草乌炮制前后化学成分论文最终版.docx

草乌炮制前后化学成分、毒性比较吕岩（南京中医药大学中药学 江苏 南京 210046 ）摘 要 通过实验比较炮制前后草乌的化学成分、药效作用、毒性的变化。关 键 词 草乌 炮制 化学成分 毒性前 言 中药草乌为毛莨科乌头属植物北乌头(Alkusnezoffii)的块根。味辛、苦；性热；有大毒。具有祛风除湿、温经止痛的功效。现代药理学研究表明，乌头的提取物具有镇痛、消炎、麻醉、降压及对心脏产生刺激等作用,其有效成分为生物碱。这类生物碱有很强的毒性，人口服乌头碱0.2mg即可引起中毒，乌头碱的致死量为34mg；常见的中毒症状主要以神经系统、循环系统和消化系统的表现为主1。为了降低乌头药材的毒性,历代医家分别采用了不同的炮制方法2，如草乌：唐代有姜汁煮、醋煮、山矾灰汁浸等的炮制方法，宋代有炒焦、炒黑存性等。现通过实验比较炮制前后草乌化学成分、药效作用、毒性的变化。 1、草乌药材的炮制1.1草乌炮制的目的 草乌炮制的目的是为了降低药材中所含的毒性物质，以减少在用药过程中的风险，达到安全用药的目的1.2草乌炮制降毒原理 草乌中含有双酯型生物碱（乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等），具有强毒性，但该类双酯型生物碱性质不稳定，遇水、加热易被水解，使极毒的双酯型乌头碱C8 位上的酯基水解，生成单酯型生物碱：苯甲酰乌头胺（乌头次碱Benzoylaconine）、苯甲酰中乌头胺（Benzoylmesaconine）、苯甲酰次乌头胺（Benzoylhypaconine），其毒性为双酯型乌头碱的1/501/500。再进一步水解，使C14位上的酯基水解，生成醇胺型乌头原碱类：乌头胺（乌头原碱Aconine） 、中乌头胺（Mesaconine）、次乌头胺（Hypaconine），其毒性仅为双酯型乌头碱的1/20001/4000。另一原因可能是炮制过程中脂肪酰基取代了C8位上的乙酰基，生成脂碱，从而降低毒性。1.3草乌炮制方法 制草乌 按中国药典制草乌“制法”项下方法炮制：取草乌，大小分档，用水浸泡至内无干心，取出，加水煮沸，至取大个及实心者切开内无白心，口尝微有麻舌感时，取出，晾至六成干，切厚片 ,干燥。生草乌 草乌晾干,切厚片,干燥。分别取上述炮制品各30g，用适量水煮2次，约四十分钟，共制得100ml，即为30%的草乌煎液（每ml煎液相当于生药0.3g）分别即为生品水煎液A、煮品水煎液B。-用于药理实验分别取上述生草乌和煮草乌20g，粉碎，过三号筛，备用。-用于含量测定 2、酯型生物碱的含量测定32.1色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 流动相乙腈-四氢呋喃（25:15）(A)-0.1mol/L乙酸铵（1000ml加乙酸0.5ml）（B）梯度洗脱（015min,16%19%A；1545min,19%22%A；4560min,22%35%A,6575min,35%A），流速0.8ml/min；柱温30；检测波长235nm。 2.2对照品溶液的制备 分别精密称取新乌头碱2.37mg，乌头碱2.04mg，次乌头碱1.61mg，苯甲酰新乌头原碱4.02mg，苯甲酰乌头原碱 3.04mg，苯甲酰次乌头原碱 3.19mg，置于 10ml 量瓶中，加0.05%盐酸-甲醇溶液，稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品 溶液。 2.3标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液2,4,6,8,10,12,16,20L，分别注入液相色谱仪，峰面积为纵坐标，进样量(l)为横坐标，绘制标准曲线。2.4供试品溶液的制备 分别称取草乌及其炮制品粉末( 过三号筛) 2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入氨试液 3ml 与异丙醇-乙酸乙酯( 1:1) 混合溶液 50ml，摇匀，称定质量，放置16h，连续超声 30min，冷却，称定质量，用混合溶液补足减失质量，摇匀，滤过，精密移取续滤液 25ml，于 40 以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入 0.05%盐酸-甲醇溶液 5ml溶解，摇匀0.45m 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。2.4样品含量测定 分别吸取供试品溶液生草乌和煮草乌各10l及对照品溶液10l注入液相色谱仪,进行测定。每份样品重复测定3次,取其平均值。通过标准曲线计算六种生物碱的含量。3.炮制对草乌药理作用影响的研究草乌具有良好的镇痛、抗炎和免疫抑制作用,但因其毒性大,临床上常因用药不当而造成中毒甚至死亡。现代对草乌进行了比较广泛的研究。我们小组选择利用小鼠扭体反应，研究草乌炮制前后对镇痛效果的影响。3.1药效试验草乌炮制前后对镇痛效应的影响3.1.1器材和药品 注射器、秒表 ；0.3g/ml炮制前后的草乌水煎液A、B（炮制方法见前），0.6%醋酸水溶液，生理盐水， 0.4%哌替啶生理盐水溶液 ；实验动物为小白鼠（18-22g）3.1.2实验步骤 取体重18-22g的健康小白鼠40只，随机分成四组，每组10只，第一组腹腔注射0.4%哌替啶溶液20mg/Kg,第二组腹腔注射生理盐水0.1ml/10g, 第三组腹腔注射0.003g/ml(吸取1ml水煎液A至100ml容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度)生品草乌水煎液0.1ml/10g,剂量为0.03g/kg。第四组腹腔注射煮0.003g/ml（吸取1ml水煎液B至100ml容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度）制草乌水煎液0.1ml/10g,剂量为0.03g/kg。药后半小时，每鼠均由腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2ml/只，观察扭体潜伏期以及0-15min,15-30min的扭体次数。实验结束后计算镇痛百分率。4.炮制前后草乌的毒性比较我们通过小鼠死亡率来评价炮制前后草乌的毒性变化4.1毒性试验草乌生品和炮制品的死亡率的变化4.1.1器材和药品 注射器、烧杯、计时器；0.3g/ml炮制前后得到的草乌水煎液（炮制方法见前）；动物为小白鼠（18-22g）。4.1.2实验步骤 取小白鼠雌雄各半，随机分组。各剂量每组10只，分别灌胃生品和炮制品的药物，注射量为0.1ml/10g体重,剂量为3g/kg，观察24小时内死亡率并记录。总 结炮制是降低草乌毒性的第一步，是系统研究草乌的起点。通过炮制草乌的毒性降低，是目前我们所能研究草乌的唯一契机。目前草乌炮制方法仍以水煮、蒸制法为主，较少应用高压蒸制或微波炮制等方法。虽然应用 2010 年版中国药典中方法炮制时，草乌中各含量的变化较稳定，但人力、物力、财力消耗大，且根据口尝的方法鉴定炮制终点的随意性比较大，所以对草乌的炮制进行