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大肠杆菌 重组 蛋白 包含 形成 机制 及其 影响 因素

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一 生 物工程 进展 t 9 9 2 Va U 墨 了 哟 7 大肠杆菌 中重组蛋白包含体的形成机制及其影响因素 李 溢 r 一 军事医学科学院基础医学研究所 摘要 本 文介 绍 T近 年 有 关 重 组蛋 白 包含 体 形 成 机 制的研 究进 展 探 讨 了蛋 白性质 温度 分 子 伴 随 物 等 因 素 对 包含 体 开 j 成 的 影响 从 蛋 白 折连 的角度 对 包含体 这一现 象进 行 7分析 从 而寿控 制外源基 因表连产物 形成 包含 体提供理 论 指 导 在外源 基因表达系统 中 太肠杆菌 以其 周 期短 操 作简 便 遗传背景较清楚等优 点而得 珥 了广泛的应用 多种真核基 因已成功地在大 肠扦菌中获得高效表达 但是由于外源蛋 白常 以非活性方 式在 细菌细胞质 中聚集成不溶 性的 包含体 i n c l u s i o n b o d i e s 使利用大 肠 杆 菌生产活性蛋 白受 到了一定限制 而 且虽然 目 前所观 察到 的包 含体 大多形成于大肠扦菌 中 但有证据显示在其 他表达 系统中 当蛋 白表达 量高至 与大肠杆菌 中相 当时 也有形成包含体 的趋势 虽然包含体由于其不溶性易与其他可 溶性蛋 白分离 但是这 些非活性蛋 白必须经 过 变性 复性等处理后才能 部分 恢复 其 天 然 活 性 而某些蛋 白 尤其是 大分子蛋 白 其活性 的恢 复几乎是不可能韵 因而包含体的形成为 活性蛋 白的生产挺 出了一个新 问题 近年来有 关 包含体的研究 逐步深入到其形成机 制及 影响 因素方面 这为控翩包含体形成 生产可擦性 蛋 白提供 了重要 的理论依据 一 包台 体的形成 机制 包 含体在相差 显微 镜下常 有折光性 故 又 称 折光小体 r e f r a c t i l e b o d i e s 在 电 镜 下观察到的 包含体形态依 其在 细胞 中的位置 本文承蒙三嘉玺教授指点 马贤觊教授审阅漂表谢意 一 34一 占 不同而有较大差异 如细胞质中的包含体形状 规则 有清晰鲥边界 而周质间隙中的包含俸 则为无定形 蛋白聚集物 由于其不 溶 性 用差速离心法即可将包含体与其他可溶性爱 自 分开 迄今关于包含体的形成机制有很多假设 但这些假设都无法对包含体的形成作出完满附 解释 如有推测认为 由于细菌细胞质的还屠 环境 含有半胱氮酸的外源蛋白常常由于不能 形成正确的 硫键而产生非天然 构 象 值 有实验结果却表明 一些不含二硫键的蛋 白 如 大肠杆菌s i g ma 蛋 白 也能 形成 包 含 体 而 含有 2个二硫键的人生长激素分子则能 以溶解 方 式表达 可见 虽然二 硫键 与蛋 白 的 稳 定有关 但 硫键的错配并非所有蛋白形成包 含体的原 因 最近有学者提出了以下假设 即蛋自的聚 集 起源 于肽 链折送过程 中部分折 迭的中阔体之 间的特异性错最聚合 而不是形成于成熟的无 然态或完全解链的蛋 白 这 一 假 设 主 要 建 立 在有关蛋 白折迭过程的认 识基础上 般 地 大 多数 蛋白的折迭过程可分为 两 步 U I N 第一步为解链态向中间体的转化 在毫秒 级时 间内快速 形成特异性二级结 构 第二步为 限速反应 为中间体形成特异性空间结构而达 到天然 状态 的过程 第二步反应伴 随着大 量盼 热 焓及 热容 变化 表明 与天然态相 比 有较多 的疏水基 因暴露 于中间体分子表 面 因而推溅 这 些疏水性 区域 之间的相互作 瑁是 促 使 分 予 维普资讯 发生聚集的 主要 原因 这种非 生 产 性 n o n p r o d u c t i r e 反应 可 以在体外得到控 制 从而 增加具有 天然构象蛋 白的生成 以上假设 得到了许多体外实验 结 果 的 证 实 例如 在 牛生 长激 素的复性过程 中即观察 到折 迭 中间体发生 聚集 分析在 聚 集 过 程 中起 关键作用的为 一段含有 1 8 个氨基酸的两 性 螺旋 结构 部分变性环境使该 螺旋 的亲 脂表 面暴露 出来 导 致折 迭 中间体的形成 而分子 问 的疏水表 面的相互作用则驱使 中间体发生聚 集 突变实验 表明 如果将 该螺旋的一个赖氨酸 置换成亮 氨酸 从而使疏水 面延 伸 则导致聚集 中间体 的稳定 以及复性过 程 中突变蛋 白沉淀的 增多 在该两性螺旋的c 一 端还有一段亲水性螺 旋结构 后者具有抑制聚集形成的功能 甚至 在部分变性环境 中也能保 留一 些螺 旋性 研 究 者认为正是亲 水性 螺旋与疏水性螺旋的 空间特 异 性作 用阻碍 了聚集 中间体的形成 虽然 这些实验 结果 主要 来源 于蛩 白质的体 外折 迭研 究 但也有一 些体 内研 究实验 表明 细胞内蛋 白的聚集也是部分折迭的肽链 中间体 分 子 间相互 作 用 的 结 果 据 此 Mi t r a k i 和 i r i g 提 出了以下包含体的形成模型 翻 译 l e t I 一 天 然 态 l r I f 包含体 聚集 物 这里 I F r 为可溶 的 部分折 迭的 早 期 中 间 体 I 舸形成单体的 中 间 体 I 为 形 成包含体的形式 可 以看 出 I 既可进入产物 生 成途径 又可进入包含 体形 成途径 而这两 条 途径 的选择则受诸如蛋 白性 质 温度 伴随 蛋白等条件的影响 这正是本文以下所要讨论 拘 问题 二 包 含体 形威 的影 响因素 关于包含体形成 影响 因素 的研 究近年来 已 有 较大进展 可归 纳为 以下几 点 1 蛋 白性 质 早 期的实验结果 即表明 蛋 白质的大 小与 包含体的形成无关 如 人补体c 只 有8 KD HI V 逆 转录 酶分 子量高达6 6 KD 它们都能 形 成 包含体 但是肽 链的氨基酸 组成对包 含 体 的形 成影 响却 很大 I S c h e i n l 0 通过 比较 不 同溶解度 盼表达蛋 白中的脯 氨酸含量 发现 脯 氨酸 含量低的 蛋白较 易溶解 由于脯氨酸 天冬酰胺 甘氨酸等氨基酸残 基在肽链 中有较 强的形成 转角趋势 而转 角是 蛋白折迭 过程 中 最 难形成的结 构 其形 成过程是蛋 白折 迭的艉 速反应 所 以这些氨基酸的含量对 蛋白形成 包 含体的影 响是显而 易见 的 此外 她还发 现带 电荷 氨基 酸残 基较多时容 易形成可 溶性蛋 白 最 近 W i l k i n s o n 和Ha r r i s o n l l 用统计 学方 法分析 了8 1 种 蛋白的氨 基酸 组成 其 中5 4 种形 成包含体 2 7 种不形成 包含体 这 些蛋 白以不 低 于总蛋 白 3 的表达水平合成 于3 7 生长 的 大 肠杆菌 中 有融台 蛋 白也 有非 融合蛋 白 他 们 选取 了 6个影 响蛋 白折 迭 与溶解性的参数 即 电荷平均数 转 角形 戒残 基含量 半胱氨 酸含量 亲 水性 及氨基酸 残基 总数 并 且发现 这些参 数与包含体的形成相 关性依 次降低 其 中电荷平均效和转角形成残基含量与包古体的 形成有强相关性 即电荷平均数小 转角形成 残基含量高的蛋 白有 强烈的形成包 含体 趋势 根据这 些相关性 可 以推 测 已知氨基酸的蛋 白 在某 一给定条件 下形 成包 含体的几率 饲如在 以上被分析的8 1 种蛋 白中 其可溶性或不可溶 性的理论预测准确度在8 8 以上 这 些预测结 果对于基因克隆与表达条件的选择 如根据蛋 白的包含体形成趋势选择台适的启动子 进行 融合蛋白的搭配等 无疑具有重 构 参 考 价 值 也为利用定点诱变方法改变 蛋 白的可溶性 提供 了理论依 据 2 温度 温度对蛋 白折 选过 程的影响早就 引起 了人 们韵注意 现 已普 遍认为外 源蛋 白在 高温 下生 长的细菌 中容易形 成包含体 在低温 下则 容易 以溶解形式台 成 1 2 l 1 3 这种蛋 白的溶解 性 对 于温度的依 赖性在噬菌体 P t 尾棘蛋 白的 研 究中得到了较深入的探讨 1 4 成熟韵 天 然 P 尾棘蛋 白为三 体 有抗热 性 因而可通过 一 35 维普资讯 分 析温敏突 变体来观察温度 对其折 迭过程的影 响 S t u r t e v a n t 等人的实验发现 在细菌生长 温 度较 高 3 7 4 2 时 温敏 突变体的肽链 不能形成天然的尾棘蛋白 而在较低的生长温 度 2 5 3 O 下则 能折 迭成 天然的 有活性 的 蛋 白 而 且如果将 在高温下 台成的肽链 及时地 移至低温也可使之重新进入天然产物生成途径 图 1 差示扫描量热测量结果显示 成熟 的 突变体 与野生型蛋 白的热 稳定性只有细微差 别 表 明野 生型蛋 白的氨基 酸残基对于天然蛋 白的稳定性 并不 起重要 作用 他们认为 在突 变 体中 由于氨基酸残基的置 换蛋 白折迭 过程 中早期中间体的结构较为松 散 热 稳 定 性 降 低 所 以与天然态相 比需要 更为允许 的环境 条 件以维持其结构的紧密 而且一旦在该环境下 形成正确折迭的肽链 即使移至非允许环境 也 能保 持其天然态的稳 定性 相反 在非允许环 境 中生成的肽 链聚集物并不 能简单地通挝转移 至允许环境而 使之恢复天然 态 最 近 Mi t r a k i 等人 又进 一步探讨 了 温 敏 突变抑制突变对P z 尾棘磕 白温敏突变体 的 折 迭过程的影响 I s 发现在温敏 突变 体 肽 链 上 进行氨基聩 取代后能 抑制早期折迭 中间体 聚 集 成包含体 并且这些抑 制突变对野生型肽链 的折迭效率也有促进作 用 这些对于 以上我们 所讨论的包含体形成模型是一个极好的实验证 据 同时也说明蛋 白的折迭并不仅仅是一个热 力学过程 更是一个动力学过程 某些对于终 产物的稳定性不起作用的氨基酸残基对于蛋白 的正确折选却是至关 重要 的 3 分 子伴 蛋随 白 c h a p e r o n i n s 关于蛋 白的折迭机制 过去认为氨基酸序 列 即包含 了形成蛋 白质 空间结构所需要 的全 部 信息 或 者说肽链能 在使其结构趋 于哉量 上最 稳定的 内力 驱使下 自发地折迭成三维的 有 括性的蛋 白质 然而 近年 来人们发 现太多 鼓 蛋 白并不 能完 成 自组 装 过程 而 是需要 细 胞内其他的机制辅助其进行正 确韵 折邀 分 子 伴随 蛋 白就是这些辅助机 制中的一种 它们 是 能促进其他蛋白的组装雨不参与形成其终产 一 3 6一 l成熟强度f c 圈1噩度 对野 生塑殛沮 t亮重体P 2 量棘蛋 白扉 繇硅程中聚寨程度曲影响 天然蛋白0 0 折迭中闻体i 聚集物 物 的一类 蛋 白分 子 1 6 现 已在转植物和细茵 中发 现多种分 子伴随蛋 白 如真 核 细 胞 中 盼 h s p 7 0 类 热休 克蛋 白 信号识别颗粒 S RP 以及原核细胞中的Gr o E S e e A S e e B 蛋 白等 分 子伴随蛋 白对 新生肽链 折迭的促进柞孵 机 制还不清楚 据认为 它们有 两方面 的作用 一 方面是使 前体 蛋 白处 于一种松散 折迭的构象 而具有跨膜 折 迭或 组装能力 另一 方 面是在 肽链 折迭过程 中通过 与折迭 中间体上所暴露 盼 疏水区域结台而防止肽链分子问发生反应 阻 止肽链进 入错误折选 途径 1 7 1 8 在已知的细菌分子伴随蛋 白 中 Gr o E U 是 较早发现的 一种 是 噬菌体 蛋白台成所不可 缺少的宿主蛋白 也是细菌 自身生 长 所 必 舒 的 已对g r o EL基 因进行克 隆 显 示它与第二 个基 因g r o ES 共 同编码于一个 操纵子 中 且 是 噬菌体组装和细菌正常生 长所需的 1 9 孽 近 Ga t e n b y 等 2 0 观察了Gr o E 产物对外潺 D一核酮糖 l 5 一二磷 酸 羧 化 酶 加 氧 酶 RUB I S CO 折迭与组装的 影 响 RUBI S CO是参 与光合作 用的一种酶 其最 常见 的 结 构为 由 8个 大亚基 L 和 8个小亚 基 S 组成的六面体 将一种蓝细菌的大 亚 基 小 亚 基 的基因转入大肠杆菌 能台 或并 组 装 出 兵 一 峨噼革拦蟪馨哩 维普资讯 有 活性 的L S 全酶 如果 时将 g r o EL和g r o ES 基 因克 隆 到 与RUB I SC O表 达 质粒相容 的 质 粒 载体 申 则能使组装 的RUB I S C O表 达水 平提 高 5 1 0 倍 卡 H 反 在g r o E缺陷 的 菌株 中 RUB I s CO的组装则受 到抑 制 f i f 1 还进 行 了 RUB I s C0的体外 重组装 实验 发现经 化 学 变 性 的RUB I S c0双 体 在 有Gr o EL和Gr o ES 的 环 境 中也有大量 的活性 酶生成 这些令 人鼓 舞 韵 实验结果提 示 可 以利用分 于伴 随蛋 白基 因 舳 共 表达 促使趋 于形成 包含体的外源蛋 自折 迭 成天然 的活性分 也 可将 分子伴随蛋 自用 于 加 速 包含体纯化 中的蛋白复性过程 以上 我们 探讨 了蛋 白性质 环境温 度和分 孑 伴 随蛋 自等 因素列 包含体形成的影 响 这 些 只是众 多 因素 中的 一部分 其他如蛋 白浓度 茔 基 等在包 含体形成过程 中也起着一定作用 j 甚里就不 详述 了 由此可 以看出 蛋 白的折迭 j 黾一个 复杂的过程 包含体 的形 成往往是多种 因 素共 同作用 的结果 三 结 语 有关 包含 的形成机 制及 其影响 因素的研 究 威 果不仅 使我们从理论上对 包含体这一现象有 了逐 步深入的认识 而 且对 遗传工程 中的一 些 实 际工作 也有 一定 的指 导意义 如利用 包含 体 钓 形成对 环境有较 大的依赖性这一特 点 可 以 通 过 选择 合适 的条 件 生长温度 分子 伴随蛋 白等 控 制包含体的形成j 另外 由于蛋 白的 理化性 磺在肽链 的折迭 过程 中起 着关键作用 可 用定点诱变 的方 法进行蛋 白性 质的改造 人 为 地改变肽链 折迭途径 当然 由于包含体这 一 现 象的复杂性 活性蛋 白的生 产在 目前仍是 一 个有待解决 的问题 相信 包含 体研 究的不断 椿 入将 使人们对蛋 白折 迭有更全 面的认识 并 且 在有 活性 的遗传工程产 品的生 产 中得到广泛 舳 应用 参考文献 1 Ka ne J F a n d Ha r t l e y D L 1 9 8 8 T r ends i n Bi ot ech no1 6 9 5 一 l 0 1 2 Bo w d e n G A e t a 1 1 9 9 1 Bi o T e c h no l ogy 9 7 25 73 0 3 Ma s c n F A O 1 9 8 6 Bi o c h e m J 2 4 0 l l 2 4 Pi gi et O P a nd 8c hust er B J 1 9 86 P N AS 8 3 76 4 3 7 6 4 7 5 Dal bo ge H e t a 1 i 9 8 7 B i o Te e h n o l o gY 8 l 6 l l 6 4 6 M i t r aki A a l d Ki ng J 1 9 89 Bi o ch nol ogy 7 6 9 O 一 69 7 7 Pt i t s yn O B e t 91 1 99 0 FEBS Le tt 26 2 2 0 2 4 8 Br e m s D N e t a 1 1 9 8 6 Bi oc h e m i s t r y 2 6 5 3 9 6 5 4 3 9 B r e m s D N 1 9 8 8 Bi o e h e mi s t r y 2 7 4 5 4 l 一 4 5 4 6 1 0 S c h e i n C H 1 9 8 9 B t o Te c h m o l o g y 7 1 1 4 1 1 1 4 8 11 W i lki nson D L and Ha rr i s on R G 1 9 9 1 B i o Te c h n o l o g y 9 4 4 3 4 4 8 1 2 Pi at ak M et a 1 1 9 8 8 J Bl o1 Ch em 2 6 3 鹕 一 4 8 4 3 1 3 B r o w r t e r M F e t a1 1 9 9 1 Pr ot e i n En g i ne arI n g 4 35 一 35 7 1 4 St ut evant J M et a 1 1 98 9 J Bi o1 Che m 2 6 4 1 0 6 9 卜l 0 6 9 8 1 5 M i t r a ki A e t a 1 1 9 9 1 S c i e n c e 2 5 3 8 4 5 8 16 El l i s J 1 98 7 Nat ure 3 28 37 8 37 9 17 Ost ermann J 1 9 90 Bi ot ec hnOl 0gy a nd Genet i c En gi ne eri ng Revi ew s 8 2l 9 2 4 9 8 Landr y S J and G i er as ch L M 1 9 91 Trends Bi oc he m 8c j 16 1 5 9 1 6 3 1 9 Hem m i ngs en S M e t a1 1 98 8 Nat ur e 3 33 33 0 33 4 2 0 G a t e n b y A A e t a 1 1 9 9 0 T r e n d s i a Bi ot e ehno1 8 35 4 3 57 3 7 维普资讯

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