（植物学专业论文）拟南芥菜cryptochrome1结构与功能关系的生化机制探讨.pdf

中国科学院研究生院博士论文拟南芥菜c r y p t o c h r o m e1 结构与功能关系的生化机制探讨 摘要 光是最重要的环境信号之一 它不仅是高等植物光合作用的能量来源 同时也是生 长发育的信号来源 植物中存在的隐花色素 c r y r p t o c h r o m e c r y 可以接收太阳光 谱中的蓝光信号 并通过其信号传递途径调控植物的生长发育 隐花色素的n 端 c r y p t o c h r o m en t 眦i j n a d o m a i n c n t 与光裂解酶 p h o t o l y a s e 有很高的同源 性 但是c 端 c x r p t o c h r o m e c t 删d o m a i n c c t 非常独特 过量表达融合 蛋白g u s c c t 的转基因植物呈现出组成性光形态建成 c o n s t i t u t i v e p h o t o m o r p h o g e n e s i s c o p 的表型 证明隐花色素的功能区在c 端 人们根据已有 的实验结果推断 c n t 的功能可能是通过依赖于蓝光的分子内作用抑制c c t 的功能 我们在工作中发现 野生型植株中过量表达c r y l 的n 端功能区 c n n 具有负显性 效应 说明c n t 对c c t 功能的调控可能是通过分子间的相互作用来完成的 基于这 些推断 我们进行了一系列生化实验 证明c r y l 分子可以通过c n t l 组成性地形成 二聚体 并且c n t l 上一些重要位点的突变会因为影响二聚化而使c c t i 失去活性 通过类似的实验 我们也证明了g u s 蛋白在体内是以多聚体的形式存在 其聚合能力 对g u s c c t 所导致的c o p 表型是必需的 根据以上实验结果我们推测 在黑暗条件 下 c n t l 二聚体使得c c t 的功能失活 没有信号传递 而在蓝光条件下 c n t l 的 结构可能发生了某种改变 c c t i 被激活 从而将信号向下传递 对于g u s c c t 融合 蛋白 其多聚体结构并不因为光照与否而变化 所以c c t 始终处于被激活的状态 因 而转基因植株表现c o p 表型 这些结果使人们对拟南芥菜蓝光信号传递机理有了更加 深入的了解 在今后对其它物种的c r y 结构与功能的研究中 这些结果也能提供有益 的参考 关键词 隐花色素 二聚化 信号传递 c o p 表型 4 中国科学院研究生院博士论文拟南芥菜c r y p th r o m e1 结构与功能关系的生化机制探讨 a b s t r a c t f o rp l a n t s s u n l i g h ti so n eo ft h em o s ti m p o r t a n te n v i r o n m e n t a ls t i m u l i a c t i n ga sb o t he n e r g ys o u r c eo fp h o t o s y n t h e s i sa n dd e v e l o p m e n t a ls i g n a l t h e f a m i l yo fp l a n t sc r y p t o c h r o m e s c r y s a r eb l u el i g h tp h o t o r e c e p t o r s w h o s e s i g n a l i n gp a t h w a yi sc r i t i c a lf o rt h er e g u l a t i o no ft h ed e v e l o p m e n t a lg r o w t l l t h en t e r m i n a ld o m a i no fc r y s c n t s h a r e ss e q u e n c es i m i l a r i t yt op h o t o l y a s e s f l a v o p r o t e i n st h a tc a t a l y z et h er e p a i ro f u vli g h t d a m a g e dd n a a n di t s c t e r m i n u se x t e n s i o n c c t i su n i q u e i ne a r l i e rs t u d i e s t h ea r a b i d o p s i s t l a l i a n as e e d l i n g so v e r e x p r e s s i n gc c tf u s e dt oc t e r m i n u so fp g l u c u r o n i d a s e g u s d i s p l a y e dac o n s i t i t u t i v e l yp h o t o m o r p h o g e n i c c o p p h e n o t y p e i n d i c a t i n g t h a tt h ef u n c t i o n so fc r y sa r em e d i a t e db yc c ta n dt h a tc n ta c t sa sr e p r e s s o r o fc c tt h r o u g hi n t r a m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n si nab l u ei i g h t d e p e n d e n t 舰n n e r h o w e v e r w ef o u n dt h a to v e r e x p r e s s i o no fc n t ii nw i l dt y p ea r a b i d o p s i sr e s u l t s i nd o m i n a n tn e g a t i v ep h e n o t y p e s u g g e s t i n gt h a tt h ef u n c t i o n a lr e g u l a t i o no f c c t i b y c n t ii sm e d i a t e d b y i n t e r m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n s b a s e do nt h e p r o p o s i t i o na n du s i n ga na r r a yo fb i o c h e m i c a ls t u d i e s w ed e m o n s t r a t e dh e r et h a t t h ec o n s t i t u t i v eh o m o d i m e r i z a t i o no fc r y li sm e d i a t e db yc n t ia n dm u t a t i o n so f c n t it h a tr e s u l ti nr e d u c e db l u eli g h tr e s p o n s ec a nb l o c kt h ef o r m a t i o no ft h e d i m m e r w ea l s od e m o n s t r a t e dt h a tg u se x i s t sa sm u l t i m e ri nv i v o w h i c hi s e s s e n t i a lf o rc o pp h e n o t y p er e s u l t e df r o mo v e r e x p r e s s i o no fg u s c c tf u s i o n p r o t e i n s t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a ti r r a d i a t i o nw i t hb l u el i g h tm o d i f i e st h e p r o p e r t i e so fc n t ld i m e r r e s u l t i n gi nac h a n g ei nc c t l a c t i v a t i n gc c r l a n d e v e n t u a l l yt r i g g e r i n gt h ec r y ls i g n a l i n gp a t h w a y k e y w o r d s c r y p t o c h r o m e s h o m o d i m e r i z a t i o n b l u el i g h t m e d i a t e ds i g n a l i n g p a t h w a y c o pp h e n o t y p e 5 中国科学院研究生院博士论文拟南芥菜c r y p t o c h r o m e1 结构与功能关系的生化机制探讨 缩略语 缩写 全称 a m pa m p i c i l l i n a t p a d e n o s i n 5 t r i p h o s p h a t e b p b a s ep a i r b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n c c t c r y p t o c h r o m ec t e r m i n a ld o m a i n c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a c n t c r y p t o c h r o m en t e r m i n a ld o m a i n c o pc o n s t i t u t i v ep h o t o m o r p h o g e n e s i s c p r g c h l o r o p h e n o lr e d p d g a l a c t o p y r a n o s i d e c r y c r y p t o c h r o m e d d h 0 d o u b l e d i s t i l l e dh 2 0 d 肝 d i m e t h y l f o r m a m i d e d m s 0 d i m e t h y l s u f o x i d e d n t p 2 d e o x y r i b o n u d e o t i d t r i p h o s p h a t e d t td i t h i o t h r e i t o l e d t a e t h y l e j n d i a m m e t e t r a a c e t a t e e m s e t h y lm e t h a n e s u lf o n a t e f a df l a v i n a d e n i n ed i n u c l e o t i d e f r e tf l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r g g r a m g f pg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g s tg 1 u t a t h io n es t r a n s f e r a s e g u s p g l u c u r o n i d a s e h e p e s n 一2 h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e n 一2 一e t h a n e s u l f o n i ca c i d h r ph o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i p t g i s o p r o p y l p d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n k a n a m y ci n k bk i l o b a s e k dk 丑o d a l t o n ll i t e r m m o l a r 2 中国科学院研究生院博士论文 拟南芥菜c r y p t o c h r o m e1 结构与功能关系的生化机制探讨 m r m i l l i a m p e r e 皿s 2 n m o r p h o l i n o e t h 删o n i c a c i d m gm i l l i g r a m m lm i 珊i t e r m mm i n i m o l a r m o p s 5 m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i ca c i d m s m u r a s h i g ea n ds k o o gb a s a l s a l t m i x t u r e m r 盯 m e t h e n y l t e t r a h y d r o f o l a t e n mn a m o m e t e r p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l p h o t p h o t o t r o p i n p h yp b y t o c h r o m e p m s f p h e n y l m e t h y i s u l f o n y lf l u o r i d e p v l f p o l y vi n y lid e n ef l u o r id e r p m r e v o l u t i o n sp e rm i l l s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e t e m e d n n n i n t e t r a m e t h y l e t h y l e n d i a m i n e t r i s t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e vv o n x g a l5 b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l p d g a l a c t o p y r a n o s i d e 腭m i c r o g r a m 止 m i a o h t e r 肚 m i c r o m o l a r 3 中科院上海生命科学研究院 研究生学位论文声明 掰嘲僦黼耕体膈担 刻凇一名 靠 级 学位论文作者签名 哆隆荔 炙 f l j l j 佗为年易 j 厂奉1 研究生学位论文版权使用授权声明 本人完全了解并同意遵 j 中科院e 海生命科学研究院有关保留 使用学位论 文的规定 即 l 科院有权保留送交论文的复印件和电予文件 并提供论文的目 录检索及借阅 查阅 生科院呵以公布论文的全部或部分内容 可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 一j 以采用影印 缩印或其它复制 手段保存和汇 编本学位沦文 保密的论文希 解密后遵 j 此规定 导咖 噬鹳 j 哆虚一r 珊三竺 鱼雩 f 中国科学院研究生院博士论文 拟南芥菜c r y p t o c h r o m e1 结构与功能关系的生化机制探讨 第一部分 拟南芥菜c r y p t o c h r o m e 的研究进展 对于地球上的所有生物来说 太阳光的重要性不言而喻 它不但直接或间接为几乎 所有生物提供能量 而且还能作为信号因子调节多种生物行为 c h o r y 1 9 9 7 f a n n a u s e ra n dc h o z t 1 9 9 7 b r i g g sa n do l n e y 2 0 0 1 c a s h m o r e t2 0 0 3 s u l l i v a na n d d e n 2 0 0 3 f r a n k l i n e ta l 2 0 0 5 在植物中 已经发现了多种光受体 图一 包括吸 收红光 远红光 6 0 0 8 0 0 n m 的光敏色素 p h y t o c h r o m e p h y w a n ga n dd e n 2 0 0 4 r o c k w e l le ta l 2 0 0 6 吸收蓝光 a 区紫外光 3 2 0 5 0 0 n m 的隐花色素 c r y p t o c h r o m e c r y l i na n ds h a l i t m 2 0 0 3 s a 码2 0 0 4 b a l n 叫 a n d b a t s c h a u e i r2 0 0 5 和向光素 p h o t o t r o p i n p h o t 0 3 r i g g se ta 1 2 0 0 1 l t s c u me ta l 2 0 0 3 b a n e i j e ea n dg a 地u e l 2 0 0 5 以及目前了解还不是很清楚的b 区紫外光 2 8 0 一 3 2 0 n m 受体 t r i ma n dn a g y 2 0 0 5 被光所激活的这些光受体 通过与下游信号蛋白 相互作用 最终将信号传递给光形态建成的负调控因子 c o p d e t f u s 等 和正 调控因子 转录因子h y 5 等 a n g e ta l 1 9 9 黝h o l me ta 1 2 0 0 2 y ia n dd e n g 2 0 0 5 从而保证光控基因的正确表达 c a s a la n dy a n o v s k y 2 0 0 5 拟南芥菜遗传学的发展使得人们可以更加深入地了解这些光受体的特性 最近几十 年来 对各种光受体的研究不断有新的发现 以下将就拟南芥菜c r y 的研究进展做一 些介绍 o r y 与植物的蓝光反应 到目前为止 在拟南芥菜中已经发现了3 个c r y 家族成员 c r y l c r y 2 和c r y 3 图四 其中 c r y 3 的功能仍然不清楚 只知道它是一个d n a 结合蛋白 并且定位在 叶绿体和线粒体中 b r u d l e re ta 1 2 0 0 3 k l e i n ee ta 1 2 0 0 3 对于另外两个c r y 基因及其蛋白产物的研究相对深入 它们参与了植物中一些非常重要的生理过程的光调 中国科学院研究生院博 论文越南齐菜c r y p t 0 c m o ml 结掏与功能关系的生化机制探讨 节 图一 包括光形态建成 开花时间 生物节律性和气孔的开放 并且这些调节过程 大都包含了与其它光受体的协同作用 l i n 2 0 0 0 a c a s h m o r e 2 0 0 3 l i n a n ds h a l i t i n 2 0 0 3 oe ta 1 2 0 0 5 m a s 2 0 0 5 上 o p h 7 n l s t o r n a t a lo d 皇n n 0 气 氏 丫 a r a b i d o p s i st h a l l a n a v 丫 s h a d e v o i b a 虻e 一 圈一 拟南芥菜中的光受体和它们参与的生理过程 修改白s u l l i v a na n db e n g 2 0 0 3 光 暗形态建成与帮r 基因家族 在黑暗中萌发的双子叶植物具有较长的下胚轴 顶端的子叶不打开而是形成钩状弯 曲 很多生物色素的合成也不能启动 这些形态特征可以减少天然条件下萌发的种子在 出土过程中所受到的阻力 以便于尽早见到太阳光进行光合作用 帮助植物个体在自然 竞争中取得优势 这种生理过程称为 暗形态建成 s k o t o m o r p h o g e n e s i s 或者 黄 化作用 e t i o l a t i o n 当幼苗见到阳光以后 下胚轴的伸长迅速受到抑制 子叶张开 i r 呕 薹一 m x 藤 中国科学r 研究生院博1 论空 拟南芥菜c r y p t o c h r o m ei 结构与功能关系肿 化机制探讨 以便更好地接受阳光 同时 花色素苷和叶绿索等牛物色素也很快积累 植物迅速完成 了从异养到自养状态的转变 这个过程称为 光形态建成 p h o t o m o r p h o g e n e s is 或 者 去黄化作用 d e e t i o a t i o n 图二 s u l l i v a na n dd e n g 2 0 0 3 圈二 拟南芥菜的 暗形态建成 左 和光形态矬成 右 黑暗中生长的拟南并 菜幼苗具有伸长的下 胚轴 子叶不打开 多种生物色素不能台 成 崮而出现黄化现 象 而光下生长的幼 苗具有张开的予叶 下胚轴的伸疑受到抑 制 于叶的颜色不再 是黄色而是绿色 这种迥然不同的形态极大地方便了对光信号接收 传递系统的研究 因为可以利用 植物表型的变化很方便地筛选相关信号因子的突变体 c r y 基因的第一次分离就是饭好 的例子 a h m a da n dc a s h m o r e 1 9 9 3 利用t d n a 插入突变体库 在蓝光条件下筛选到 了下胚轴伸长不受抑制豹b y 4 突变体 然后通过质粒拯教 p l a s m i dr e s c u e 得到插入 位点的旁邻序列 从而克隆了t y 4 基因 即c r y l c r y p t o c h r o m ei 基因 a h m a da n d c a s h m o r e 1 9 9 3 随后 利用已知的c r y l 基因序列作为探针 通过d n a 杂交筛选拟南 芥菜的基因文库 又得到了c r y i 的一个同源基因 甜膳 l i ne ta l 1 9 9 6 b 至今 为止已经在很多物种 包括细菌 植物和动物 中发现了c r y 家族成员 l i n 2 0 0 2 l i n a n ds h a l i t i n 2 0 0 3 s a n c a r 2 0 0 4 它们都具有一个和光裂解酶 p h o t o l y a s e 同 源性报高的n 端区域 称为p i r 域 耻o t o l y a s e 一 r e l a t e dd o m a i n 或者简称c n t 8 璺壁兰堕塑窒竺堕堕主笙茎垫堕茎薹璺坚翌巴望坚 塑坚 箜塑皇堕丝茎墨堕生些壑型堡堕 c r y p t o c h r o m en t e 珈i n a ld o m a i n a h m a da n dc a s h m o r e 1 9 9 3 c a s h m o r ee ta 1 1 9 9 9 s a n c a r 2 0 0 4 而c 端延伸区 c r y p t o c h r o m e 盟e r m i n a ld o m a i n c c t 相对 较为特殊 不仅序列同源性很低 同时长短不一 其功能也多种多样 图四及下文 通过对c r y l 突变体 野生型 耵 和c r y l 过量表达的转基因植株 c r y l 一o v x 进 行表型分析发现 相对于w t c r y l 对蓝光的光反应大大减弱 而c r y l 一o v x 则表现为超 敏感 a h m a da n dc a s l m o r e 1 9 9 3 l i ne ta 1 1 9 9 5 a l i ne ta 1 1 9 9 8 同时 在花色素苷含量方面 c r y l 突变体最低 w t 次之 c r y l 一o v x 最高 a h m a de ta 1 1 9 9 5 l i ne ta 1 1 9 9 6 a j e n k i n s 1 9 9 7 因此 c r y l 分别负调控和正调控依赖于蓝光的 下胚轴伸长和花色素苷积累 与c z y l 不同 c z 7 2 植株只有在较弱的蓝光下才表现出减 弱的光反应 而在光强较强时则跟w t 没有明显差别 g u oe ta 1 1 9 9 8 l i ne ta 1 1 9 9 8 但是 c r y lc r y 2 双突变体在较强蓝光下生长时 其下胚轴长度要明显大于c r y l 单突变体 说明这两个基因的产物协同参与了对下胚轴伸长的抑制 m o c k l e re ta 1 1 9 9 9 m a z z e l l ae ta 1 2 0 0 1 在幼苗阶段 这种协同作用也表现在对子叶扩展的调 控上 因为两个单突变体的子叶面积都要小于w t 而双突变体的子叶面积则更小 u o c k l e re ta 1 1 9 9 9 m a z z e l l ae ta 1 2 0 0 1 对开花时间的调节 在影响开花时间的众多环境因子中 光照时间 p h o t o p e r i o d 是非常重要的一个 尽管调节开花时间最主要的光受体是p h y t o c h r o m e 但是c r y 也参与了这一过程 l i i l 2 0 0 0 a 研究发现 在多种光照条件下生长的c z 7 1 突变体的开花时间都要晚于w t 说 明c r y l 的作用是促进开花的 b a g n a l le ta 1 1 9 9 6 c r y 2 突变体在分离以后不久也 被证明是另外一个晚开花突变体扬a k o o r n n e e fe ta 1 1 9 9 1 的等位突变 它在长 日照条件下开花时间要晚于w t 但是在短日照下则与w t 差别不大 g u oe ta 1 1 9 9 8 k o o r n n e e fe ta 1 1 9 9 8 另外 c r y 2 过表达植株在短日照下开花时间要稍早于w t 这些证据说明c r y 2 的突变或者过表达都能导致对光照时间敏感性的下降 g u oe ta 1 1 9 9 8 k o o r n n e e fe ta 1 1 9 9 8 在持续的蓝光或者红光照射下 c r y 2 突变体的开花 9 璺型兰堕塑窒生堕堕主笙奎 垫堕茎墨壁坚璺旦里堡三坚坚 笪塑兰垫丝茎墨堕竺垡垫型堡堕 时间与w t 一样 但是在蓝光和红光同时照射时 c r y 2 突变体是比w t 晚开花的 说明 在蓝光对开花的促进过程中 c r y l 与c r y 2 的功能有冗余 并且与p h y b 之间可能存在 协同作用 g u oe ta 1 1 9 9 8 m o c k l e re ta 1 1 9 9 9 的确 c r y l 对开花时间的促进作用在c r y 2 突变体背景下表现更加明显 因为c r y l c r y 2 双突变体比c z t 2 单突变体开花时间要晚 m o c k l e re ta 1 1 9 9 9 c r y l 和c r y 2 对开花诱导的冗余作用在单色蓝光生长条件下完全表现出来 在蓝光条件下 无论是 c r t l 单突变体 还是c r y 2 单突变体 其开花时间与野生型相比并不延迟 但c r y lc z t 2 双突变体的开花时间却明显晚于c r y l 和c r y 2 单突变体 g u oe ta 1 1 9 9 8 m o c k l e re t a 1 1 9 9 9 参与调控生物节律 c ir o a dia nr h y t h m 对地球上的生物而言 将自己的重要生理活动周期与地球自转周期保持一致无疑是 非常具有进化优势的 生物钟的作用就是保持这种一致性 该系统由输入途径 i n p u t p a t h w a y s 中央振荡器 c e n t r a lo s c i l l a t o r 和输出途径 o u t p u tp a t h w a y s 三个 部分组成 外界信号通过输入途径到达中央振荡器 被整合后再由输出途径转化成为影 响生理过程的内部信号 保证特定生理活动的正确进行 生物钟的特点是可持续性和可 调性 可持续性是指在外界信号紊乱或不存在时 生理活动可以在一定的时间内按原来 的节律运转 而可调性是指生物钟的内在节律并非刚好是2 4 小时 这样就可以通过接 受光和温度等外界信号的变化来自我校准 调节自己的生理反应 以适应周围的环境 d e v li na n dk a y 2 0 0 1 j o h n s o 玛2 0 0 1 m a s 2 0 0 5 在植物中 生物节律钟严格地调节了众多生理过程 例如叶子和花的运动 香气发 散 气孔的开放 下胚轴的伸长以及开花时间等等 b a r a ke ta 1 2 0 0 0 m c c l u n g 2 0 0 1 作为输入途径的一部分 c r y l 可以感受高和低两种强度的蓝光 而对于中等强 度的蓝光 c r y l 和c r y 2 的作用是互相冗余的 s o m e r se ta 1 1 9 9 8 d e v l i na n dk a y 2 0 0 0 由于白光条件下c r y 2 突变体的生物钟校准功能也会受到影响 说明c r y 2 和 p h y t o c h r o m e 信号途径之间存在相互作用0 h s 2 0 0 5 在红光下生长的c r y l 突变体同 1 0 里登兰堕塑窒竺堕堕圭堡奎垫堕茎苤壁坚兰旦竺墨旦坠堡 笙塑兰堕堕茎墨堕竺垡塑 型堡堕 样会表现出校准功能改变的现象 说明无论是在红光还是蓝光条件下 从p h y a 受体到 中心振荡器的信号途径都需要c r y l 的参与 d e v l i na n dk a y 2 0 0 0 四突变体p h y ap h y b c r y lc r y 2 仍然能够保持一定的节律性 说明还有其他的组件参与其中 y a n o v s k ye ta 1 2 0 0 0 对气孔开放的影响 c r y i 和c r y 2 还参与介导蓝光诱导的气孔开放叫 c ta 1 2 0 0 5 气孔是二氧化碳 和水份进出植物体的主要通道 其开放程度直接决定植物水分蒸腾速率和光合作用效 率 对于野生型而言 随着蓝光强度的增强 气孔开度会增大 说明蓝光可以正调控气 孔的开放 在很长一段时间里 参与这种调控的光受体被认为只有p h o t p h o t o t r o p i n b a n e r j e ea n db a t s c h a u e r 2 0 0 5 c e l a y aa n dl i s c u m 2 0 0 5 但是后来发现c r y lc o 2 双突变体的气孔也表现出减弱的蓝光反应 即随着蓝光强度的增强 其气孔开度增加不 大 而c r y l 过表达植株的气孔则表现出对蓝光的超敏感反应 即一定蓝光强度范围内 随着蓝光强度的增强 其气孔开度增加远比野生型的大 由于c r y ic r y 2p h o hp h o t 2 四 突变体的气孔开度比c r y lc o 2 和p h o hp h o t 2 都要小 说明p h o t 并不是唯一的气孔开 放调节因子 并且c r y 和p h o t 这两类光受体位于不同的信号途径上 尽管它们共享 同一个下游因子c o p l m a oe ta 1 2 0 0 5 c r y 的结构特点 c r y 和光裂解酶 p h o t ol y a s e p h o t o l y a s e 是一类黄素蛋白 广泛存在于生物界 已知氨基酸序列的就有大约5 0 种 并且它们相互之间具有1 5 7 0 的序列同源性 甚至更高 t o d o 1 9 9 9 s e n c a x 2 0 0 0 除了这种一级结构的高度相似 这些蛋白的立体结构与反应机制同样非常相似 s a n c a r 2 0 0 3 当d n a 被高能量的紫外光 波长小于3 5 0 n 的b 区和c 区紫外光 损 伤后 p h o t o l y a s e 可以借助蓝光 a 区紫外光的能量来修复受损的d n a s a n c a r 2 0 0 3 已知的p h o t o l y a s e 根据底物的不同可以分为两种 一种是修复环丁嘧啶二聚体 1 1 主里型兰堕塑窒生堕堡主丝奎 一 垫堕茎茎竺坚翌翌竖堡旦垒堡 笙塑皇垫丝茎薹塑生垡垫型堡塑 c y c l o b u t a n ep y r i m i d i n ed i m e r c p d 的p h o t o l y a s e 或称为c p dp h o t o l y a s e 另一种则是修复嘧啶6 4 一二聚体 p y r i m i d i n e p y r i m i d i n e6 4p r o d u c t 的6 4 p h o t o l y a s e s a n c a r 2 0 0 3 p h o t o l y a s e 含有两个非共价结合的生色团 第一个是以 f a d i 广形式存在的f a d m a l h o t r ae ta 1 1 9 9 2 r a m s e ye ta 1 1 9 9 2 p a r ke ta 1 1 9 9 3 p a r ke ta 1 1 9 9 5 t a m a d ae ta 1 1 9 9 7 它通过非共价键结合在p h o t o l y a s e 上 对于p h o t o l y a s e 的d n a 结合与催化修复都很重要u o r n se ta 1 1 9 8 7 s a n c a re t a 1 1 9 8 7 b s a n c a re ta 1 1 9 8 7 a p a y n ea n ds a n c a r 1 9 9 0 而另一个似乎并不 是必需的 它们的作用只是在有限的光条件下增加修复的效率 s a n c a r 2 0 0 3 通常是 m e t h e n y l t e t r a h y d r o f o l a t e m t h f 或者8 h y d r o x y 一7 8 d i d e m e t h y l 5 一d e a z a r i b o f l a v i n 8 h d f 这样 根据第二类生色团的不同 p h o t o l y a s e 又可以分为f o l a t e 类 和d e a z a f l a v i n 类 不论游离的f a d 有多少 它与p h o t o l y a s e 的结合比例总是1 1 s a n c a ra n ds a n c a r 1 9 8 4 但是 很多异源表达的p h o t o l y a s e 只含有很少或不含 f a d y a s u ie ta 1 1 9 9 4 h s ue ta 1 1 9 9 6 z h a oa n ds a n c a r 1 9 9 7 z h a oe ta 1 1 9 9 7 s e l b ya n ds a n c a r 1 9 9 9 目前 至少已经在三个物种中得到了p h o t o l y a s e 的晶体结构 e s c h e r l c h l a c 0 1 1 p a r ke ta 1 1 9 9 5 l l n a c y s t i sn l d u l a n s t a m a d ae ta 1 1 9 9 7 和砀e r b l l s t h e r m o p h l l u s k o m o r ie ta 1 2 0 0 1 其中前者属于f o l a t e 类 后二者属于d e a z a f l a v i n 类 尽管它们之间氨基酸序列的相似性只有大约2 5 但是晶体结构却极为相象 以 e c o l i 的p h o t o l y a s e 为例 图三 其m t h f 捕光生色团位于蛋白表面的一个窄沟里 f a d r 位于附近的一个凹陷内 两者的中心距离为1 6 8 a 当d n a 因为紫外光照射受损 而形成嘧啶二聚体时 p h o t o l y a s e 可以通过其表面的大沟特异性地结合到受损的d n a 上 之后 m t h f 捕获蓝光 a 区紫外光的能量并将其传递给f a d i v 处于激活态的f a d i r i 将 一个电子传递给嘧啶二聚体 而自身则处于单电子还原态 f a d h 在高能电子的作 用下 嘧啶二聚体分开成单个嘧啶 释放了能量的这个电子又被传递回去形成f a d i v 回到最初的状态 s a n c a r 2 0 0 3 1 2 中国科学院研究生院博 论立拟南芥菜c r y p t o c h r o m e i 结构与功能关系的生化机制探讨 t h f 图三 p h o t o ly a s e 的晶体结构 s a n c a r 2 0 0 3 左边的带状示意图中标明了p h o t o l y a s e 氨基瑞的 b 羧基端的q 螺旋域 以及两个生色髓的结合位置 右边的示意图则硅示了蛋白表面的电荷分布情 况 蓝色代表碱性基团 红色代表酸性基团 而白色则代袭疏水隧域 虚线 方框中是f a d 结合位置 人们早就发现植物具有依赖于蓝光的特殊光反应 由于f a d 的吸收光谱与蓝光反应 实验得到的效应光谱相似 凼此人们一直都相信植物中的蓝光受体一定是一个黄素蛋 白 并且认为p h o t o l y a s e 就是这种受体的原型 后来的实验证明了c r y 确实含有f a d 作为生色团 l i ne ta 1 1 9 9 5 b 并且如图五所示 其n 端p h r 结构域也跟p h o t o l y a s e 同源性很高 a h m a da n dc a s h m o r e 1 9 9 3 b r i g g sa n dh u a l a 1 9 9 9 c a s h m o r ee ta l 1 9 9 9 l i n 2 0 0 0 b 但是并不具有d n a 修复活性 l i ne ta l 1 9 9 5 b m a l h o t r ae ta l 1 9 9 5 h o f f m a ne ta l 1 9 9 6 i m a i z u m ie ta l 2 0 0 0 p e r r o t t ae ta l 2 0 0 0 近年来韵研究表明 c n t i c r y i 的n 端功能区 相对地 c r y 2 的n 端功能区则简称为 c n t 2 具有一些独特的性质以区另 于p h o t o y a s e 例如 第二生色团m t h f 对于c r y 的 功能来说似乎并不重要 其存在性仍有争议 m a l h o t r ae ta l 1 9 9 5 b o u l ye ta l 2 0 0 3 b r a u t i g a me ta l 2 0 0 4 c r y 大多不具有d n a 结合功能 c r yd a s h 亚家族例 外 见下文 c r y 可以以11 的比例结合a t p 并且这种结合依赖于f a d b o u l ye ta l 奠尚 一菇 审 0 0 翌 唑 i 1 2 0 0 3 最近 对c n t l 蛋白 5 0 9 个氨基酸 的晶体分析结果 图五 再次证明了上述 特点 同时rc n t i 也可以结合m f b r a u t i g a me ta l 2 0 0 4 这也是c r y 与p h o t o l y a s e 的不同之处 0 譬 剖2 1 1 1 5 露躐渤 e i 漂豳曩 豳豳翻霸 图四 扭南芥集中c r y 基因家族成员 b a n e r j e ea n db a t s c h a u e r 2 0 0 5 c r y l c x y 2 和c r y 3 都含有一个长度大约为5 0 0 十氨摹酸左右的保守的n 端p i r r 结构域 c n t 斜线阴影区 其l 结合有牛色团m i h f 和f a d c r y 3 还搜有发现结合有t r r h f 除了c r y 3 外 c r y l 和c k y 2 都具有个c 端延伸区 c c t 苴上含有一个作用不很清 楚的d a s 区域 c r y 3 的n 端还青有一个能够定位丁线粒体和叶绿体的定位信号 大约 4 0 个氨基鲮l o r y 的c 端功能区 相比p h o t o l y a s e c r y 家族具有延伸长度不等的c 端 比如在藻类植物 g h l a m y d o m o n a sr e l 衄d t z i 中 其c r y 的c 端 c c t c r y l 和c r y 2 的c 端则分别称为 c c t l 和c c t 2 大约有9 8 0 个氨基酸 s m a l le ta 1 1 9 9 5 r e i s d o r p ha n ds m a l l 2 0 0 4 在拟南芥菜中 a t c r y i 和a t c r y 2 分别有大约1 9 0 个和1 2 0 个氨基酸长度的c 端 a h m a d e ta l 1 9 9 5 y a n ge ta 1 2 0 0 0 圈四 w a n ge ta l 2 0 0 1 y a n ge ta l 2 0 0 1 而蕨类植物a d i a n t u m c a p i l l u s v e n e n s 酗 a c c r y 5 s t n a p i s a j 曲的s a p h r 以及c r yd a s h 亚家族则几乎投有或完全没有c 端 b a t s c h a u e r 1 9 9 3 m a l h o t r ae ta 1 1 9 9 5 l i s c u m e ta l 2 0 0 3 即便在同一物种的不同c r y 基因之向 c 端区域的序列差异都非常丈 堕型兰堕塑塞竺堕堕圭丝茎垫妻茎萎望坚型翌壁竖仝垒堡 笙塑皇垫堕叁墨塑生垡垫型堡堕 比如拟南芥菜的a t c y i 和a t c r y 2 基因 它们n 端的同源性可以达到5 8 可是c 端 只有1 4 还不如它们n 端同p h o t o l y a s e 之间的同源性 大约3 0 高 图四 h o f f m a n e ta 1 1 9 9 6 l i n