大量耗氧产酶的 过程，即使用t w e e n 一2 0 作为乳化剂，使胆固醇在培养基中的浓度达至l j 2 9 l ，胆固醇含量的增 加促使细胞的快速生长，从而使最初阶段的产酶量增加，同样采用d e a l s - 纤维素柱进行胆 固醇氧化酶的纯化，但在洗脱时使用了含有0 5 t r i t o n x 1 0 0 的磷酸缓冲液，这一分离过程 使酶的纯度提高4 0 0 倍，但产量且下降了2 6 。目前的离子层析交换柱j t i d e a e - 纤维素、 c m _ 纤维素、d e a e 一葡聚糖、c m 葡聚糖都己被成功地应用于胆固醇氧化酶的提纯。 1 4 3 分子排阻层析 凝胶过滤法( g e lf i l t r a t i o n ) 也称为排阻层析( e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y ) 、凝胶层析( g e l c h r o m a t o g r a p h y ) 或分子筛层析( m o l e c u l a r s i e v ec h r o m a t o f r a p h y ) ，它是在1 9 6 0 年后发展起 来的蛋白质分离纯化技术。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔， 利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只 流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故 在管柱内的停留时间较长，由此区分分子量大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比 较而测定未知分子的分子量。 与其它层析法相比，凝胶层析法是利用被分离物质分子量不同及固定相具有分子筛的 特点，在分离过程中并不与所要分离的蛋白质分子吸附。因此应用简单简单，结果处理方 便，而且并不使所分离的蛋白质变性，应用较广泛。但本方法仅适用于轴比相近似为球状 的蛋白，对轴比大的蛋白不适用，并且上样量较小对样品稀释倍数较大。 在胆固醇氧化酶的提纯中常用的是s e p h a d e xg 7 5 葡聚糖凝胶。凝胶层析一般用做分离 产品纯度的检测和粗测蛋白质的分子量。它经常与聚丙烯酰氨凝胶电泳连续使用以确定纯 度与分子量。 1 4 4 亲和层析 亲和层析是蛋白质分离纯化中最有效的方法。在胆固醇氧化酶的提纯中，该方法的应 用基于将胆固醇与一种脂溶性葡聚糖凝胶( s e p h a d e xl h 一2 0 ) 用物理或化学方法处理后， 将胆固醇与凝胶牢固地结合在一起，当样品流经凝胶时由于胆固醇与胆固醇氧化酶的特异 性结合，而将胆固醇氧化酶吸附于层析柱上。胆固醇氧化酶与亲和基质结合后，可以通过 改变与其竞争结合的t r i t o nx 一1 0 0 的浓度进行解吸附，进而将胆固醇氧化酶纯化。 k a m e i 3 4 】在胆固醇氧化酶的纯化过程中首先发展了一种简便易行的亲合层析的方法， 第一章前言 他发现胆固醇在沸水中加热后能够形成颗粒沉淀，这些沉淀的胆固醇是胆固醇氧化酶的良 好吸附剂，而且这种吸附作用可以被o 1 t r i t o n 一1 0 0 解除且不使酶失活，经过s d s 一聚丙稀 酰胺凝胶电泳检测，只出现一条带谱，通过亲合层析方法提取的胆固醇氧化酶由于纯度较 高，所以通过光谱扫描的分析检测到了辅因子f a d 的存在。 季文明、陈毅力【3 5 1 等利用胆固醇氧化酶和底物胆固醇之间的亲和力，以胆固醇为吸附 剂构成底物亲和层析柱。发酵液经盐析、透析后直接进行亲和层析，确定了适合的层析条 件，使比酶活从0 4 5 u r a g 提高到1 5 5 u r a g 。 1 4 。5 双水相萃取技术 双水相萃取技术是近年来发展起来的适用于大规模生产的蛋白质分离纯化技术，该技 术经济、简便、快速、高效，适合于分离具有一定疏水特性的水溶性蛋白质。该技术是温 度依赖型，在一定温度( 浊点) 以上，包含蛋白质的表面活性剂就会从水相中分离出来， 水相中留有少量的表面活性剂和蛋白质。与其他萃取体系相比，在很低的表面活性剂浓度 ( 1 w w 左右) 就会产生相分离，而且不需要有机溶剂。适合于工业大规模分离纯化。 r i c h m o n d t 3 1 1 发现使用t r i t o n x 1 0 0 可以提取细胞中7 0 的活性酶。t o r s t e nm i n u t h 采用 双水相将酶从水相中分离出来，然后用传统分离法进一步分离，得到较纯的可用于医学分 析的酶。r a r a m e t m e i e r 【3 7 】等在t r i t o nx 1 1 4 双水相系统中，利用胆固醇氧化酶的憎水性选 择性的分离了酶。 季文明、陈毅力、王武等使用双水相萃取法来提纯胆固醇氧化酶【3 6 1 ，在研究了表面活 性剂t r i t o nx 一1 1 4 双水相萃取法分离胆固醇氧化酶的条件后，可以直接从发酵上清液 中萃取。操作条件为：将发酵上清液的ph 值调至7 0 左右，加入1 的表面活性剂t r i t o n x 一11 4 ，搅拌均匀，在2 0 下保温3 0 m i n ，继而在3 5 下保温5 m i n ，3 0 0 0 r p m 离, c , 3 m i n ， 去除上清液。一次萃取可使酶液体积缩小1 0 倍，酶活回收率为7 0 。 1 5 分离纯化中存在的问题及发展方向 综上所述，随着胆固醇氧化酶应用范围的扩大，其分离纯化的高成本限制了它的商业 开发，目前采用的一般分离纯化步骤，主要存在以下几个问题 ( 1 ) 产胆固醇氧化酶菌种相对单一，且酶活不高。目前报道的产胆固醇氧化酶菌株全部 是细菌，真菌和其它微生物中还未见报道。 ( 2 ) 盐析是工业化生产蛋白酶的主要方法，但细菌来源的胞外胆固醇氧化酶不仅含量 低，而且分子量小，不同菌种产生的酶的等电点也很不相同，因此通过盐析措施很难得 到胆固醇氧化酶，分离成本较高。 6 第一章前言 3 层析步骤较多，容易在分离纯化过程中造成胆固醇氧化酶的损失，因此必须减少层析 并保证纯度。 4 亲合层析法适合于工业大规模生产，但必须将胆固醇与一种脂溶性葡聚糖凝胶 ( s e p h a d e xl h 2 0 ) 结合，价格较高且层析柱的再生能力低，因此必须研究新型廉价的 吸附剂和新型的填料。 随着人们对胆固醇氧化酶功能研究的深入，胆固醇氧化酶的应用范围也逐渐扩大，并 且在许多领域显示了其巨大的应用潜力。特别是近年来低胆固醇保健食品的开发和胆固醇 氧化酶抗虫作用的发现引起了新一轮研究的热潮，但因胆固醇氧化酶价格较高，使其商业 化应用还存在一定困难，因此寻找高产菌株、选择工业规模生产胆固醇氧化酶的分离纯化 工艺是该酶产业化的关键。预期双水相萃取、亲合层析和离子交换等方法的结合将会在工 业生产上有较大的应用。 1 6 胆固醇氧化酶的应用 胆固醇氧化酶在美国、日本等国家已进行商品生产，其应用范围也从最初的临床诊断 发展到制药工业、食品工业、生物农药和农业分子生物学等领域。但在国内胆固醇氧化酶 研究的起步较晚，因而具有较大的理论研究价值和实际应用的潜力。 1 6 1 胆固醇氧化酶可以用来降低食品中的胆固醇 。 大量研究证实饮食与心血管疾病的发生密切相关，过多的食用脂肪和胆固醇是引起心 血管疾病发病的重要原因。为了防止心脑血管疾病的发生，人们不得不限制饮食。因此， 研究不限制饮食，不影响食品风味，不干扰人体正常代谢的降低胆固醇的食品及其加工方 法，具有理论和实际意义。 3 位上的羟基是胆固醇的活性基团，在血清中胆固醇是以胆固醇酯的形式存在，一旦 含量过多，胆固醇酯就会沉积在血管壁上引起一系列心血管疾病，胆固醇氧化酶能催化胆 固醇氧化生成胆甾4 稀3 酮，使3 位上的羟基氧化为羰基。一旦胆固醇被氧化，它就不能 与脂肪酸作用形成酯，从而消除了胆固醇的危害。目前使用胆固醇氧化酶降解食品中的胆 固醇在国内外已有报道。 1 9 8 8 年a i l h a r a 3 刀等人由产胆固醇氧化酶的红球菌r e q u i n o 2 3 制备的胞外酶溶液转化 蛋黄胆固醇，取得显著效果。随后，j o h n s o n 等利用红球菌的超声处理提取液降解蛋黄中 的胆固醇，其降解率达到4 0 。澳大利亚c h r i s m d o u l o u 等报道了利用从诺卡氏菌( n o c a r d i a e r y t h r o p h i s , n e ) 、链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p , s s ) 、短杆菌( b e v i b a c t e r i u ms p b s ) 和假单菌 ( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s , p f ) 分离纯化的胆固醇氧化酶降低蛋黄中的胆固醇。并比较了这 7 第一章前言 四种酶降低蛋黄胆固醇的能力，其大小为p f n e s s b s ；其中p f 酶在4 c 下作用4 8 h 后可 使蛋黄胆固醇降低6 4 9 。 吕陈峰等【3 8 】考察了蛋黄粉的稀释率、c o d 的用量和反应时间这三个因素对胆固醇转化 的影响，并用响应面分析法优化了胆固醇氧化酶转化蛋黄胆固醇的工艺。研究发现c o d 的添加量和蛋黄粉的稀释率是影响蛋黄胆固醇转化的重要因素，利用响应面法优化得出的 工艺参数为：反应时间1 3 7 5 小时，蛋黄稀释率3 5 4 ，c o d 为5 3 9 u g 时胆固醇的转化率 达8 5 6 。而且，蛋黄中的一般营养成分在酶处理前后变化不大，但脂类降低了3 5 4 ， 反应产物只有胆甾一4 一烯一3 酮。 另外，有研究将链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p , s s ) 来源的胆固醇氧化酶直接加入乳中并测 定其反应过程，得出c o d 转化乳中的胆固醇可以非常明显的分为两个过程：一个是开始 反应的8 小时内；8 小时后为第二阶段。在反应开始的8 小时内降解反应的速度快，而且 胆固醇的降解量几乎与时间成正比；而此后的第二阶段的反应则较平和，反应速度基本恒 定。进一步研究表明牛奶中的胆固醇在缓冲体系中要完全降解需在2 5 或在3 7 下用胆 固醇氧化酶作用2 4 小时。比较理想的奶制品是在3 7 的低温下用胆固醇氧化酶处理1 0 小时，此时奶中的胆固醇可保证降低了5 0 以上。 中国农业大学的江正强等【3 9 1 利用胆固醇氧化酶降低猪油中的胆固醇，并对影响胆固醇 脱除率的若干因素( 酶用量、作用时间和乳化剂用量) 进行了正交试验，得出比较实用的 脱除工艺条件为：酶用量1 0 1 0 之u g ，作用时间4 h ，乳化剂用量2 。在这一条件下猪 油中胆固醇的脱除率可达6 0 6 。 1 6 2 临床检测 随着胆固醇过量与人类一些疾病的关系的发现，人体血清中胆固醇含量的检测变的十 分重要，是临床诊断的一个重要指标，自从胆固醇氧化酶发现以来该酶与胆固醇酯酶、过 氧化氢酶一起作为临床诊断血浆总胆固醇的检测试剂，使胆固醇含量的检测变的非常方 便： 1 9 7 3 年f l e g g 3 2 】首先用由诺卡氏菌产生的胆固醇氧化酶氧化血清胆固醇，产生胆甾一4 烯- 3 - 酮，由于羰基在2 4 0 n m 波长处有特殊吸收峰，从而测定了血清中的胆固醇含量。由 于血清中的胆固醇主要是以胆固醇酯的形式存在，在胆固醇酯酶和过氧化物酶成功分离纯 化后，血清胆固醇含量测定方法随之改进。目前测定血清胆固醇的反映体系中同时加入三 种酶，胆固醇酯酶先将胆固醇酯水解成游离胆固醇，然后胆固醇氧化酶氧化胆固醇产生过 氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与4 一氨基安替比林及苯酚发生反应，产生吸收 8 第一章前言 波长为5 0 0 r i m 的红色醌亚胺，该醌化物颜色的深浅与胆固醇的含量成正比，从而通过比色 法间接地测定胆固醇的含量。 目前已有公司生产并出售这种胆固醇测定试剂盒，但由于使用的由微生物产生的胆固 醇氧化酶，稳定性较差，限制了这种方法测定血液胆固醇含量的灵敏度。 1 6 3 制药工业 在制药工业中胆固醇氧化酶主要用于激素生产方面，比如胆固醇氧化酶催化孕烯醇酮 和5 一雄烯- - 3 b ，1 7 b 一二醇氧化，分别产生孕酮和睾酮，这两种激素都是人体内重要的性 激素，孕酮还是许多固醇类激素的前体。 另外，有研究者给患高血胆固醇病的豚鼠和兔子静脉注射胆固醇氧化酶，结果血液中 的胆固醇含量显著下降；随后的研究发现高血胆固醇动物的脾、肝、肾细胞匀浆对胆固醇 氧化酶的氧化敏感，而来自正常动物的组织细胞匀浆对胆固醇氧化酶具有抗性。但胆固醇 氧化酶作为治疗高血胆固醇的药品的研究还只是处于起步阶段，对于他在这方面的应用还 需要更深入的研究。 另外，一些研究证明胆固醇氧化酶催化胆固醇与氧反应生成胆甾一4 烯- 3 - 酮和过氧化 氢，胆甾一4 一烯一3 酮有预防治疗肝病和抗肥胖的作用。 1 6 4 抗虫作用 1 9 9 3 年p u r c e l l1 4 0 从链霉菌a 1 9 2 4 9 发酵液中发现胆固醇氧化酶c h o m 是棉铃象鼻虫 致死原因，纯化的胆固醇氧化酶的半致死浓度为2 0 9 u g m l 。链霉菌胆固醇氧化酶令棉铃象 鼻虫致死的特性是苏云金杆菌伴孢晶体蛋白所不具有的，同时胆固醇氧化酶对其他昆虫的 作用也可与b t 蛋白媲美。g h o s h r o y 4 1 1 等研究表明其杀虫机理与b t 蛋白不同，因而具有成 为新的杀虫剂的潜力，同时也为转基因植物提供了新抗虫基因。 从1 9 9 3 年p u r e e l 发现胆固醇氧化酶能杀死棉铃象鼻虫开始，研究者们对胆固醇氧化 酶基因应用于植物抗虫基因工程的研究产生了很大的兴趣。c o r b i n 4 2 1 将胆固醇氧化酶基因 c h o m 改造后转入烟草细胞中，并获得表达。m u r o o k a 4 3 】等将胆固醇氧化酶基因c h o a 整合 到烟草细胞染色体上并在转化细胞中表达。由于常规杀虫剂棉蕾中象鼻虫用特别难控制， 因此在棉花植株中表达胆固醇氧化酶基因引起人们极大兴趣，它为控制棉铃象鼻虫提供了 潜在的强有力手段。 2 选题意义 随着胆固醇氧化酶功能研究的深入，人们试图扩大其应用范围，但目前报道的产酶微 生物全部是细菌，来源单一，且酶活性较低，分离纯化步骤复杂，使该酶的生产成本较高， o 第一章前言 另外该酶的使用条件及对人畜的安全性还不甚清楚，故限制了它的大规模商业化应用。本 研究旨在以本实验室筛选的产胆固醇氧化酶霉菌t s 4 0 6 ，探讨提高胆固醇氧化酶水平的育 种方法，建立胆固醇氧化酶的分离流程，确定胆固醇氧化酶的基本性质，从而为胆固醇氧 化酶的来源提供新的途径。 1 0 第二章胆固醇氧化酶产生菌t s 4 0 6 的复合诱变育种 第二章胆固醇氧化酶产生菌t s 4 0 6 的复合 诱变育种 为消除血液中过多的胆固醇对人体的危害 4 4 1 ，必须限制食用胆固醇含量高的食物，或 脱除食品原料中的胆固醇生产低胆固醇食品，虽然利用物理或化学法处理食品，降低其 胆固醇的含量的报道很多 4 5 4 7 】，但这些方法都存在一定的缺点。而利用微生物产生的胆固 醇氧化酶处理食品被公认为降低食品胆固醇含量有效方法，它具有不干扰人体代谢、副作 用小等优点。 胆固醇有氧降解代谢的第一步是由胆固醇氧化酶催化的氧化反应，该反应将胆固醇的 3 位羟基氧化为酮基，许多报道认为唯一产物是胆甾一4 一稀- 3 - 酮，并且有研究认为胆甾一4 一 稀- 3 - 酮具有预防治疗肝病和减肥的作 4 8 4 0 。因此利用胆固醇氧化酶处理食品，不仅能 够生产低胆固醇保健食品，而且赋予食品治疗一些疾病的特殊功效。 本实验室于2 0 0 1 年分离获得一株产胞外胆固醇氧化酶的青霉，产酶水平为3 4 6 u l ，经 过数次单因素诱变处理，其酶活达到了5 4 6 u l ，为了进一步提高该菌胆固醇氧化酶的生产 水平，本研究采用紫外线联合硫酸二乙酯和紫外线联合亚硝基胍的连续两次复合诱变手段 处理青霉t s 4 0 6 菌株。 1 材料与方法 1 1 培养基 选择培养基( 1 0 0 0 m 1 ) ：胆固醇l g 溶于少量水中，经超声波破碎乳化2 小时( 4 0 0 w ) ， n h 4 n 0 31 0 9 ，k h 2 p 0 40 2 5 9 ，m g s 0 40 2 5 9 ，f e s 0 4 7 h 2 05 m g ，n a c l5 m g ，补水至 1 0 0 0 m l ，p h 7 0 。配制固体培养基时，加入1 5 2 的琼脂，1 2 1 ，o 1 m p a 灭菌3 0 m i n 。 发酵培养基：( 1 0 0 0 m 1 ) 胆固醇1 9 溶于少量水中，经超声波破碎乳化2 小时( 4 0 0 w ) ， n h 4 n 0 31 0 9 ，k h 2 p 0 40 2 5 9 ，m g s 0 40 2 5 9 ，f e s 0 4 。7 h 2 05 m g ，n a c l5 m g ，添加 1 5 9 酵母粉、1 5 9 淀粉和1 t w e e n 一8 0 。补水至1 0 0 0 m l ，p h 7 0 ，1 2 1 ，0 1 m p a 灭菌 3 0 m i n 。 1 2 试剂与仪器 1 2 1 试剂 d e s ( 硫酸二乙酯)无水乙醇2 5 的硫代硫酸钠o 1 m o l l 磷酸缓冲液( p h = 7 5 ) n t g ( 亚硝基胍)生理盐水 第二章胆固醇氧化酶产生菌t s 4 0 6 的复合诱变育种 1 2 2 仪器 恒温培养振荡器z h w y - 2 11 2 8 上海智城分析仪器制造有限公司 磁力搅拌器h j 2 上海安锐自动化仪表有限公司 紫外诱变箱 1 3 实验方法 1 。3 1 胆固醇氧化酶酶活力的测定【5 l 】 方法一：过氧化物酶法( 用于检测反应产物中h 2 0 2 的生成) 溶液a ： 4 一氨基一安替比林l m m o l l ；苯酚6 m m o l l ；磷酸缓冲液p h 7 52 5 m m o l l ； 叠氮钠0 0 2 ；辣根过氧化物酶7 0 0 0 u l ；t f i t i o nx 1 0 00 2 ； 溶液b 试剂a ( 不含有t f i t i o nx 1 0 0 ) ； 溶液c过氧化氢2 5 8 4 m m o u l ； 取溶液b3 m l ，溶液a1 5 0 u l ，3 74 c 保温3 m i n ，加入5 0 u l 酶液，准确反应5 m i n 。于沸 水中加热3 m i n ，冷却后，在5 0 0 n m 处测吸光度 酶活l ) = o 1 3 1 5a s o o x1 0 0 0 x v x k - - t x1 0 0 0 其中：a ：反应液吸光度：v ：反应液体积( m l ) ：k ：酶液稀释倍数( 1 m l ) ：t ： 反应时间( m i n ) 方法- -邻苯二甲醛法( 用于检测反应底物胆固醇的减少) 准确称取一定量的胆固醇溶于1 0 0 m l 冰醋酸中，配制成浓度为0 1m g m l ，0 2 m g m l ，0 3 m g m l ，0 4m g m l ，0 5m g m l ，0 6m g m l ，0 7m g m l ，0 8m g m l ， 0 9m g m l 和1 0m g m l 的胆固醇标准溶液，分别取不同浓度标准胆固醇溶液0 5 m l ， 水0 2 5 m l ，加入2 5 m l 浓硫酸，3 7 5 m l 邻苯二甲醛溶液( 准确称取2 0 m g 邻苯二甲醛溶 于1 0 0 m l 冰醋酸中) ，准确反应1 0 m i n ，测定0 d 5 6 0 ，以胆固醇浓度为横坐标，以0 9 5 6 0 为纵坐标绘制胆固醇浓度标准曲线。 取5 0 0pl1 0 m g m l 的胆固醇标准溶液与酶液2 5 0 ul 准确反应3 分钟，之后加 入2 5 m l 浓硫酸，3 7 5 m l 邻苯二甲醛溶液( 准确称取2 0 m g 邻苯二甲醛溶于1 0 0 m l 冰 醋酸中) ，准确反应1 0 m i n ，测定0 d 5 6 0 ，在标准曲线上查找其残留胆固醇量。 酶活( u l ) = 17 2 4 9 2 7 4 a s 6 0 a 5 6 0 反应液吸光度 1 3 2 出发菌株处理 菌体斜面培养至对数期，用缓冲液洗下孢子至有玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡3 0 m i n 1 2 第二章胆同醇氧化酶产生菌t s 4 0 6 的复合诱变育种 使孢子充分分开，以无菌滤纸或脱脂棉过滤，形成单孢子悬液，浓度1 0 7 个m l ( 血球计数 板计数) o 1 3 3 诱变方法 1 3 3 1 紫外线诱变 取单孢子悬液置于内有磁力转子的平皿中，使其液体厚度约0 5 a m 左右，将平皿置于 紫外诱变箱中的磁力搅拌器上，打开开关使菌液不停旋转，紫外灯开始照射时计时，分别 对诱变不同时间的菌悬液进行连续1 0 倍稀释，选取合适的三个稀释度进行平板涂布，平 皿避光2 8 c 培养，对培养好的平皿进行菌落计数，计算致死率。 1 3 3 2d e s 诱变 取单孢子悬液9 7 m l 置于三角瓶中，加入d e s0 3 m l ，将三角瓶置于摇床上，打开开 关使菌液不停旋转，开始计时，分别对诱变不同时间的菌悬液进行连续1 0 倍稀释，选取 合适的三个稀释度进行平板涂布，2 8 c 培养，将培养好的平皿进行菌落计数，计算致死率。 1 3 3 3n t g 诱变 取0 1 2 9 n t g 溶于l m l 丙酮中，将n t g 丙酮溶液加入到盛有9 m l 单孢子悬液的三角瓶 中，将三角瓶置于摇床上，打开开关使菌液不停旋转，开始计时，分别对诱变不同时间的 菌悬液进行连续1 0 倍稀释，选取合适的三个稀释度进行平板涂布，2 8 c 培养，将培养好 的平皿进行菌落计数，计算