（发酵工程专业论文）植物甾醇酯的合成及活性研究.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 植物甾醇是一种新型的降低血清胆固醇的功能活性成分。为了拓宽植物甾醇 的应用范围，本论文对植物甾醇酯的制各工艺、生物活性及应用进行了研究。实 验主要包括四个部分的内容： 1 ) 研究了植物甾醇的气相色谱定量分析方法：采用h p 5 号石英毛细管气相 色谱柱( 3 0 m 0 2 5 m x 0 2 强m ) ，f d 检测器：角鲨烷为内标；柱温2 8 5 ，进样 器温度3 0 0 。 2 ) 研究了化学方法合成甾醇乙酸酯( p s a ) 、甾醇油酸酯( p s o ) 、甾酵硬脂 酸酯但s s ) 和b 一谷甾醇烟酸酯( p s n ) 四种甾醇酯的最佳合成工艺，重结晶精制 工艺。采用气相色谱、红外光谱和质谱等方法对产品进行了定性分析。研究了植 物甾醇和植物甾酵酯在大豆色拉油中的溶解度。 初步研究了三种脂肪酶作生物催化剂在有机溶剂中对月桂酸甾醇酯的催 化效果：最终选定n o v 0 4 3 5 脂肪酶为催化剂，正己烷为溶剂，反应温度4 0 ，酶 用量为底物质量的1 5 ，底物摩尔配比为3 ：1 ( 月桂酸：警醇) ，反应时间为2 4 小时，酯化率达到3 6 5 。 3 ) 研究了p s a 、p s 0 、p s s 对高腊血症小鼠的治疗作用；与模型组相比，三 种甾醇酯可不同程度地降低高脂血症小鼠的血清总胆固醇( 1 ) 、低密度脂蛋白 ( l d l c ) 、动脉硬化指标( 朋) ，降低高血脂小鼠的肝重、肝脏1 和t g 。其中， p s a 与p s 0 对小鼠高脂血症的治疗效果比较理想，且明显好于p s s 。 4 ) 研究了p s o 的免疫调节作用：与s 1 8 0 荷瘤小鼠模型组比较，p s o 能显著 增加荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，效果优于环磷酰胺( c y ) 药物对照组； p s 0 对迟发型超敏反应强度的作用明显，但效果不如c y 组；p s o 虽能提高荷瘤小 鼠的脾细胞抗体生成能力，但未达显著水平( p 0 0 5 ) ；p s o 对荷瘤小鼠的血清溶 血素含量影响不明显( p 0 0 6 ) 。实验结果表明，p s o 具有一定的免疫调节作用。 5 ) 研究了含植物甾醇乙酸酯酸奶的制作工艺：乳酸杆菌和嗜热链球以1 1 的配比制作发酵剂；接种量为3 ，加糖量为5 ，甾醇乙酸酯添加量为o 6 5g ( 每 2 0 0m l 奶中1 ，在4 3 条件下发酵5h ，然后在o 一5 后熟2 4 h 制得。 关键词：植物甾醇酯；合成：降血脂；免疫调节；酸奶 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t p h y t o s t e r o lw a su s e da san o v e lf u n e t i o n a lf o o di n g r e d i e n tw i t hp l a s m ac h o l e s t e r o l l o w e r i n ga c t i v i t i e sf o ry e a r s i no r d e rt oi m p r o v es o l u b i l i t yo ff r e ep h y t o s t e r o l si ne d i b l e f a t s o i l s ，p r e p a r a t i o nt e c h n o l o g y , b i o a c t i v i t i e sa n da p p l i c a t i o n so fp h y t o s t e r o l se s t e r w e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l yi nt h i sd i s s e r t a t i o n i ti n e l u d e df o u rp a r t s ： 1 、g cm e t h o df o rt h eq u a n t i t a t i v eo fp h y t o s t e r o l sw a sd e v e l o p e d ：h p - 5c a p i l l a r y g a s c h r o m a t o g r a p h yc o l u m n ；f dd e t e c t o r ；i n j e c t o r3 0 0 ；o v e nt e m p e r a t u r e2 8 5 ； s q u a l f i n ea si n t e r n a ls t a n d a r d 2 ) f o u rk i n d so fp h y t o s t e r o l se s t e r si n v o l v i n gp h y t o s t e r o l sa c e t a t e ( p s a ) p h y t o s t e r o l s o l e t a t e ( p s o ) 、p h y t o s t e r o l ss t e a r i c ( p s s ) a n db s i t o s t a n o l n i c e t i n a t e 佃s i 0 w a ss y n t h e s i z e db yc h e m o s y n t h e s i s t h er e c r y s t a l l i z a t i o nm e t h o da n do p t i m a ls y n t h e t i c c o n d i t i o n so ff o u rp h y t o s t e r o l se s t e r sw e r es t u d i e d g c ，i ra n dm sw e r eu s e dt o d e t e r m i n et h ec o n f i g u r a t i o no fp h y t o s t e r o l se s t e r s t h es o l u b i l i t yo fp h y t o s t e r o l se s t e r a n dp h y t o s t e r o l si ns o ys a l a do i lw e r es t u d i e da sw e l l c o m p a r e dt h ec a t a l y s i so ft h r e el i p a s e sa sb i o c a t a l y s tt op h y t o s t e r o ll a n r a t ei na s o l v e n t l i c es y s t e mf o rp i l o ts t u d y ：t h en o v 0 4 3 5l i p a s ew i t ss e l e c t e d 勰b i o c a t a l y s t t h e 0 f t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ec o n f i r m e dt ob e4 0 m o l er a t i oo fs u b s t r a t e s 1 ：1 ，e n z y m er a t i oo v e rt o t a lw e i g h t1 5 ，r e a c t i o nt i m e2 4 h ，a n dt h ey i e l do f e s t e r i f i c a t i o nw 镐3 6 5 i nh e x a n e 3 ) o nt h e r a p e u t i ce f f e c t ：c o m p a r e dw i t ht h eh y p e m p i m = 0 cm o d e lg r o u p ， p h y t o s t e r o le s t e r sc o u l ds i g n i f i c a n t l yr e d u c et h es c r i mt c ，u d l ca n da i ，l o w e rt h e l i v e rw e i g h t t ca n dt gt h e r ew e r ed i f i e r e n ta c t i v ee f f e c t sa m o n gt h r e ep h y t o s t e r o l e s t e 璐，p s aa n dp s 0h a di d e a lt r e a t m e n te f f e c t so nh y p e r l i p i d e m i ai nm i c ea n db e t t e r t h a n p s s 4 ) t 0e v a l u a t et h ee f f c c t so fp s 0o rt h ei m m u n ef u n c t i o n ：c o m p a r e dw i t ht h e s 1 8 0 - b e a r i n gm i c em o d e lg r o u p ，p s oc o u l de n h a n c es i g n i f i c a n t l yt h ep h a g o c y t o s i n g r a t i oa n dt h ep h a g o c y t o s i n gi n d e x 伊 0 0 5o rp o 0 1 ) ，t h ee f f e c t so fp s ow e r eb e t t e r t h a n c y e l o p h o s p h a m i d e ：p s o a l s oc o u l d i m p r o v ee v i d e n t l yd e l a y e y p e h y p e r s e n s i t i v i t y ( p 0 0 5 ) t h er e s u l t ss h o w 也a tp s 0c o u l di m p r o v ei m m u n o l o g i cf u n c t i o n o f m i c e 5 ) i n v e s t i g a t e dt h ef e r m e n t a t i o ny o g u r tp r o d u c t i o nt e c h n o l o g yo fp h y t o s t e r o l s a c e t a t e t h ez y m o g e nw a sf e r m e n t e db ys t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u sa n dl a c t o b a c i u u s b u l g a r i c u st ol ：l ；i n o c u l a t i o nd o s a g ew a s3 ；t h ea m o u to fs u g a rw 秘5 ，t h ea m o u to f p h y t o s t e r o l sa c e t a t ew a s0 6 5 ( e v e r y2 0 0 m ly o g 皿r t1 ；t h ez y l n o l y 6 1 st i m ew a s5 h ri n 4 3 i tw a sb e s tt ob ec o l ds t o r e da to 一5 a f t e r f e r m e n t 4 t i o n a n du s i n g p o s t - a c i d i f i c a t i o n2 4h k e y w o r d s ：p h y t o s t e r o l se s t e r ；s y n t h e s i z e ；s e r u ml i p i d l o w e r i n g ；i m m u n e e n h a n c e m e n t ：y o g m t i i 佩 l 童工繁火港 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 董。垮日期：弗年6 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名 巷垮 日期：z “年6 月6 日 指导教师签名：节彳纠乡女e 趣令 日期：胪停f ；月6 日 湖北工业大学硕士学位论文 第1 章综述 1 1 植物甾醇的理化性质 植物甾醇是以环戊烷全氢菲为骨架( 又称甾核) 的一种化合物，由三个六元 环和一个五元环组成，c 3 位连有一个羟基，c 1 7 位连有8 1 0 个碳原子构成的侧 链。c 一5 位有双键的称为甾醇，c 一5 位饱和的称为甾烷醇；按c 一4 位甲基的有无可 分为4 一无甲甾醇，4 一单甲基甾醇和4 ，4 一双甲甾醇3 类，通常这3 类甾醇并存， 以无甲基甾醇为主。常见植物甾醇是b 谷甾醇( b s i t o s t e r 0 1 ) 、菜油甾醇 ( c 锄p e s t e m l ) 、豆甾醇( s t i g m 瓠t e r 0 1 ) 和菜籽甾醇( b r a s s i c 笛t e m l ) 等4 - 无甲基 甾醇，它们的结构极其类似，只是在分子骨架的侧链上存在差异( 见图1 1 ) 。 h b 谷甾醇( 8 s i t o s t e r 0 1 ) 菜油甾醇( c a m p 髓t c r 0 1 ) h 豆甾醇( s t i 肿a s t e r 0 1 ) 菜籽缁醇( 日n 豁i c 勰t e r 0 1 ) 图1 1 植物甾醇的结构式 f i g1 1t h es 缸u c t u r eo f p h y t o s t e 帕1 s 植物甾醇通常为片状或粉末状的白色固体，不溶于水、碱和酸，常温下微溶 于丙酮和乙醇，溶解于乙醚、苯、氯仿、乙酸乙酯、二硫化碳、右油醚。植物甾 醇相对密度略大于水，具有旋光性。植物甾醇在乙醇溶剂中结晶形成针状或菱片 状，在二氯乙烷溶剂中形成针刺状或长棱晶。 湖北工业大学硕士学位论文 1 2 植物甾醇的来源 植物甾醇属于天然物质，广泛分布于植物组织中，是油脂不皂化物的主要成 分。不同的植物油原料中植物甾醇的组成成分和含量均不同，但主要含有8 谷甾醇、 豆甾醇、菜油甾醇及菜子甾醇。 目前用于生产植物甾醇的原料主要为：1 ) 直接从菜籽油或豆油等植物油脱臭 馏出物中提取；2 ) 从加工后的松树油等木油中提取。据统计，全球植物甾醇的年 、总产量估计在5 0 0 0 吨左右，而其中7 0 以上来源于大豆油脱臭馏出物。 1 3 植物甾醇及植物甾醇酯的生理功能 目前一般认为，植物甾醇酯具有与游离植物甾醇同等的减低血浆总胆固醇和 低密度脂蛋白胆固醇的效果，在某些方面甚至效果更好。植物甾醇酯是由植物甾 醇和脂肪酸酯化而成，甾醇酯能够在人体内转化成甾醇和脂肪酸，所以其生理功 能包括植物甾醇和脂肪酸两部分所具有的生理功能，但主要是前者。 1 3 1 抑制胆固醇吸收的机制 自二十世纪五十年代始，人们就开始认识到植物胆甾醇具有降低血清胆甾醇 水平的功效。甚至在以较低剂量施用时( 每天数克) ，它们也可以降低胆汁胆甾醇 和饮食胆甾醇的被吸收性，从而降低了血清内总胆甾醇和低密度脂蛋白的水平。 目前，对于限制胆甾醇吸收的机理仍不很了解，许多研究者认为主要有三种可能 性“：抑制肠道对胆固醇的吸收：促进胆固醇的异化；在肝脏内抑制胆 固醇的生物合成。其中，在肠道内阻止胆固醇的吸收是最主要的方式。 植物甾醇的结构跟胆固醇相似，在生物体内以胆固醇相同的方式吸收，其吸 收比只有胆固醇的5 1 0 。许多研究证明，补充植物甾醇能明显降低血液中总 胆固醇( t c ) 和低密度脂蛋白( u ) l ) 含量，丽不降低高密度脂蛋白( ) l ) 和 甘油三酯( 1 t g ) 含量，使u ) l 卸d l 比值降低，并且没有任何明显的副作用。另 有实验证明植物甾醇对高 有一段降温时间和平衡时间，最终每检测一个样品要多花10min左右。实验高囊，饼鞴：睁潆一列萤尉鹜受灌；缈甾癣州囊蛭麴薹| ；d i 再五耄：；驯舒；驺郫叫酬甥封霞蘸萋碧嘟臻殉嘲自l 蒂：璧蕤测i 湖北工业大学硕士学位论文 1 5 植物甾醇酯的研究现状及开发应用 1 5 1 植物甾醇酯的研究进展 植物甾醇与脂肪酸直接酯化比较困难，般需要催化剂的作用才能完成， 关于甾醇酯的合成，国内的研究文章不多，而国外进行过许多有益的研究。其 中m i k k o n n o n 等“采用硫酸、磷酸或对甲苯磺酸作酯化催化剂，将植物甾醇与 羟基酸或二元羧酸( 酒石酸、戊二酸、抗坏血酸等) 进行酯化制取植物甾醇羟 基酸酯或二元羧酸酯。而m i e t l i n c e “在真空无溶剂条件下，以乙酸钠作催化 剂，将脂肪酸酯混合物与b 一谷甾醇制取甾醇酯。另外，h i g g i n s “在脂肪 酸作溶剂条件下，以n a h s o 。作催化剂，直接酯化制取甾醇脂肪酸酯，提供一种 无有机溶剂及无机酸的食品级生产工艺，可进行大规模生产。r o d e n “”等采用 硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸等为原料，以z n o 。作催化剂，在高真空下与植 物甾醇酯化合成甾醇酯，其产品纯度可达9 8 。l i nw 等。采用甾醇与共轭 亚油酸为原料，以磺酸、氯化锡作酯化催化剂或以甲醇钠、氢氧化钠作酯交换 催化剂合成共扼亚油酸甾醇酯，酯化在1 l o 左右的温度，真空度为1 3 3 p a 下进行，而酯交换在4 0 0 c 2 5 0 。c 温度下进行2 h 2 0 h 。 传统的化学合成方法需要采用强酸性催化剂并在高温条件下进行，所需时间 较长，反应过程中副反应多，产物分离纯化困难，且随着脂肪 x 湖北工业大学硕士学位论文 y u i is h i m a d a 【”瞎采用酶催化酯化法合成亚麻酸、二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二 碳六烯酸( d h a ) 等多不饱和脂肪酸( p u f a ) 甾醇酯。反应工艺条件为：应用 p s e u d o m o n a sa e m 舀n o s a 脂肪酶( 3 0 0 0 u 倌) 作生物催化剂，甾醇与p u f a 摩尔比为 1 ：3 ，温度4 0 ，搅拌速度5 0 0 f m i n ，反应2 4 h ，酯化率可达9 0 。 j e 玎yw 【圳等采用超临界c 0 2 作为酶催化合成植物甾醇酯反应的介质。反应中 使用c h i r 醒y m ei 广1 脂肪酶作生物催化剂，谷甾醇与c 8 c 1 8 的脂肪酸作为反应物， 压力控制在2 0 7 3 1 0 m p a ，温度控制在4 0 6 0 范围内，酯化率可达9 0 以上。 利用脂肪酶催化合成植物甾醇酯，为植物甾醇酯的生产开辟了一条新途径。 但目前脂肪酶价格昂贵，酯化率不高，给工业化生产带来了一定的困难。 1 5 2 植物甾醇烟酸酯的开发 把植物甾醇和烟酸各自的化学和生理活性特点结合起来，通过化学方法合成 制各成一种新的衍生化合物植物甾醇烟酸酯，可作为一种新型的预防和治疗 心血管疾病及其潜在状况( 包括动脉粥样硬化、高胆固醇血症、高血脂、血栓形 成) 的的降血脂药物，植物甾醇烟酸酯具有其独特的潜在优点： 1 5 2 1 结合了植物甾醇和烟酸各自的调脂作用特点，拓宽了治疗范围和治疗效果。 植物甾醇烟酸酯进入人体后，可被小肠中的酯酶逐渐水解，释放出游离的植物 甾醇和烟酸，它们不仅发挥出各自的生理活性作用，还有协同增效作用。游离植 物甾醇能降低血清总胆甾醇水平和u ) l c ，但对甘油三酯含量和h d i 广c 无显著影 响：而烟酸具有强效的降低甘油三酯和u ) i ，c 、升高h d l c 的作用。因此，结合 了植物甾醇和烟酸各自的降血脂特点的植物甾醇烟酸酯，可作为降低高血脂症的 调脂药物。 1 5 2 2 植物甾醇烟酸酯可大大减轻烟酸的副作用 烟酸大剂量应用时虽然治疗效果好，却由于出现皮肤瘙痒、潮红及肝的毒副 作用而使烟酸在临床的应用大大受到限制。而植物甾醇烟酸酪进入人体后，由于 植物甾醇和烟酸的释放速度缓慢，减轻了烟酸突然释放对肠胃的刺激。另一方面 烟酸在血中的药浓度能维持得更持久，使其在较小的剂量就发挥了有效的作用。 植物甾醇烟酸酯能延长药物作用时间，- 减少给药次数和服药量，减少不良反应的 发生率和强度，大大降低了烟酸的毒副作用。 1 5 2 1 3 与植物甾醇相比，植物甾醇烟酸酯具有更佳的应用性能。 游离的植物甾醇在水与油脂中的溶解性都很低，植物甾醇烟酸酯具有比游离 5 湖北工业大学硕士学位论文 植物甾醇更好的脂溶性，可方便添加于乳制品、植物油、肉制品等含油脂类基质 的食品中，此外，由于烟酸的吡啶环上的碱性氮原子能形成盐衍生物，若将其制 成盐酸植物甾醇烟酸酯，又可使其水溶性显著增加，掺入各种水基饮料中更加容 易。植物甾醇烟酸酯高效而全面的调节血脂效果，使其在实际应用时在更小的剂 量水平就能达到同样的治疗效果。 1 5 3 含植物甾醇酯制品的开发 随着人们生活水平的提高，心血管疾病的发病率已占据我国人口死亡原因之 首。卫生部近期制订的“我国心血管病发病趋势预测及2 1 世纪预防策略”中强调， 我国要大力开展心血管病健康教育，增强全民防病意识，贯彻预防为主的卫生方 针，采取全人群预防和高危人群预防并重，一级预防和二级预防并重的策略。以 前，国内广大高血脂患者并没有降血脂、预防心脑血管疾病的迫切意识，患者大 多等到病症出现后才去医院求医购药，导致降脂保健品市场份额较低。统计显示， 中国已有8 0 0 0 万高血脂患者，预防和治疗高脂血症医药保健品市场潜力巨大。经 过大力宣传和普及对高脂血症预防和治疗的基本知识，人们对心脑血管疾病预防 观念将日益增强，市场很快就会成熟并进入快速发展期。 按照美国血脂市场的发展历程及现状，用于一般人群预防的降脂保健品与用 于高脂血症治疗的降脂药品基本上平分秋色。膳食治疗是控制血脂异常最基本的 措施，已知采取低脂肪和低胆固醇饮食可使大部分成年人的血浆胆固醇和l d i 广c 水平降低，预防动脉粥样硬化的发生。但经过过份严格地去除脂肪和胆固醇等技 术加工处理后的食品，不仅会造成其它重要营养素的流失，而且常常会影响食品 原有的良好风味，从而导致老人、儿童和青少年的营养不良。与其它调节血脂功 能成分和降血脂药物相比，植物甾醇最独特的优点在于其安全性高，能够抑制肠 道对外源性胆固醇的吸收。植物甾醇酯具有安全性高、治疗范围广、应用性能良 好等独特优点，研究和开发以植物甾醇酯为主要功效成分的调节血脂保健食品产 品，市场前景极为广泛。 酸乳在营养功能上有许多特点。长期食用酸乳制品，由于乳酸菌在肠内繁殖 而产生乳酸，能抑制其他有害细菌的繁殖，使肠内细菌不产生毒素，增进身体健 康。其次在发酵过程中产生乳酸的同时也产生酒精发酵，因此能增强消化腺的机 能，促进食欲，增加肠的蠕动和机体的物质代谢。再次，乳酸菌还能产生抗生素， 有抑制各种炎症的效果。此外，乳酸菌还能形成b 族维生素和分解乳糖，有利于 乳糖酶缺乏的成年人饮用。含植物甾醇酯酸奶将有很大的发展前景。 6 湖北工业大学硕士学位论文 随着人们生活水平的提高，酸乳越来越受到人们的青睐。许多学者研究了保 健性酸乳的制作工艺。其中，周翠芳口等研究了低聚糖保健酸奶的制作工艺，黄亚 东【】将仙人掌添加到酸奶中的制作工艺进行了研究。另外，李晓光口等研究了含植 物甾醇酯的功能性蛋白饮料的制作方法及检测方法。本论文将甾醇酯添加到酸奶 中的制作工艺进行了研究。 1 6 本课题的研究背景及目的 我国是油料种植大国，从油脚不皂化物中可以提取植物甾醇【删，这样可以更 好的利用资源。植物甾醇能够抑制人体对胆固醇的吸收，是一种新型的降低血清 胆固醇的功能活性成分。植物甾醇的脂溶性和水溶性都很差，从而限制了它的实 际应用，为了更有效地利用植物甾醇，拓宽其应用范围，研究了植物甾醇酯的合 成工艺，生物功能活性及其含植物甾醇酯的酸奶制作。 国内目前关于植物甾醇酯的综述文章较多，但对植物甾醇酯的合成制备工艺、 理化性质、分析检测、功能活性和应用开发方面，只有很少的实验研究文献报道。 槽物甾醣酯的精肿瘤龟痞活件笔苴守堆理功能滔摊研察日前尚集丽寸赫辐谱 湖北工业大学硕士学位论文 2 1 前言 第2 章植物甾醇的气相色谱分析 测定植物甾醇的方法有洋地黄皂甙沉淀法，是借用动植物油脂中无甲基甾醇 总量的测定方法。此方法操作步骤多，分析时间长，干扰因素较多，所测含量偏 高，只能测定甾醇总含量。其次是u e b e 咖砌b u f c h a r d 可见光比色法，此种方法 虽然简单快速，但不能测定混合植物甾醇各组分含量，因此有一定的局限性【2 “。 采用薄层色谱法( 上) 分析时，大多是将甾醇分解成特定产物后进行，或者是将其 衍生化后进行。此方法手续繁琐，费时较长【2 7 1 。衍生化处理气相色谱法、毛细管 柱气相色谱法( g c ) 和高效液相色谱法饵p k = ) 等现代色谱分析方法，不仅能测定植 物甾醇的总量，还能够分别定量检测出四种甾醇组分的含量。 本章的研究目的，是为下一步进行植物甾醇酯的合成制备时，对原料和产品 提供方便快捷的定量分析方法。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 植物甾醇样品( 总含量9 5 6 ，其中含b 谷甾醇4 3 1 ，菜油甾醇2 1 3 ，豆 甾醇2 4 o j 菜籽甾醇5 2 ) ：从大豆植物油脱臭馏出物中提取，由武汉凯迪精细 化工有限公司提供。 b 谷甾醇标准品( b 谷甾醇5 6 2 ，菜油甾醇4 3 8 ) 、豆甾醇标准品、菜籽甾 醇标准品为美国s i g m a 公司产品。 角鲨烷、胆固醇、无水乙醇、9 5 乙醇、甲苯、正己烷等均为国产分析纯( a r ) 试剂。 气相色谱仪h p 5 8 9 0i i 型美国惠普公司 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 植物甾醇的气相色谱( g c ) 定量分析 色谱柱：h p - 5 号石英毛细管气相色谱柱( 3 0 m o 2 5 m m 0 2 勒m ) ；h p - 3 3 6 5 色谱工作站；f i d 检测器。载气：高纯n 2 ：柱流速：2 m u m i n ；尾吹气流速：3 0m l m i n ； 湖北工业大学硕士学位薹西 i ：菱鋈羹荔薹囊瑟夔 鏊娄萋鬻剖剖竖麓群萎j 鹾熏熨蘸茄沥鏊霾鎏芎；郛韩蒌塾霞器荔濠斡秘莪 矧；蔓嚣蛀雾黜薹吕缵型圳吾雾喧罐噍偏翌夔图镪墅滔最辫i 葬y n 蝗瑟塞垂，薹奏薹；。 蓬蟊星。粪酌囊薹雾耄蓁霪茎? 薹薹霎萋翥薹琵测薹黧裂鼎涮戡墓理eli 副剐彰剐些雪霉刖l 妻醺裂鳗曼菱 粪聋定省鼢扣i 毒i 赫卷舛捌嚣烈囊赋囊删翌疆塔耍二承尉霸；岳强娃谷甾醇鑫高 i 踅涵憾壤塑螽l g l 善篓霾羹i 赫囊露萋茎纠“霪嚣舔苍羹霪蚓嚣萧涌土燮。 l 。薹雾羹蜚囊l l l ；| 羹羹耀鋈藿磐羹羹冀鋈 囊鞠一蠹藿臻；器舶鎏泼羹萄夏蒌篓垂霆靛荔理瑟嶷拦馒蠼婴煎蠹手望窜 氯蠢蔷坛礓霎蠢菲耐0 国斡i 灞诵溺簖黼颤烈塔翟晕嚣，强慈鹌羹雾孺竺囊斟睿 镯剐农j 劐截副艇嚣戴；g 薹冀翼匿剥韶辖嚣翻嘤哩鱼誉戮蹩j 鋈粥鱼竖糸列 标准溶液哂点胡澍雏甄醋柳栋。蕾雷兰琢洽懿篙联；洋越罐惮嘎漭； i ? 墓，l 羹嚣季熏鋈萋鬟翼爨薹 銎骚季函a 垫剽鸟咧j 搴鳝熨醇含薹萋瓿治强粥鞘珀饕转觚嚣作为纵 鎏蒜錾蓥臻；眇靓酆冽要登舱掣型塑态l 睚群鲕样| ；磊簪筵唧归方程和相关磊骚 蟛望疆 x 湖北工业大学硕士学位论文 表2 1 植物甾醇的线性回归方程 t a b l e2 1r e 目e s s i o ne q u a t i o no fp h y t o s t e r o l 菜籽甾醇( b r 勰s i c a s t e f 0 1 ) y = 1 2 0 7 5x + 0 0 3 2 4 r = u 9 u 菜油甾醇( c 椰1 p e s t e m l ) y = 1 1 6 3 3 x 十0 0 0 6 5r = o 9 9 9 l 豆甾醇( s 衄m b t e m l ) y = 1 1 9 8 7x + o 1 3 2 6 r = o 9 9 6 2 b 谷甾醇( b i t o s t e r 0 1 ) y = 0 9 9 6 7x - o 0 0 1 5 r = 0 9 9 8 5 2 3 2 3 样品甾醇含量的测定( 内标标准曲线法) 准确称取约1 0 0 m g 的植物甾醇待测样品于5 0 m l 容量瓶中，加入角鲨烷内标溶 液1 0 1 l ，用甲苯定容。在相同色谱条件下进行分析，将待测样品各个甾醇峰面积 与内标物的峰面积比( x ) 代入相应的直线方程计算出浓度比( y ) ，则样品中各 个甾醇待测组分浓度分别为m i = m s 。四种甾醇组分各自的含量相加起来即为样 品中植物甾醇的总含量。 2 3 2 4 方法的精密度 称取1 0 0 m g 的植物甾醇样品于5 0 m l 容量瓶中，加入角鲨烷内标溶液1 0 玎1 l ， 用甲苯定容。平行测定5 次，根据上述回归方程计算求出样品的总植物甾醇含量， 总植物甾醇含量测定的相对标准偏差( 变异系数) 为2 8 。 2 3 2 5 加标回收实验 称取5 0 m g 的植物甾醇样品1 0 份予5 0 m l 容量瓶中，每份分别精确加入角鲨 烷内标溶液1 0 m l o 其中5 份再分别加入各植物甾醇标准贮备液1 舳l 用甲苯定 容，作为加标样品。在相同色谱条件下对待测样品和加标样品进行测定，按下列 公式计算加标回收率，总植物甾醇含量的回收率在9 7 1 0 0 之间。 p = ( ( x l 一) ( o ) m 】x 1 0 0 式中：p 卜加入标准物质的回收率 m 一加入标准物质的量 x l 加标样品的测定值 x 旷待测样品的测定值 湖北工业大学硕士学位硷文 ij 埔雨醺苯薹薹鬟篓囊錾囊篓萎冀鋈羹 l ，蓬ii 囊鍪誊蠢誊薹鬣羹鍪篓 黟目月氆葬辇甜蛙鞠螅雏譬日干婪鄂珊婪；一雾嚣鞫葫要餐彰器喜骚缎隧鞣； 磁俘萋涮分析时间i 在萋盏_ 内满瓣籀封矧j 揣雀键鬻躲箨键孺跫爵裤暂j 强 酗薹； 湖北工业大学硕士学位论文 3 1 前言 第3 章植物甾醇酯的制备 我国目前对植物甾醇的提取和精制技术研究较多，但对植物甾醇酯的合成方 法和工艺研究报道却很少，植物甾醇酯的应用开发研究还处于开始起步和探索阶 段。由于不同化学结构的各种羧酸与植物甾醇进行酯化反应的难易程度有较大的 差别，在研究中采用了酸酐酯化法和羧酸直接酯化法，合成了植物甾醇乙酸酯、 油酸酯和硬脂酸酯。为下一步研究甾醇单脂肪酸酯的生理活性功能提供实验材料， 并进一步探讨其构效关系，也为植物甾醇酯的基础研究和应用开发研究提供参考。 另外，我们通过化学合成了植物甾醇衍生物b 谷甾醇烟酸酯，可作为一 种新型的预防和治疗心血管疾病及其潜在状况( 包括动脉粥样硬化、高胆固醇血 症、高血脂、血栓形成) 的降血脂药物，能够把b 谷甾醇和烟酸各自的化学和 生理活性特点结合起来，同时可减轻烟酸的副作用( 临床易激动，皮肤潮红、瘙 痒和胃肠反应) ，拓宽了治疗范围并提高治疗效果。 酶具有在温和条件下高效和专一的催化性能，传统酶学研究的是酶在水介质 中的催化反应。近年来，非水相中的酶催化反应已经在理论上和应用上取得了很 大的进展，为脂肪酶催化反应提供了新的发展机遇和应用前景。关于脂肪酶催化 植物甾醇酯的合成反应国外研究较多，国内迄今为止尚未见酶催化合成植物甾醇 酯的实验研究报道，本章对脂肪酶催化月桂酸甾醇酯的制备工艺进行了初步研究。 3 2 植物甾醇乙酸酯的制备 3 2 1 材料和方法 3 2 1 1 实验材料与试剂 植物甾醇( 总含量9 5 6 ，其中含b 谷甾醇4 3 1 ，菜油甾醇2 1 3 ，豆甾醇 2 4 o 菜籽甾醇5 2 ) ：由武汉凯迪精细化工有限公司提供。 b 谷甾醇乙酸酯标准品：美国s i g m a 公司产品。乙酸酐、吡啶、无水乙醚、苯 ( 干燥处理) 、无水乙醇、丙酮、甲醇、无水硫酸钠、碳酸钠、浓盐酸、角鲨烷、 甲苯等均为国产分析纯( a r ) 产品。 毛细玻璃管：内径1 m m ，外径最大为2 m m ，长度为8 0 m m 。 湖北工业大学硕士学位论文 水银温度计：最大刻度为5 0 ，分度为o 1 3 2 1 2 实验仪器 紫外可见分光光度计 傅立叶红外分光光度计 气相色谱仪 循环水多用真空泵 旋转蒸发器 集热式磁力搅拌器 不锈钢电热恒温水浴锅 3 2 1 3 实验方法 3 2 1 _ 3 1 反应方程式 u v - 2 4 5 0 型 n e ，s 型 h p 5 8 9 0 i i 型 s h z c 型 s h z c 型 d f 1 0 1 s 型 g s y i i 型 毗啶 - - - - - - - - - - - 加热 c h 3 c o o 日本岛津公司 美国n i c o l e t 公司 美国惠普公司 河南巩县英峪仪器厂 河南巩县英峪仪器厂 郑州长城科工贸有限公司 北京市医疗设备厂 + c h 3 c 0 0 h 图3 1 植物甾醇乙酸酯合成反应方程式 f i g 3 1r c a c t i o ne q u a t i o no fp h ”o s t e r o la c e t a t e 3 2 1 3 2 植物甾醇乙酸酯的合成方法 采用植物甾醇与乙酸酐直接酯化的方法合成甾醇乙酸酯，以乙酸酐同时作为 反应原料和反应溶剂，吡啶为催化剂。在装有回流冷凝管、温度计的三口烧瓶中， 依次加入甾醇、乙酸酐和无水吡啶，电磁搅拌，油浴加热，恒温反应一定时间， 待乙酰化反应完全后，停止加热，冷却至室温。产物水洗后转入分液漏斗，并用 乙醚萃取三次，合并乙醚萃取液；用l ：8 ( 体积比) 的盐酸溶液洗涤一次后水洗至 中性；然后再用5 的碳酸钠溶液洗涤一次后水洗至中性，最后用无水硫酸钠干燥， 干燥后的溶液用旋转蒸发器除去乙醚溶剂，冷却后即制得甾醇乙酸酯粗产品。 3 2 1 3 3 甾醇乙酸酯的重结晶精制 用无水乙醇作溶剂，控制水浴温度7 6 ，加热搅拌使甾醇乙酸酯粗产品溶解； 缓慢冷却至1 0 ，结晶，抽滤，得到白色片状晶体。产品经过二次重结晶后，8 0 干燥二小时，称重计算产率。 1 4 7 。弋。 睇 睇 + 舻 帅 湖北工业大学硕士学位论文 3 2 1 3 4 反应过程监测和酯化率的测定 采用毛细管柱气相色谱法( g c ) 对甾醇乙酸酯的合成反应过程进行跟踪检测， 通过少量取样分析反应液中甾醇的量来判断酯化反应进行的程度。酯化率按下列 公式进行计算： 酯化率( ) = 【1 - ( w 删1 ) 】1 0 0 式中：w ，酯化反应前体系中甾醇含量： w r 酯化反应后体系中缁醇含量。 3 2 1 3 5 植物甾醇乙酸酯产品的气相色谱定量分析 条件同植物甾醇气相色谱定量分析，色谱条件见第二章2 2 1 节。采用内标 标准曲线法进行定量分析。 3 2 1 3 6 植物甾醇乙酸酯产品的红外光谱分析 采用全反射光谱测定法( a 孤) ，欧米采样器采样3 2 次，在4 0 0 0 锄4 4 0 0 皿1 对经过重结晶精制处理的植物甾醇乙酸酯产品进行扫描，进行红外光谱分析。 3 2 1 3 7 植物甾醇乙酸酯的熔点分析 按照国标g b 5 5 3 6 8 5 的要求：将重结晶得到的甾醇乙酸酯样品在l l o 烘箱内 恒重1 h 。取洁净干燥毛细玻璃管3 支，分别吸取试样达1 0 姗高度，用喷灯火焰将 吸取试样一端封口，然后放入烧杯中，置于4 l o 冰箱中过夜，到时取出用橡皮 筋将3 只毛细玻璃管紧扎在温度计上，使试样与温度计水银球相平。在5 0 0 m 1 烧 杯中，先放入半杯水，悬挂一只温度计，然后将试样管和温度计悬挂在杯中，使 水银球浸入水中3 0 岫处，开始水浴加热，同时搅动。开始水温为8 ，使水温上 升速度为0 5 m i n 。当甾醇乙酸酯样品变为透明时，记下温度变化情况。 3 2 2 结果与分析 3 2 2 1 酯化反应体系的确定 甾醇和乙酸酐在摩尔比为1 ：1 即可发生酯化反应，为了使甾醇酯化反应完全， 我们采取乙酸酐过量的方法。经过多次实验，确定甾醇与乙酸酐的摩尔比为1 ：9 为宜。使用吡啶作为本实验的缚酸剂，用量为乙酸酐用量的二分之一( 体积比) 。 控制原料的摩尔比( 甾醇：乙酸酐：吡啶) 为1 ：9 ：5 ，反应时间为2 0 h ，反 应温度分别取7 5 、8 0 、8 5 和9 0 强进行酯化反应，通过气相色谱分析测量反 应的酯化率。从图3 2 可以看出，提高反应温度对反应有利，反应温度为8 5 时 反应已基本完全。 湖北工业大学硕士学位论文 甾醇：乙酸酐：吡啶= 1 t9 ：5 ，反应时间为2 0 h 图3 2 温度对酯化反应的影响 f i g 3 2e 骶do ft c m p e r a t u r co nc s t c r i 6 础i o n 托a d i o n 控制原料的摩尔比( 甾醇：乙酸酐：毗啶) 为l ：9 ：5 ，反应温度为8 5 ，反 应时间分别取1 5 h 、2 h 、2 5 h 和3 h ，重复上述酯化反应，通过气相色谱分析，计 算反应的酯化率。从表3 3 可以看出，延长反应时间对反应有利，反应时间为2 h 时反应己基本完全。再继续延长反应时间，酯化率增加很小，但副反应增加使反 应产物颜色加深，所以酯化反应时间以2 h 为宜。 甾醇：乙酸酐：吡啶= l t9 ：5 ，反应温度为晒 图3 3 反应时间对酯化反应的的影响 f i g 3 _ 3e 地c to ft i m eo n 髂t e 蠲c t i o nr e a c t i o 3 2 2 2 产品的红外光谱分析 由植物甾醇乙酸酯的红外光谱图( 图3 5 ) 与植物甾醇的红外光谱图( 图3 4 ) 1 6 湖北工业大学硕士学位论文 对比分析后可知：游离植物甾醇有明显的羟基伸缩振动吸收峰( 1 ) 一0 h = 3 4 3 1 c m 1 ) 在酯化反应后消失；植物甾醇乙酸酯的红外光谱图中多了羰基( 1 ) c ：o = 1 7 3 2c m 4 ) 和c o c ( 1 2 4 9c m 。1 ) 二个吸收峰，是典型的酯类的红外光谱特征，说明甾醇与 乙酸酐的酯化反应进行完全。 mm1 w “* q 图3 4 植物甾醇的红外光谱图 f i g 3 4 ls p e c 拄u mo fp h y t o s t e r o l m m 日，i w _ “n m 旧十” 图3 5 植物甾醇乙酸酯的红外光谱图 f i g _ 3 5 ts p e c t m mo fp h y t o s t e m la c e t a t e 3 2 2 3 植物甾醇乙酸酯的熔点分析 熔点是物质从固态转交为液态时观察到的温度值，也就是固态和液态的蒸汽 压相等时的温度值。每种物质都有其固定的熔点范围，它是物质的一种特性指标i 通过测定物质的熔点来判断物质的纯度。甾醇乙酸酯的熔点测定见表3 1 ，从表中 可以看出，甾醇乙酸酯的熔点变化范围为1 3 5 1 3 8 ，熔程短，纯度较高。 1 7 湖北工业大学硕士学位论文 为了得到最佳摩尔比，我们选择便宜原料油酸过量，从图3 9 可以看出，随着 油酸与甾醇摩尔比的增加，产品的酯化率成缓慢上升趋势。但在实际生产过程中 油酸过量不利于最终产品的分离提纯，所以本实验酸醇比以1 _ 3 ：l 进行。 为了确定最佳反应温度，我们分别选取了一系列温度进行酯化。从图3 1 0 中 可以看出，产品的酯化率随着温度的升高而增加，但到了1 3 5 以后，酯化率增加 的幅度变小，特别是从1 4 0 到1 5 0 增加的幅度更小。随着温度升高，产品的颜 色也逐渐加深，所以实验温度控制在1 3 5 为宜。 相对于反应物，催化剂用量一般以1 3 ( 摩尔) 提供通常有效。本实验催 化荆以2 的量提供。通过气相色谱跟踪检测，发现7 h 反应基本完成。 3 3 2 2 产品的提纯工艺 先用2 的碳酸氢钠溶液进行搅拌洗涤，离心分离，可以去掉了大部分油酸。 然后用少量乙醇进行洗涤，边搅拌边加热到4 5 左右，洗涤三次后，再经真空干 燥。部分游离植物甾醇和油酸可溶解于热乙醇中除去。经检测，甾醇油酸酯产品 的酸价( 以m 2 举o h 倌计) 为2 3 ，游离植物甾醇的含量为3 5 ，产品的纯度为 9 0 8 7 ，样品由气相色谱分析检验发现已无二甲苯残留。经过上述提纯所得的甾 醇油酸酯产品为浅黄色油状物质，有淡淡的油香味而无异味。 3 3 2 3 甾醇油酸酯的红外光谱分析 植物甾醇油酸酯的红