DNA的粗提取与鉴定.doc

DNA的粗提取与鉴定【课前复习】在实验前如果先来回顾细胞的结构、DNA存在的部位、染色质的主要成分、渗透作用的原理、生物组织中有机化合物鉴定的方法等知识，既有利于掌握新知识，又便于将新知识纳入知识网络中。温故会做了，学习新课才能有保障1用蛋白酶对细胞核中能被碱性染料染色的物质进行处理，得到了一些细丝，这些丝状物可能是A蛋白质BDNACRNAD脱氧核苷酸解析：细胞核中被碱性染料染色的物质应是染色质或染色体，染色质的化学成分为蛋白质和DNA，用蛋白酶处理，因为酶的专一性，只会分解蛋白质而不会对DNA有分解作用，所以保留下来的应该是DNA丝。答案：B2人的红细胞的寿命较短，这一事实体现了A环境因素的影响B功能对寿命的决定C核质相互依存的关系D遗传因素的作用解析：因为人和哺乳动物成熟的红细胞没有核，所以寿命较短，反映了核质之间的相互依存的关系。答案：C3真核细胞是由_、_、_构成，细胞核又包括_、_、_、_（染色体），染色质主要由_组成。答案：细胞膜细胞质细胞核核膜核液核仁染色质DNA和蛋白质4做“生物组织中可溶性还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定实验”时，要根据实验需要选择不同的实验材料。请根据下表所列各种材料回答问题：各种可供实验的材料梨黄桃胡萝卜黄豆花生种子小麦种子其中适合于鉴定糖的是_，理由是_，鉴定试剂用_。小麦种子不如花生种子更适合用来鉴定脂肪，这是因为_，你怎样进行鉴定？_。适合于鉴定蛋白质的是_，理由是_，鉴定所用的试剂是_。解析：用特定的颜色反应来鉴定生物组织中的各成分首先要考虑到取材，选取的材料应是该成分含量相对较多，并且颜色尽量浅淡或无色，以减少对实验效果的影响；其次要考虑提取的方法；第三要知道鉴定的方法。答案：梨梨的组织细胞颜色为白色，并且糖含量较高斐林试剂小麦种子的脂肪含量不如花生种子高，也不容易做切片用苏丹或苏丹试剂鉴定黄豆和花生蛋白质含量高双缩脲试剂知新先看书，再来做一做填充题：1使溶解在NaCl溶液中的DNA析出的原理是_。2实验中提取含杂质较少的DNA的原理是_。3实验中用作鉴定DNA的试剂是_；原理是_。4实验的方法步骤是：制备鸡血细胞液提取_溶解_析出_溶解_析出_用_鉴定DNA。5将实验各步需加入的物质填入下表中，并回答加入这些物质的目的是什么？方法步骤加入物质目的1制备鸡血细胞液2提取鸡血细胞的细胞核物质3溶解细胞核中的DNA4析出含DNA的黏稠物5滤取含DNA的黏稠物6将DNA黏稠物再溶解7过滤含DNA的NaCl溶液8提取含有杂质较少的DNA9DNA的鉴定A：（1）（2）（3）B：（1）（2）目的是_。目的是_。目的是_。目的是_。目的是_。目的是_。目的是_。目的是_。目的是_。【学习目标】1能够记住获得鸡血细胞的方法。2能够解释说明DNA粗提取与鉴定各阶段的实验原理。3能够归纳阐述提取鸡血细胞核物质的方法、提取含杂质较少的DNA的方法、DNA鉴定的方法。4学会观察提取出来的DNA物质。【基础知识精讲】课文全解：1实验原理(1)根据DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度变化而改变进行提取。鸟类血液中红细胞有细胞核，细胞核内DNA与蛋白质结合成染色质。利用DNA在0.14 molL的NaCl溶液中溶解度最低，而蛋白质此时的溶解度高的特点，可以使DNA与蛋白质分离，形成沉淀析出，通过过滤，得到初提取的滤出物DNA。(2)利用DNA不溶于酒精而细胞中的某些物质能溶于酒精进行提纯，获取含杂质较少的DNA。(3)利用DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色进行鉴定。2实验材料鸡血细胞液：先配备10%的柠檬酸钠溶液，按180 mL新鲜鸡血混合100 mL10%柠檬酸钠溶液的比例，立即将血液与柠檬酸钠充分混合，同时用玻璃棒搅拌以免凝血。然后，用离心机以1000转min的速度离心2 min后，用吸管除去离心管上清液，就可获得所需的鸡血细胞悬液。每组大约需要510 mL鸡血细胞悬液。如果无离心机，可将与柠檬酸钠充分混合的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀后，也可获得所需的鸡血细胞悬液。但使用离心机效果更好。3试剂与仪器(1)2 mol/L的NaCl溶液：称取117 g的NaCl，加蒸馏水至1000 mL，使之完全溶解，即可获得2 mol/L的NaCl，须按此配方配备大量的2 mol/L的NaCl。(2)二苯胺试剂：A液1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸中，再加1.5 mL浓硫酸，用棕色瓶保存。B液体积分数为0.2%的乙醛溶液。实验前，将0.1 mL的B液加入到10 mL的A液中，现用现配。(3)0.015 mol/L的NaCl溶液：称取0.88 g NaCl加蒸馏水至1000 mL，使之完全溶解。(4)塑料杯和试管：DNA易吸附在玻璃器皿上，用塑料杯和试管可减少提取过程中DNA的损失。4实验方法与步骤为方便理解和记忆，将方法步骤归纳如下表。实验内容方法步骤原理一、提取DNA(1)提取细胞核物质：取510 mL鸡血细胞悬液注入50 mL烧杯中，加蒸馏水20 mL，同时，用玻璃棒沿一个方向快速充分搅拌，使血细胞过度吸水破裂，细胞核内物质释放出来，然后用纱布过滤取其滤液于500 mL烧杯中见实验原理（1）(2)溶解核内的DNA：在滤液中加入2 molL的NaCl40 mL，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1 min，核中DNA游离并充分溶解，染色质中的DNA和蛋白质分离(3)析出含DNA黏稠物：沿烧杯内壁缓慢加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌。由于溶液浓度的下降，使得DNA溶解度下降，蛋白质溶解度上升，DNA析出成白色丝状黏稠物，当黏稠物不再增加时，停止加入蒸馏水。（这时溶液中NaCl的物质的量浓度相当于0.14 molL）(4)滤取含DNA黏稠物：用多层纱布过滤，取纱布上DNA的黏稠物二、提纯DNA(5)DNA黏稠物再溶解：取含DNA黏稠物于50 mL烧杯内，加入2 mol/L的NaCl溶液20 mL，用玻璃棒沿一个方向不停搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解(6)过滤含DNA的NaCl溶液：用两层纱布过滤DNA的NaCl溶液，取其滤液(7)提取含杂质较少的DNA：在滤液中加入冷却的无水乙醇，并用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，由于DNA不溶于酒精，会出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸去表面的水分实验原理（2）三、鉴定DNA(8)DNA的鉴定：两支试管中各加入0.015 mol/L的NaCl溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，搅拌使其充分溶解后，向两支试管中分别加入4 mL二苯胺试剂，混匀后沸水浴中加热5 min，待试管冷却后，比较两试管的颜色变化，将发现加入DNA的试管中溶液呈蓝色，从而鉴定DNA的存在实验原理(3)问题全解：9DNA粗提取与鉴定的实验原理是什么？ 见“课文全解1”。10DNA粗提取与鉴定的实验中为什么要用鸡血而不用其他动物的血？鸡红血细胞有核，DNA含量丰富且易得；再者，鸡血细胞很易吸水胀破。而哺乳动物如猪的红血细胞也易获得但无核即无DNA。11DNA粗提取与鉴定实验的方法步骤以及各步骤的目的是什么？方法步骤见“课文全解4”，目的见每一步骤的标题。12DNA粗提取与鉴定的实验成功的关键及注意事项是什么？见“方法点拨3”。【学习方法指导】1做好实验的前提条件是首先必须理解和掌握实验原理，明确方法步骤。2要在充分预习的基础上，运用比较的方法，与以前做过的类似实验进行对比分析以找出异同点。如提取生物组织中的物质主要用研磨的方法，但本实验中用的是吸水涨破法；鉴定物质用特定的颜色反应的方法。3实验中应抓住关键并注意以下几点：(1)制备鸡血细胞液时，鸡血要在180 mL左右，并且在取新鲜鸡血的同时加入抗凝剂，使血液分层，取下层血细胞沉淀。(2)获取较多DNA的关键之一是向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。(3)实验中共有3次过滤。过滤时使用的纱布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3次要收集其滤液，使用的纱布为12层，第2次是要收集其滤出的黏稠物，使用的纱布为多层。 (4)实验中有6次搅拌，除最后一次搅拌外，前5次搅拌均要朝向一个方向，并且在析出DNA、DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，以防止DNA分子断裂。(5)实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充分搅拌，不应少于5 min，使血细胞充分破裂；第二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了稀释NaCl溶液。(6)实验中有三次加NaCl溶液。在步骤2中，当加入NaCl后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在NaCl溶液中。在步骤5中，加NaCl溶液也是为了DNA的再溶解，不过这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加的NaCl溶液的浓度比前两次低得多，但还是为溶解DNA。(7)在步骤7中，沉淀DNA必须使用冷酒精(至少在5以下存放24 h)，并且将1份含DNA的NaCl溶液加入到2份的冷酒精中。如果悬浮在溶液中的DNA丝状物较少，可将混合液放入冰箱中再冷却几分钟。(8)盛放鸡血细胞液的容器和实验中的烧杯和试管最好是塑料制的，因为玻璃制品表面带电荷，DNA中的磷酸基带相反的电荷，会被吸附于玻璃表面，减少DNA含量。【知识拓展】实验原理的补充介绍1DNA的释放：DNA位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来，实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说，是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞破裂。同时，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，于是释放出DNA，当然也有RNA。但是，释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。2将DNA与蛋白质分离：根据二者的特性，即在浓度较高的NaCl溶液(物质的量浓度为2 mol/L)中，核蛋白容易解聚，游离出DNA，而DNA在浓度较高的NaCl溶液中的溶解度很高，Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。3DNA的析出与获取：利用DNA在浓度较低的NaCl溶液中溶解度小的原理，向含有DNA的浓度较高的NaCl溶液中加入大量(300 mL)蒸馏水，稀释NaCl溶液，使DNA的溶解度下降，而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象)，从而使二者分离。这时，加上不停地搅拌，溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤，滤去蛋白质，就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好。用4000转/min的旋转频率，离心15 min，除去上清液(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含DNA。4DNA的再溶解：再用较高浓度的NaCl溶液去溶解DNA黏稠物。5DNA的沉淀和浓缩除去了蛋白质的核酸溶液，必须再进一步沉淀和浓缩。最常用的方法是酒精沉淀法。就是将含有Na+的DNA溶液，加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中，混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物，悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少，可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分钟。浓缩后的DNA丝状物，可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。【同步达纲训练】1含有DNA的NaCl(0.015 mol/L)溶液中加入二苯胺试剂后，加热煮沸 5 min，溶液呈A紫色B蓝色C砖红色D红色2DNA不溶解于ANaCl溶液BKCl溶液CC2H5OH溶液DMgCl2溶液3细胞中提取DNA所用的提取液是ANaCl溶液B酒精C二苯胺D柠檬酸钠4在实验中，有两次DNA的沉淀析出，其依据的原理是DNA在NaCl的物质的量浓度为0.14 mol/L时溶解度最低DNA在冷却的体积分数为95%的酒精中能沉淀析出A两次都是B两次都是C第一次是，第二次是D第一次是，第二次是5向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是A加快溶解DNA的速度B加快溶解杂质的速度C减少DNA的溶解度，加快DNA析出D减少杂质的溶解度，加快杂质的析出6对三次过滤的叙述中，不正确的是A第一次过滤后，核物质存在于滤出的固体物中B第二次过滤后，使用多层纱布，DNA存在于纱布上的黏稠物中C第三次过滤后，DNA存在于滤液中，可进一步除去非DNA物质D上述B、C均正确7DNA在NaCl溶液中的溶解度有二重性，随着NaCl溶液浓度的变化而变化。(1)请在下列浓度的NaCl溶液中，选出能使DNA析出最彻底的一种和溶解度最高的一种A0.14 mol/LB2 mol/LC0.15 mol/LD0.3 mol/L(2)欲使溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，需降低NaCl溶液的浓度，最有效的方法是A加蒸馏水B加矿泉水C加清水D加生理盐水(3) DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质却可以溶于酒精溶液，利用这一原理可以_，可以推测溶于酒精的物质中可能有_。(4) 利用DNA遇_呈蓝色的特性，将该物质作为鉴定DNA的试剂。其实验过程要点是向放有_的试管中加入4 mL的_。混合均匀后，将试管置于_5 min，待试管_，观察试管中溶液颜色的变化。这个实验也说明DNA耐_温，前次温度有利于_，后次温度则有利于DNA_。8粗提取DNA的原理是_，纯化粗提取DNA的原理是_。9在此实验中，具有和蛋白水解酶相似作用的物质是A蒸馏水BNaCl溶液CNaOH溶液D盐酸10关于DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么?(1)鸡血细胞中红细胞_，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中_细胞数目较多，可以提供丰富的_。(2)实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是_。(3)生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是_，这是因为这些动物和人类一样，_。11该实验中有六次用玻璃棒搅拌。第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞悬液是为了_；第二次搅拌加2 mol/L的NaCl溶液的滤液是为了使其与DNA_；第三次搅拌加蒸馏水至0.14 mol/L NaCl溶液是为了_；第四次搅拌放入纱布上的黏稠物的2 mol/L的 NaCl溶液是为了_；第五次搅拌体积分数为95%的酒精为了_；第六次搅拌放入丝状物的0.015 mol/L的NaCl溶液是为了使_。参考答案1B2C3A4解析：第一次是利用DNA、蛋白质在0.14 mol/L的Na