酶联免疫吸附实验ppt课件.ppt

酶联免疫吸附实验 ELISA 1 第一部分 基本实验原理 基本原理先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上 并保持其免疫活性 将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原进行反应 用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分 然后加入酶的作用底物催化显色 进行抗原或抗体的定性或定量检测 2 第二部分 常用实验方法 一 间接法此法常用于测抗体 将已知抗原吸附于固相载体 加入待检标本 含相应抗体 与之结合 温育洗涤后 加入酶标抗球蛋白抗体 酶标抗抗体 和底物显色进行测定 图1 3 图1 间接法测抗体示意图 固相抗原 待测标本 含相应抗体 酶标抗抗体 4 第二部分 常用实验方法 二 双抗体夹心法此法常用于测抗原 将已知抗体吸附于固相载体 加入待检标本 含相应抗原 与之结合 温育洗涤后 加入酶标抗体和底物显色进行测定 图2 5 图2 双抗体夹心法测抗原示意图 6 第二部分 常用实验方法 三 竞争法此法常用于测抗原和半抗原 也用于测抗体 以测抗原为例 将特异抗体吸附于固相载体 加入待测抗原和酶标已知抗原 使两者竞争与固相抗体结合 经过洗涤分离 最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关 即待测抗原和酶标抗原颜色反应的差数是待测抗原的含量 图3 7 图3 竞争法测抗原示意图 8 第三部分 方法的特点和进展 ELISA方法由于灵敏 特异 操作简便 快速 实验设备要求较为简单 应用范围广泛 无放射性污染等优点 成为目前普及应用最广 发展最快的免疫学技术之一 生物素 亲合素系统 BAS 是在ELISA中应用的常见技术 BAS ELISA 其中ABC ELISA法更为常用 其基本原理为 固相抗体 待测抗原 生物素化抗体 亲合素 酶标生物素复合物 底物显色 9 第四 一部分 人TNF 检测实验原理 基本实验原理 双抗体夹心ABC ELISA法 抗人TNF 单抗包被于酶标板上 标本和标准品中的人TNF 会与单抗结合 游离的成分被洗去 同时加入生物素化的抗人TNF 抗体和辣根过氧化物酶标记的亲合素 生物素与亲合素特异性结合 抗人TNF 抗体与结合在单抗上的人TNF 结合而形成免疫复合物 游离的成分被洗去 加入显色剂 若反应孔中有人TNF 辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色 加终止液变黄 在450nm处测A值 人TNF 浓度与A450值之间呈正比 可通过绘制标准曲线求出标本中人TNF 浓度 10 第四 二部分 实验试剂 材料和仪器设备 实验标本试剂盒及其内容物实验材料仪器设备 11 实验标本 人外周血 血清 1 收集血液的试管应为无热源和内毒素试管2 血浆抗凝剂为EDTA3 标本应清澈透明 如有悬浮物应离心除去4 避免溶血 高血脂5 标本收集后若不及时检测 按一次用量分装 冻存于 20 避免反复冻融6 可根据实际情况 将标本作适当倍数稀释 建议做预实验 以确定稀释倍数 12 试剂盒及其内容物 1a标准品1支 4000pg 冻干 4 1b标准品和标本稀释液 粉红色 1瓶 15ml 4 2a浓缩生物素化抗体2 1支 60 l 4 2b生物素化抗体稀释液 绿色 15ml 4 3a浓缩酶结合物2 1支 60 l 4 避光 3b酶结合物稀释液 黄色 1瓶 15ml 4 4浓缩洗涤液20 兰色 1瓶 15ml 4 5显色剂1瓶 6ml 4 6终止液1瓶 12ml 4 抗体包被板条8 12或8 64 封板胶纸1张说明书1份 96 48Test 13 实验材料与设备 1 加样器 0 5 10ul 2 20ul 20 200ul 200 1000ul2 吸头 10ul 200ul 1000ul3 酶标仪 450nm4 双蒸水或去离子水 坐标纸等 14 第四 三部分 实验方法与步骤 1 提前20分钟从冰箱中取出试剂盒 以平衡至室温 2 将浓缩洗涤液 4 用双蒸水稀释 1 20 未用完的放回4 3 标准品 以标准品 标本稀释液 1b 1 0ml复溶冻干标准品 1a 静置15分钟后混匀 按说明稀释至所需浓度 再进行倍比稀释至所需浓度 未用完的复溶标准品放入 20 保存 稀释的标准品不应重复使用 4 可根据实际情况 将标本做适当倍数稀释 可做预实验 以确定稀释倍数 15 第四 三部分 实验方法和步骤 5 从密封袋中取出所需板条 其它板条密封放回4 6 除空白孔外 分别将不同浓度标准品 标本100ul 孔加入板条的相应孔中 标准品和标本应作双复孔或三复孔 用封板胶纸封住反应孔 37 孵育90分钟 7 洗板4次 8 除空白孔外 加入1 100稀释的生物素化抗体 2a 工作液100ul 孔 封住板孔 37 孵育60分钟 16 第四 三部分 实验方法和步骤 9 洗板4次 10 除空白孔外 加入1 100稀释的酶结合工作液 100ul 孔 封住板孔 37 孵育30分钟 11 洗板4次 12 各孔加入显色剂100ul 孔 避光37 孵育10 20分钟 13 各孔加入终止液100ul 孔 混匀后即刻测A450值 5分钟内 17 标准品稀释方法 2000pg ml 1000pg ml 500pg ml 250pg ml 125pg ml 62 5pg ml 31 25pg ml 500 lstd 500 l 500 l 500 l 500 l 500 l 18 第四 四部分 结果判断与计算 1 每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值 2 绘制标准曲线 以标准品浓度作横坐标 OD值作纵坐标 以平滑线连接各标准品的坐标点 通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度 3 若标本OD值高于标准曲线上限 应适当稀释后重测 计算浓度时应乘以稀释倍数 4 试剂盒灵敏度 最小可测人TNF a达4pg ml 19 20 第四 五部分 注意事项 1 1 手工洗板时 甩尽孔内液体 每孔加洗涤液350 l 静止30秒后甩尽液体 在厚迭吸水纸上拍干 洗4次 2 冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶 属于正常现象 加热溶解后再配制 3 装量极少的试剂 2