miRNA及其发展和应用.ppt

miRNA及其研究和应用 谢东君2015202030079 RNA在生命过程中的作用 mRNA 合成蛋白质的蓝图rRNA 合成蛋白质的工厂tRNA 合成蛋白质的搬运工miRNA 被关注的RNA研究 2000年 RNAi的研究进展被Science杂志评为重大科技突破 2001年 RNAi作为当年最重要的科学研究成果之一 再次入选 十大科技突破 2002年12月20日 Science杂志将 SmallRNA RNAi 评为2002年度最耀眼的明星 同时 Nature杂志亦将SmallRNA评为年度重大科技成果之一 2003年 microRNA的研究第四次入选 十大科技突破 2005年 microRNA的研究第五次入选 十大科技突破 2006年 RNAi获得当年的诺贝尔生理学或医学奖 并且microRNA的研究第六次入选 十大科技突破 RNA研究的突破性进展 是生物医学研究领域近20年来 可与HGP相提并论的最重大成果之一 什么是miRNA miRNA的发现 miRNA的产生过程 miRNA的作用机制 miRNA的特点 与其他寡核苷酸相比 主要有三点不同 没有开放阅读框架及蛋白质编码基因的特点通常的长度约为22个核苷酸 但在3 端可以有几个碱基的长度变化成熟的miRNA5 端有一磷酸基团 3 端为羟基 miRNA的生物学功能 miRNA的保守性 miRNA靶基因的寻找 尽管数百种miRNA在最近几年中被发现了 但是只有非常少量的miRNA被确定其作用 许多其他的miRNA基因的作用还没有被阐明 因此发现miRNA的作用靶点成为了解其在不同的生理过程中的功能的关键 目前主要利用生物信息学方法和生物学实验方法寻找miRNA的靶基因 生物信息学方法寻找miRNA靶基因 生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本进行评分及筛选 主要遵循以下几个常用原则 miRNA与其靶位点的互补性miRNA靶位点在不同物种之间的保守性miRNA mRNA双链之间的热稳定性miRNA靶位点处不应有复杂二级结构miRNA5 端与靶基因的结合能力强于3 端常用的算法有 miRanda TargetScan RNAhybrid PicTar miTarget等 生物学实验方法寻找miRNA靶基因 由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性 因此很多学者也希望能够利用生物学实验方法直观地寻找miRNA靶基因 一般可以从两个水平去寻找miRNA靶基因从mRNA水平寻找miRNA靶基因从蛋白质水平寻找miRNA靶基因 从mRNA水平寻找miRNA靶基因 基因芯片法 将miRNA成熟体双链或腺病毒载体转染至细胞中 使得miRNA在细胞中过表达 之后利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA的靶基因 由于miRNA在体内通过翻译抑制或影响mRNA的稳定性起作用 因此这种方法在寻找起翻译抑制作用的miRNA的靶基因时存在一定困难 从mRNA水平寻找miRNA靶基因 免疫共沉淀法 利用AGO蛋白家族既能结合miRNA又能结合mRNA的特性 分别使用AGO 1和AGO 2蛋白的单克隆抗体在人类细胞中进行免疫共沉淀 得到与AGO 1和AGO 2蛋白结合的mRNA各600条 并通过克隆测序对这些mRNA进行鉴定 同时从与AGO 1蛋白结合的mRNA中随机挑选6条进行荧光素酶报告基因检测 发现其中有5条都是miRNA的靶基因 从蛋白质水平寻找miRNA靶基因 细胞培养稳定同位素标记技术 分别将成熟miRNA双链转染HeLa细胞 利用细胞培养稳定同位素标记技术 stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture 将转染了成熟miRNA双链的细胞和正常细胞分别培养于含轻 重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基中 经过若干次细胞倍增后 稳定同位素按照序列特异的方式完全掺入到新合成的蛋白质中 通过比较标记前后同一肽段的质谱峰值变化实现对蛋白质的精确定量 在检测了2000 5000个蛋白后 两个研究组分别发现 转染一条miRNA后有几百个蛋白的表达水平发生了改变 许多改变在mRNA水平上不能得到体现 miRNA靶基因的鉴定 目前最为常用的miRNA靶位点鉴定方法是荧光素酶报告基因法 其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体 将希望鉴定的miRNA靶基因的3 UTR构建到荧光素酶基因的3 UTR中 之后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平 最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3 UTR中是否含有miRNA的靶位点 miRNA在在肿瘤研究中的应用 随着对miRNA认识和了解 越来越多的研究认识到它与肿瘤的形成有密切的关系 如抑制癌基因的miRNA表达降低 可导致癌基因的过表达 而抑制抑癌基因的miRNA表达过度 可导致抑癌基因表达降低 致癌基因的过表达与抑癌基因表达降低均可使肿瘤发生 例如miR 155是由人BIC基因编码的miRNA 在hodgkin淋巴瘤和burkitt淋巴瘤中均高表达 在burkitt淋巴瘤中 miR 155的前体RNA出现10 30倍的蓄积现象 但是在非hodgkin淋巴瘤中几乎没有发现它的表达 miRNA的研究现状和展望 目前已发现了大量的小 分子 它们在序列 结构 表达及功能等方面都不同程度地表现出了多样性 其中miRNA的表现尤为突出 它很可能在生命活动中起着重要作用 对基因表达 生