SP及VIP.doc

便秘实验方案1.VIP. SP检测 （1）原理 神经肽在便秘的发生过程中具有重要作用1-3。胃肠肽由胃肠神经分泌释放，而肠神经广泛存在于肠道薪膜层、薪膜下层、肌层.神经肤是主要起传递信息作用的生物活性多肤，扮演着神经激素、神经递质、神经调质和细胞因子等多种角色，是调节胃肠功能的重要因素.一般来讲，薪膜下神经丛主要参与肠道分泌和吸收功能，而肌间神经丛主要参与肠道运动功能的调节4.目前已确认的肠神经递质或调质多达数10种，其中兴奋性递质主要包括SP、乙酞胆碱等;抑制性递质包括VIP)、NO、三磷酸腺苷(ATp)等.小鼠结肠P物质(substance P, S P)是由胃肠道固有神经或外来神经释放，存在于胃肠道薪膜神经丛、肌间神经丛，是调节肠道作用最强的兴奋性肤能神经递质，能抑制肠道豁膜分泌，刺激肠道运动，可直接作用大肠纵行肌环行肌引起收缩，增加结肠收缩和运动4，SP可引起大鼠食道平滑肌收缩,促进食物下移。其增高可有效促进胃肠运动,国内外学者对慢性传输型便秘患者结肠进行研究后认为慢性传输型便秘的产生可能与结肠肌间神经丛内SP含量减少有关5-9，可能是导致结肠传输功能减弱的原因之一VIP,血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)能神经按神经元功能不同分为运动神经元和分泌神经元.前者其传出主要使胃肠括约肌舒张，后者则主要刺激肠液分泌l0，VIP是由28个氨基酸组成的肽类,是抑制性神经元的非肾上腺素能、非胆碱能递质。它使结肠运动减弱,舒张肠管,参与水及电解质的吸收。长期便秘患者远端结肠的VIP神经成分减少或缺失,肌层中的VIP含量少于正常。VIP可以使结肠运动减弱.尽管VIP能神经是胃肠道运动的抑制性神经，但国内外大量学者通过对慢性便秘患者及慢性传输型便秘大鼠结肠VIP能神经进行免疫组化研究认为，其结肠肌层内VIP能神经呈减少趋势11，并认为VIP是产生下行性抑制的重要因素，其含量降低可能导致肠神经系统传输障碍，产生传输减慢12.同时由于VIP浓度降低可能引起结肠出现过度的阶段性蠕动，使有效推动减弱13-16.【参考文献】1.Sjolund K,Fasth S,Ekman,Hulten L,JIborn H,Nordgren S,Sundler F.Neuropeptides in idiopathic chronic constipation(slow transit constipation).Neruogastroenterol Motil 1997;9;143-1502.刘诗，高再荣，钱伟，易粹琼慢性便秘患者直肠P物质和血管活倒易肤含量的变化.中华内科杂志2001;40:6083.潘仁智，王业皇，张苏闽便秘患者血清NO检测及其临床意义的初步探讨.右江民族医学院学报2004;26:3684.王志均.胃肠激素.北京:科学出版社，1985: 210-3075.童卫东，张胜本，张连阳，高峰，杜文华，牟江洪.慢性传输型便秘肠神经系统一氧化氮合酶和P物质的分布意义.世界华人消化杂志1998; 6: 380-3826.丁义江，哈楠林，丁曙晴，徐文华，耿建祥.结肠h.R传输型便秘与突触素和P物质及血管活恻易肤的临床研究.中华胃肠外科杂志2004; 7: 485-4877.高峰，张胜本，张连阳，陈俐.慢传输型便秘乙状结肠VIP, SP免疫组化研究.中华消化杂志1998;18: 34-368.Wedel T, Roblick UJ, Ott V, Eggers R, SchiedeckTH, Krammer HJ, Bruch HP. 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Auton Autacoid Phannacol 2003; 23:149-158附：方法:剪取小鼠近端结肠2 cm，纵行剖开，NaCI(含Na 9 glL)漂洗后，固定于40叭中性甲醛溶液中，常规脱水、石蜡包埋，常规切片机切片，厚约4 m.分别进行HE染色和免疫组化染色.采用Envision免疫组化染色法(两步法)，光学显微镜下，采用中文IMS细胞图像分析系统，每张片随机取3个视野，对SP,VIP含量进行定量分析，并对免疫组化指数进行统计.另可测大鼠VIP.SP（2）方法 结肠肌间神经丛标本制作大鼠禁食12 h,3%戊巴比妥钠麻醉后,通过腹部正中切口暴露腹腔,切取整段结肠。结肠取材后用0.01 .mol/L磷酸缓冲液(PBS)(pH7.4)冲洗。以4%的多聚甲醛充盈到合适程度后将结肠两端扎紧,立即放入4%多聚甲醛液中固定68 h(4),再移入30%蔗糖液中(4)过夜。然后将固定好的结肠取出,用0.01 mol/L PBS漂洗三次,再将肠管剪成长约1 cm的小段,将一粗细合适的玻璃棒插入肠管,然后用镊子在肠系膜附着处沿肠管纵轴划痕,用镊尖沿划痕轻轻剥离纵肌层,制作肌间神经丛铺片标本,将铺片标本收集在0.01 mol/L PBS中保存(4)。免疫组化染色将制备好的结肠肌间神经丛铺片标本用0.01 mol/L PBS充分漂洗,置入0.3%过氧化氢(37)孵育30 min,去除内源性过氧化物酶活性,0.01mol/L PBS漂洗35 min;然后在10%正常山羊血清中孵育30 min(37),滴加一抗(150),先孵育(37)3 h,然后在4冰箱内过夜,0.01 mol/L PBS漂洗35 min;生物素标记的二抗孵育(37)2 h,0.01 mol/L PBS漂洗35min;辣根酶标记链霉卵白素孵育(37)1 h,0.01 mol/LPBS漂洗35 min;DAB显色35 min,自来水冲洗,贴片、晾干、脱水、透明、DPX封片。对照实验:用羊血清替代一抗。染色结果判断使用德国Leica公司生产的QWin图像处理及分析系统对染色结果进行分析。于40倍光镜下每张铺片随机选取35个视野,图像经摄像机摄入后存入计算机内,进行彩色值分割参数估计,计算阳性神经的平均面密度。面密度是指目标面积占统计场面积的百分比,反映阳性神经在铺片标本中的含量.2.血红素氧合酶2（1）目的：内源性一氧化碳(CO)是肠道非肾上腺素非胆碱能神经(NANC)分泌的抑制性神经递质，对调节胃肠运动有重要作用。血红素氧合酶(Ho)是co合成的关键酶，有三种同工酶，即诱导型HO(HO-l)，原生型HO(Ho-2)和Ho-3 (不产生co，功能尚不清楚).其中HO-2则主要分布于脑和胃肠道平滑肌8，胃肠道的Ho-2主要分布于肠道粘膜下神经丛与肌间神经从，应激能提高HO-2活性.CO和No在人体某些功能中的作用较相似，是重要的化学信号物质，调节神经递质传导、平滑肌的紧张性及其对细胞损伤反应，并在细胞功能和信息联络发挥重要（2）方法: 将48只小鼠随机分为实验组A，实验组B和对照组（N=16).实验组A和B分别吗啡2.5mg/(kgd)和3.5mg/( kgd)，对照组以等量生理盐水，处理45d.各组随机处死小鼠一半(为实验组Al、Bl及对照组1).其余小鼠继续饲养并停药观察15d(实验组AZ、BZ及对照组2).第60天处死全部小鼠，处死前予炭末推进法评价结肠传输运动功能符合结肠慢传输运动小鼠模型，取各组小鼠近端及远端结肠组织各0.5cm.小鼠粪便性状采用Bristol分级.2免疫组织化学检测HO-2表达:HO-2一抗及免疫组化试剂盒均购自Promega公司，二抗(羊抗兔抗体，工作液浓度)购自北京中山生物科技公司，按说明书进行常规免疫组化检测，PBS代替一抗作为阴性对照.阳性结果判断:胞质染色呈棕色者判定为阳性细胞.（3）免疫组化结果分析：结肠孰膜下神经丛与肌间神经丛可见丰富的深棕色颗粒，即HO一2阳性神经纤维，环肌和纵肌内HO一2阳性细胞较乳膜下、肌间层明显减少.各实验组阳性细胞较对照组明显减少;大剂量吗啡处理的实验组比小剂量组阳性细胞明显少;第60天时各实验组较第45天时各实验组HO一2阳性细胞的表达减少(图l).3. 结肠肌间神经丛5-HT和AchE的影响（1）原理：Ach是肠道兴奋性递质,能刺激平滑肌收缩,参与上皮的吸收及分泌过程,而它又是兴奋肠肌收缩的递质4。胆碱能神经元释放后,与平滑肌膜表面的M受体结合,使胃肠平滑肌收缩。M受体有两种亚型:(1)和电位敏感Ca2+通道耦联的M受体亚型,此型对乙酰胆碱作用很敏感,小剂量Ach使其开放。(2)和受体活化Ca2+通道耦联的M受体亚型,该型受体对Ach作用极不敏感,大剂量Ach与M受体结合,打开电位敏感性Ca2+通道或受体活动Ca2+通道,致细胞外Ca2+内流,细胞内Ca2+浓度升高,肌膜去极化。细胞内Ca2+浓度升高继发性引起胞内cGMP含量升高,cGMP促进肌质网释放Ca2+,使胞内Ca2+浓度进一步升高,胃肠平滑肌收缩。Ach引起平滑肌收缩,必须要有足够的神经元释放,而且要有足够的受体结合,有研究表明刺激STC结肠后Ach释放减少13,STC患者结肠对胆碱能神经激动剂的反应性明显减弱14。乙酰胆碱是胃肠道重要的兴奋性神经递质。它能调节多种离子的跨膜转运:如促进钙离子内流、抑制平滑肌细胞膜的钾电流、活化氯离子通道及非选择性阳离子通道等;乙酰胆碱还能使平滑肌去极化,刺激胃肠壁内胆碱能神经产生兴奋性接头电位、影响平滑肌的电活动,使平台期电位幅值增加时程延长15。研究发现慢传输型便秘患者结肠对胆碱能激动剂的反应明显减弱16。（2）给药及检测方法各组用药剂量:正常组和模型组不予任何药物,乳果糖组予乳果糖口服液6.2 ml/(kgd);养血润肠方各剂量组依次给予养血润肠方17、34、68 g/(kgd)。造模成功后次日,灌药组分别按动物体表面积换算法计算剂量灌服各组小鼠,每日1次,连续14天。正常和模型组则灌服等量生理盐水,每日1次,连续14d。末次给药后,处死动物,打开腹腔,分离大肠,切取结肠段组织约2 cm,10%甲醛固定,行5-羟色胺(5-HT)、乙酰胆碱酯酶(AchE)免疫组化染色。(3)染色组化结果判定半定量分析半定量分析标准为:所有视野未见阳性细胞为(-);有少数弱阳性神经元为(+),染色呈淡黄;阳性细胞较多见为(+),染色呈棕黄;阳性细胞多见为(+),棕褐色。图像分析 每组选5例染色良好的切片。在显微镜物镜放大20倍下观察。以肌间丛为中心每张切片随机选取5个视野。共25个视野摄入计算机。测量每个视野阳性染色区域的表面积密度。即面密度:单位观察空间内所含某相的表面积。最后计算每组的平均值。统计学处理 实验数据应用SPSS12.0统计软件包进行统计学处理,等级资料采用Ridit分析检验,计量资料以均数标准差(xs)表示,采用单因素方差分析。没有高效液相检测5-羟色胺(5-HT)、乙酰胆碱酯酶(AchE)4结肠组织匀浆及血清中NO的影响（1）原理 近年来研究发现,一氧化氮(nitric oxide,NO)作为一种新型信号分子调节内皮细胞、平滑肌、平滑肌细胞和神经等功能,参与炎症与组织损伤,在消化、循环、免疫等全身多系统的生理、病理生理及有关临床疾病中其着重要作用。 NO在肠道的生理活动中具有重要的生理功能3。如调节肠粘膜血流量,抑制白细胞在血管内皮细胞表面粘附,抑制髓过氧化酶活性(MPO)及杀死病原微生物等。NO自由基的作用机制尚未完全明了,大多数学者倾向以下机制4:NO生成过程中有大量有很强生物氧化功能的自由基生成,这些自由基使巯基蛋白和脂质氧化,并影响线粒体电子传递功能,造成组织细胞损伤。近几年来的研究证实,NO是非肾上腺素能、非胆碱能(NANC)神经所释放的主要抑制性递质,在胃肠运动及胃肠病理中起着重要的作用5。（2）给药及检测方法各组用药剂量:空白对照组和模型组不予任何药物,只灌服等量生理盐水;乳果糖组组予乳果糖口服液,6.2 ml/(kgd)。养血润肠方小、中、大剂量组分别给予17,34,68 g/(kgd)养血润肠方。造模成功后次日,各组分别按动物体表面积换算法计算剂量灌服各组小鼠,每日1次,连续14天。末次给药后,摘除眼球取血,处死动物,打开腹腔,分离大肠,切取结肠段组织0.2 g于冰冷生理盐水中研磨成10%匀浆液。而后血清以3 000 r/min离心共15分钟,结肠匀浆液均用离心机以10000 r/min离心共10分钟,分别取其上清液,按试剂盒方法分别测出结肠组织匀浆液及血清中NO含量。5. 5-羟色胺受体4和生长抑素基因（SS）的表达（1）原理 目前已知5-羟色胺受体(5-HT-R)至少存在7种类型,其中5-HT4-R对促进胃动力起重要作用,此为开发促动力、治疗便秘药物的重要理论依据1。Mader2等在检测5-HT受体亚型在胃的不同部位的分布实验中发现, 5-HT4-R的激活能导致胃窦、胃体收缩,同时促进Ach释放,从而加速胃排空。在慢传输型便秘(STC)患者结肠中, 5-HT4-R阳性染色在黏膜层、黏膜下神经丛、肌间神经丛及肌层等均明显减少,强度降低,提示S T C结肠中存在5-HT4-R表达下降,从而影响了肠蠕动、分泌反射的正常进行,参与了S T C的产生3。生长抑素(SS)广泛分布于脑及胃肠道内,其对胃肠道内分泌、外分泌、小肠的吸收和运动等具有广泛的作用。SS能神经元存在于肌间神经从,能抑制胃肠平滑肌运动,延长肠道通过时间。大剂量的SS可破坏消化间期移行性复合物(Migratingmotor complex,MMC)活动,并抑制MMC向空肠及回肠的移行。有研究证实,生长抑素可抑制胃固体排空、抑制胃张力性收缩、减小进餐前后胃容量改变、延长小肠和结肠转运时间,且发现在一些因肠道移行过慢所致便秘患者的结肠粘膜中SS含量明显上升4。（2）方法 小鼠第1天至第15天(第1阶段)用番泻叶水浸液0. 8ml/d灌胃造成泄泻气虚模型,第16天(第2阶段)开始隔日给予大米、限制饮水造成脾虚便秘模型。造模结束后根据存活情况随机分为5组,分别为空白组、模型组、枳术汤治疗组、麻仁软胶囊治疗组、生理盐水组,每组动物1316只。包括生理盐水在内,剂量均按0. 6ml/10g体重给药,每天灌胃一次,治疗为3周。造模成功及治疗结束后,分别取小鼠胃窦、十二指肠及结肠组织,用RT-PCR法检测组织中5-HT4-R及SS mRNA含量。总RNA提取加1mlTrizol于已经低温匀浆的组织中,然后加入0. 2ml氯仿, 4低温离心12000rpm10min;吸取上层水相溶液并转移至另一新鲜的1. 5ml离心管,加入等体积异丙醇(0. 5ml),再次4低温离心12000rpm10min,加入75%乙醇1ml洗涤并干燥,最后用DEPC处理水溶解RNA。提取的总RNA经紫外分光光度计测定提取物的浓度,OD260/280比值在1. 82. 0之间。逆转录反应用上述组织中提取的2g总RNA在下述20l反应体系中逆转录成cDNA,该反应体系组成如下: 5RT-Buffer4,l oligd(T) 2. 5mol/L, dNTPs 5mmol/L, RNAasin(RNA酶抑制剂) 20U。首先65预变性5min,然后加入M-mlV逆转录酶200U,再于42孵育1小时, 70加热10min灭活逆转录酶。PCR反应取上述逆转录反应产物于40l反应体积中进行PCR反应。反应体系组成如下: 10Buffer 4l、dNTP10mM /L(0. 8l)、MgCl225mmol/L (3. 2l)、5U TaqDNA多聚酶(0. 3l)、模板4l、上、下游特异引物各0. 5l、去离子水26.7l。5-HT4-R基因反应按下述热循环参数运行:预变性: 942min;变性9410s,退火6710s(-1/cycle),延伸7215s,共10循环;变性9410s,退火5710s,延伸7215s,共35循环;再延伸725min。ss基因反应按下述热循环参数运行:预变性: 943min;变性9415s,退火6415s,延伸7220s,共40循环;再延伸7210min（3）仪器PCR仪, life Express(大和公司);紫外分光光度计,HP 8453,HP公司; SLAN PCR仪,上海宏石。（4）试剂R+M MIX(上海之江生物科技有限公司)、Trizol(Invitrogen)、逆转录酶M-mlV、TAQ酶、琼脂糖(西班牙)、DNAMrakerDL2000、引物(Invitrogen合成)RT-PCR具体方法一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。4. 12000g，4离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20，30min。7. 12000g，4离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。9. 7500g，4离心，10min。10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。11. 沉淀溶于20lDEPC水，取1l加入79lDEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70保存。二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下-20 冰箱冻存三、PCR反应混匀快速离心一次反应条件如下PCR产物-20冰箱保存取PCR产物8l 加5Loading Buffer 2l 2%琼脂糖凝胶电泳120V。100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。6. 小鼠脑SOD,GSH-PX,MDA的影响(1)原理 长期滞留于结肠或直肠系列的病菌所引起的粪便中有毒成分不断地进入肠黏膜和血流，从而出现轻度“毒血症”!，也很有可能促使患者体内的氧自由基反应和脂质过氧化反应病理性加剧。这一病理性生物化学反应和生物物理学反应，很可能导致功能性便秘患者体内的病理性脂质过氧化反应增强，表现为血液中的P-LOP和E-LOP含量显著增高.SODGSH-PX对于终止自由基连锁反应是必不可少的。SODGSH-PXF等酶系在体内协同作用，清除体内产生的自由基，减轻和阻断脂质过氧化物0如GBH等/对机体的毒害，保护机体免受各类自由基的侵害，延缓衰老进程。实验结果发现，便秘模型小鼠的血清与脑组织中SOD和GSH-PX活力显著降低，MDA的含量显著增加，胸腺指数与脾脏指数降低。由此表明便秘可通过降低其机体的抗氧由此表明便秘可通过降低其机体的抗氧化能力而促进衰老；小鼠胸腺厚度变薄、胸腺皮质细胞数减少，且对免疫系统的功能有明显的影响。通过本实验，我们可以看出，火麻仁油通过其润肠通便的作用而达到抗氧化的目的，从而起到延缓衰老的作用。化能力而促进衰老；小胸腺厚度变薄、胸腺皮质细胞数减少，且对免疫系统的功能有明显的影响。通过本实验，我们可以看出，火麻仁油通过其润肠通便的作用而达到抗氧化的目的，从而起到延缓衰老的作用。通过本次便秘模型的建立，对其与衰老的关系进行研究，但衰老是一个十分复杂的过程，应该从多个方面对二者的关系进行研究，使其致衰老的机理更加明确，对火麻仁的研究也应该从多个方面着手进行研究，使这味既是药品又是食品的药材能更好地为人类的健康服务。7. 结肠粘膜肥大细胞（MC.）的影响及其P物质（SP）、生长抑素（SS）（1）原理 人们对肥大细胞的研究主要集中在变态反应方面。近年来许多研究表明，MC不仅参与变态反应的发生，而且在维持体内正常的生理和免疫功能方面也发挥了重要作用。胃肠肽是神经-内分泌-免疫网络中的重要调节因子。其中.物质P、生长抑素（SS）是肠神经、内分泌系统中最具代表性和研究较深入的胃肠肽，对肠粘膜免疫系统发挥着重要的调节作用。便秘是由多种疾病的病理过程引起的一种复杂的、临床最常见的慢性消化道症状