利用磺基异硫氰酸苯酯化学辅助方法鉴定磷酸化肽修饰位点.pdf

I S S N l 0 0 7 7 6 2 6 C N 1 1 3 8 7 0 Q 中 国生物 化学 与分 子生 物学 报 C h i n e s e J o u mal o f Bi o c h e mi s t r y a n d Mo l e c u l a r Bi o l o g y 2 0 0 6年 7月 2 2 7 5 9 1 5 9 8 技术 与方法 利用磺基异硫氰酸苯酯化学辅助 方法鉴定磷 酸化肽修 饰位点 陈 平 李水明 刘 宇 刘中华 熊继先 孙亚兰 曹 锐 梁宋平 湖 南师范大学生命 科学学院 长沙4 1 0 0 8 1 中南大 学湘雅 医学院 长沙4 1 0 0 7 8 摘 要 利 用 M A L D I T O F质 谱 结 合 磺 基 异 硫 氰 酸 苯 酯 S P I T C 化 学 辅 助 的 从 头 测 序 d e t t O O s e q u e n c i n g 方法 将 用 固相金 属 离子 亲和 色谱 i m m o b i l i z e d m e t a l a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y I M A C 选择性 地从混合物 中亲和提取的磷酸肽进行磷酸化位点测定 该方法只有肽键断裂产生的带 c端的碎 片 离子 系列 Y 离子系列 出现在质谱 图中 图谱背景清晰 信噪 比高 单纯的 Y 片段 离子 系列使得谱 图解析 变得 非常 容 易 对 于多磷 酸 化肽 的磷 酸化 位 点 不 需借 助 于任 何软 件 只 需 简单 地计 算 两峰 之 间的分 子量之 差 即可确 定 关键词 S P I T C 磷 酸化 位点 从 头测序 质谱 中图分 类号Q 5 Q 5 l I d e n t i fic a t i o n o f Ph o s p h o p e pt i de M o d i fic a t i o n S i t e s Ba s e d o n Ch e mi c a l l y As s i s t e d M e t h o d Us i n g 4 S u l f o p h e n y l I s o t h i o c y a n a t e De r i v a t i z a t i o n b y M ass S p e c t r o me t r y CHEN Pi n g L I S h u i Mi n g L I U Yu L I U Zh o n g Hu a XI ONG j i Xi a n S UN Ya L a n C AO Rui LI ANG S o n g P i n g C o l le g e o fU f e S c i e n c e s H u n a nN o r m a l U n i v e r s it y C h a n g s h a 4 1 0 0 8 1 C h i n a X ia n g y a Me d i c a l Sch o o l C e n t r a l S o u t h U n i v e r s i t y C h a n g s h a 4 1 0 0 7 8 C h ina Ab s t r a c t P h o s p h o r y l a t e d p e p t i d e s h a v e b e e n d e t e c t e d a nd p h o s p h o r y l a t i o n mo d i fie d s i t e s h a v e b e e n i d e n t i fi e d v e r y s e n s i t i v e l y b y c o m b i n i n g i mmo b i l i z e d me t a l a ff i n i t y c h r o ma t o g r a p h y I MAC a ff i n i t y c a p t u r e w i t h c h e m i c a l l y a s s i s t e d de t t O O s e q u e n c i n g f o l l o w e d 4 s u l f o p h e n y l i s o t h i o c y a n a t e S P I T C d e r i v a t i z a t i o n b y MAL DI TOF ma s s s p e c t r o me t r y T h e N t e r mi nal s u l f o n a t i o n o f p h o s p h o p e p t i d e b y S P I TC e n h a n c e d MAL DI TOF P S D fra g me n t a t i o n s i g n a l s a n d p r o du c e d a s pe c t r u m c o n t a i n i n g o n l y Y i o n s Th i s me t h o d f a c i l i t a t e d de n o s e q u e n c i n g a n d s p e c t rum i n t e r p r e t a t i o n Th e c h a r a c t e r i z a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d s i t e s c a n s i mp l y c a l c u l a t e d f r o m mass d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e a d j a c e n t y i o n a n d a d v a n c e d s o f t w a r e i s n o t n e e d Ke y wor d s S PI TC p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s de t t O O s e q u e n c i n g ma s s s p e c t r o me t r y 翻译后 蛋 白质 的修 饰是 目前 蛋 白质组研 究 中 的 一 个重 要课 题 许 多 蛋 白质在 翻 译 后 会 在不 同 的基 团上 发生不 同的修 饰 如磷 酸化 糖基 化 甲基化 乙 酰化等 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内最重要 的 共价修饰方式之一 对蛋 白质磷酸化修饰的研究是 蛋白质结构分析与鉴定 中一个非常重要 的内容 因 为蛋 白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的 全部 过程 包括 细胞 的增殖 发育 和分 化 神 经活 动 肌肉收缩 新陈代谢 肿瘤发生等 尤其在细胞 应答 外界 的刺激 时 蛋 白质磷 酸化 是 目前 所知 道 的 最主要 的信号传递方式 确定蛋白质 的磷酸化修饰 位点 并总 结其 相关 的序列 特点 有助 于进 一步地 了解 参与磷 酸 化 的底 物 及 其 酶 的功 能 关 系 从 而 更 深 入 收稿 13期 2 0 0 5 1 2 1 4 接受 13期 2 0 0 6 0 4 0 3 国家 自然科学 基金资助项 目 N o 3 9 9 9 0 6 0 0 联系人T e l 0 7 3 1 8 8 7 2 5 5 6 E m a il L i a n g s p h u n n u e d u c a R e c e i v e d Dec e r a b e r 1 4 2 0 0 5 Ac c e p t e d A p r i l 3 2 0 0 6 S u p p o r t ed b y Na t i o n a l Na t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a No 3 9 9 9 0 6 0 0 C o r r e s po n d i n g a u t h o r T e l 0 7 3 1 8 8 7 2 5 5 6 E ma i l L i a n g s p h u n n u ed u c a 维普资讯 中国生物化学与分子生物学报 2 2卷 理解磷酸化修饰在生命过程中的作用 目前 蛋 白质组 研 究 也把 蛋 白质 的翻 译后 修 饰 作为一 个非 常重 要 的研 究 内容 包 括 蛋 白 质 的糖 基 化 磷酸 化等修 饰 这些 问题 无 法 从基 因水 平 获 知 只能从 蛋 白质 的 水平 进 行 研 究 因此 鉴别 磷 酸 化 蛋 白质并 对其 进行结 构分 析 已经成 为蛋 白质鉴 定工 作 中不 可或 缺 的技 术 理 论 上 可 用 于 鉴 定 蛋 白质 的方 法都 可 以用 于 分析 磷 酸 化 蛋 白 但 由 于 翻译 后 修 饰 的蛋 白相对 于总蛋 白来 说 具 有数 量少 修饰 种 类多 肽键脆 弱 等特 点 使 得磷 酸 化 翻译后 修 饰 p o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i fi c a t i o n s P T M s 的分 析 比 简 单 的蛋白鉴定困难得多 传统磷酸化蛋 白质 的分析大 多是利用 弛 P 放射性标记 之后进行二维磷酸肽作 图或 H P L C分 离及 E d m a n测序 等方 法 鉴定 磷 酸化 氨 基酸类 型及 位点 这 种 方法 一 是 存 在 放射 性 污染 问 题 操作 上 比较 困难 在 多 数 实 验 室都 难 以进 行 二 是对 于不能 用放射 性物 质标 记 的体 内磷 酸化 样 品无 法分析 随着质 谱技 术 的发 展 高灵敏 度 高效率 的质 谱 已被广 泛地 用来 进行磷 酸化 蛋 白质 的鉴定 以及磷 酸 化位点 的 分析 目前 利 用 质 谱 确 定 磷 酸 化 位 点最普 遍 的方 法 是 用 负 离 子 模 式 下 电 喷 雾 离 子 化 e l e c t ros p r a y i o n i s a t i o n E S I 源 内 碰 撞 诱 导 解 离 c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n C I D 产 生 的 负 离 子 作 为诊 断离子 如 H P O 9 7 U P O 7 9 U P O 6 3 u 诊 断离 子可通 过三 级 四极 杆 离子 阱装置 或混 合 四级杆 飞行 时 间 q u a d r u p o l e t i m e o f fl i g h t Q q T O F 仪 器来确定磷酸化位点 该方 法除了需要借 助于串联 质谱外 这些 技术 本 身 还存 在 着 一 个 最 大 的缺 陷 就 是裂解 的碎 片离 子 峰较 复 杂 给 图谱 解 析造 成 一 定 的 困 难 磺 基 异 硫 氰 酸 苯 酯 4 s u l f o p h e n y l i s o t h i o c y a n a t e d e r i v a t i z a t i o n S P I T C 是一 种蛋 白质 多肽 N端磺 酸 化试剂 在我 们 的前期工 作 中 我们 对该 试 剂 的磺 酸 化 条 件 进 行 了详 细 研 究 并 将 MA L D I T O F 质 谱结 合 S P I T C辅 助 的从 头 测 序 方 法 d e F t c e s e q u e n c i n g 应用 到 蛋 白质 多 肽 的鉴 定 中 在 本 文 中 我们 尝试 将 用 固相 金 属 离 子 亲 和 色 谱 i m m o b i l i z e d m e t a l a f fi n i t y c h r o m a t o g r a p h y I MA C 选择性地 从合成 的以及胰 蛋 白酶酶解 的混 合物 中亲 和提取 的磷 酸肽 进行磷 酸化 位点 测 定 获得 成 功 该 方 法 可 以 不需 要 进行 磷酸 酶水解 以及 进行 放射 性标 记来确 定混 合物 中的磷 酸肽 同时 在进行 磷酸 化位 点分 析时 只有带 有正电荷的 C端碎片离子系列 Y 离子 系列 出现 在质谱 图 中 图谱 背景 清晰 信噪 比高 单 纯 的 Y 片 段 离子 系列使 得 谱 图解 析 变 得 非 常容 易 不 需 借 助 于 任何 软件 只需 简单 地 计算增 加 8 0道尔 顿 的磷 酸 化 氨基 酸 即可 1材 料 和 方 法 1 1材 料 磺基 异 硫 氰 酸 苯 酯 4 s u l f o p h e n y l i s o t h i o c y a n a t e S P I T C T P C K处理 的胰 蛋 白酶 T P C K t r y p s i n 三 氟 乙酸 T F A 基 质 a 氰基 4 一 羟 基 肉桂 酸 a c y a n o 4 h y d r o x y c i n n a m i c a c i d C C A 酪 蛋 白 c a s e i n 为 美 国 S i g m a公 司 产 品 磷 酸 化 肽 一 1 A D p Y G E G D F L A E G G G V R P M P E P 1 分 子 量 1 6 9 2 6 9 0 7 磷 酸 化 肽 2 AD p Y G E GD p Y L A E Y GT V R P M P E P 一 2 分子量 1 9 3 9 8 2 1 1 由 中 南 大 学 湘 雅 医 学 院 提 供 C 1 8 Z i p T i p TM以及 Z i p T i p 均 为美 国 M i l l i p o r e公 司产 品 其 它试 剂为 国产 分析纯 双蒸 水为 本实 验室 制备 1 2 Z i p T i p M c 亲和提 取磷 酸肽 F e 螯合 亲和 柱 的制备 将 Z i p T i p 小 柱按 照说 明书要求 依次 用 5 0 乙腈 溶 液 含 0 1 醋 酸 2 0 0 m m o l L F e C 1 溶 液 双蒸水 1 0 乙腈溶 液 含 1 醋 酸 1 0 乙腈 溶 液 含 0 1 醋 酸 各 洗 3 5次 备 用 磷 酸 肽 亲和 提 取 取合 成 的磷 酸化 肽 混合 物 或 蛋 白酶 解 肽混合 物 1 0 l 用 1 0 乙腈溶 液 含 0 1 醋酸 稀释 1 0倍 用加样枪使 F e 螯合 亲和柱在此 溶 液 中吸 上 压下 多 次 用 2 0 乙腈 含 0 1 醋 酸 溶 液洗 去非特 异性 结合 的肽 用 1 m o l L的氨 水 4 l 洗脱 磷 酸肽 取 2肚 l 点 到 M A L D I T O F质 谱 仪 的不锈 钢样品靶上 待溶剂挥发后加 1 l 基质溶液结晶后 进 行质 谱分 析 1 3磷 酸化 肽 的磺 酸 化 将 氨水洗 脱 的磷 酸 化 肽冻 干后 溶 解 在 0 1 三 氟 乙酸 T F A 水 溶 液 中 将 Z i p T i p柱 在 样 品 中 吸 上 压下数 次使样 品 保 留 在柱 上 溶 解 磺 基 异硫 氰 酸 苯 酯 S P I T C 于 0 2 0 m o l L碳 酸 氢 钠缓 冲 液 p H 9 5 中 制备 成浓 度 为 0 1 g m l的 溶 液 取 1 0 l 于 0 2 m l E P管 中 将 含 有 样 品 的 Z i p T i p柱 在 其 中 吸 上 压 下数 次 最 后 使 溶 液 保 持 在 柱 上 在 5 5 保 温 3 0 m i n 再用 5 的 T F A溶液 过柱 终止 反应 1 4 MA L D I T O F分 析样 品制备 用 0 1 T F A冲 洗 Z i p T i p柱数 次 除 去 S P I T C及 杂质 将 样 品洗脱 在 2 新 鲜 制 备 的饱 和 基 质 a 氰 基 4 羟基 肉桂 酸 C H C A 溶液 5 g L 中 混合均匀 后取 0 5 l 点 板 空 气 中 自然 干燥后 测定质 谱 维普资讯 第 7期 陈 平等 利用磺基异硫氰 酸苯酯化学辅助方法鉴定磷 酸化肽修饰位点 5 9 3 1 5 MA L D I T OF质谱测 定 使 用德 国 B r u k e r 公 司 U l t r a F l e x M A L D I T O F T O F 飞行 时间质谱 仪进 行 氮气激 光 3 3 7 n m 真 空度 为 1 2 1 0 6 mb a r 操 作 参 数 如 下 氮 气 压 力 2 3 6 2 0 m b a r 激光 频率 5 0 0 H z 反 射模 式 时 离 子 源 1电压 2 5 k V 离 子 源 2电 压 2 1 8 k V 离 子 延 迟 提 取 1 5 0 n s 质 谱 信号 单 次 扫描 累加 5 0 1 0 0次 MS M S uF r 模 式下 离子源 1电压 8 0 0 k V 离子 源 2电压 7 2 0 k V 离子 延迟 提取 1 0 0 2 5 0 n s 质谱 信号 单 次 扫描累 加 1 0 0 2 5 0次 均在正 离子 p o s i t i v e i o n 模式 下检测 质谱 使 用 标 准 肽 混 合 物 a n g i o t e n s i n M 1 0 4 6 5 4 2 0 a n o t e n s i n I M 1 2 9 6 6 8 5 3 s u b s t a n c e P M 1 3 47 7 3 6 1 b o mb e s i n M 1 61 9 8 2 3 0 AC TH c l i p 1 1 7 M 2 0 9 3 0 8 6 8 ACTH c l i p 1 8 3 9 M A B 2 4 6 5 1 9 9 0 s o m a t o s t a t i n 2 8 M 3 1 4 7 4 7 1 4 作 为 外 标校 正 2 结果 2 1 F e 3 螯 合 Z i p T i p M c 柱亲 和 富集磷 酸肽 合 成 的 两 个 磷 酸 化 多 肽 磷 酸 化 肽 1 A D p Y G E G D F L A E G G G V R P M P E P 1 分 子量 1 6 9 2 6 9 0 7 为 单磷 酸化 肽 含 1 个 磷 酸 化 位 点 而 磷酸 化 肽 2 A D p Y G E G D p Y L A E Y G T V R P M P E P 2 分 子量 1 9 3 9 8 2 1 1 则 为 多磷酸 化 肽 含 2个 磷 酸化 位 点 另外 还含有 可被 磷酸 化 的氨基 酸 合成 的磷酸化 肽粗品被直接用 F e 螯合 的固相金属离子亲 和柱 I M A C 进 行 亲和纯 化提 取磷 酸肽 F 喀 1 T h e r e m d t 0 f p h o s p h o p e p t i d e I P M P E P 1 p u r i fi e d b yi mmo b i l i z e me t a l a f fi n i t y c h r o ma t o g r a p h y m A C A T h e M A L D I T O F M S s p e c tr u m o f s y n t h e s i z e d c r u d e p r o d u c t s B T h e MAL DI T OF MS s p e c t r u m a f t e r p u r i f i e d b y I MAC ta r g e t p e a k 1 6 9 2 固相 金 属 亲 和 色 谱 I M A C 方 法是 目前 选 择 性 的分离 和富集 磷酸 化肽 最 广泛 使 用 的方 法 在 该方法中 键合在螯合底物上 的金属离 子 一般 为 F e 或 G a 选择 性地 与 磷 酸化 肽 中的磷 酸 基 团 相 结合 而高 p H值洗脱液 与磷酸盐缓 冲液能将其 可 逆地释 放 出来 F i g 1 与 F i g 2分 别 为磷 酸化 肽 1与磷 酸化 肽 2样 品提 取 纯 化前 后 的 比较 其 中 A 图显示的为合 成的磷 酸化肽粗 品的 M A L D I T O F质 谱 图 B图 显 示 的 为 I M A C柱 亲 和 纯 化 提 取 后 磷 酸 化肽 段 的 M A L D I T O F质 谱 图 图 中显 示 合 成 的磷 酸化 产物 P M P E P 1及 P M P E P 2在 未 经 I MA C柱 亲 和提取 前 均 有 很 多 合 成 的 副 产 物 峰 F i g 1 A F i g 2 A 但经 I MA C柱亲 和提 取后 肽谱被 明显 简化 F i g 1 B F i g 2 B 从 F i g 1 B 中可 以看 到 目的 产 物 单磷 酸化 肽 M 1 6 9 2 成 为 主峰 但 在 F i g 2中除 了 目的 产物 多磷 酸化 肽 M 1 9 3 9 成 为主 峰外 另 外还 有一 个主峰存在 M 1 8 2 4 根据分子量推断 该峰应该 维普资讯 5 9 4 中国生物化学与分子生物 学报 2 2卷 A B F i g 2 T h e r e s u l t o f p h o s p h o p e p t i d e 2 P M P E P 2 p u r i fi e d b y i mmo b i l i z e me t a l a Wmi t y c h r o ma t o g r a p h y I MAC A Th e M A L D I T O F M S s p e c t r u m o f s y n t h e s iz e d c r u d e p r o d u c t s B T h e M A L D I T O F M S s p e c t r u m a f te r p u r i f i e d b y I M A C t a r g e t pea k 1 9 3 9 是 比 目的产物 少 一个 亮 氨 酸 的副 产物 亦 为磷 酸 化 肽 对 该副 产物 的测序 结果 证实 了这一 推论 数据 未 显 示 以上 结 果 说 明 在 本 实 验 所 采 用 条 件 下 I MA C 柱有效 地实 现 了对磷 酸化 肽段 的亲和 纯化 提取 2 2 化学辅 助 d e n o v o测 序 法 确 定 磷 酸 化 肽 及 磷 酸化 位点 为 了区分 磷 酸 化 肽与 非 磷 酸化 肽 可 以通 过 母 离子 扫描来 确认 磷酸 化 肽 在 M A L D I T O F正离 子 模 式下 含有磷 酸化 丝氨 酸 S e r 和磷 酸 化苏 氨酸 T h r 的肽 片段会 丢 失一 个 磷 酸 H P O 产 生 9 8质 量 数 的变化 而磷 酸 化 酪 氨 酸 T y r 通 常 丢 失 H P O 而 产 生 8 0质 量数 的变化 通过 母离 子扫 描可 以判 断蛋 白 质及 多肽磷 酸化 到 底是 发 生 在 丝 氨 酸 苏 氨酸 还 是 酪氨 酸 上 F i g 3是 磷 酸 化 肽 在 MA L D I T O F M S M S 正离子模式下的母离子扫描图谱 由图可见 在母离 子肽 片段旁 边 出现 了丢失 8 0质 量数 的肽 片段 峰 表 明该 磷酸 化肽 的修饰 发生 在酪 氨酸 上 确定磷 酸 化位点 的研 究常用 的方 法是 利用 碰撞 诱 导解 离 c o l l i s i o n i n d u c e d d i s s o c i a t i o n C I D 或源 后衰 变 p o s t s o u r c e d e c a y P S D 技 术使 磷 酸化 肽 产 生磷 酸 基 团的特 异性 片段 根 据 产 生 特异 的碎 片 离子 峰 来 确定 磷酸 化位 点 但该 方法 产 生 的 碎 片离 子 峰 非 常 复杂 谱图解析有一定的难度 在以前 的工作中 我 们曾尝试过不同的化学辅助质谱测序方法 并提出 了一种 新 的 N端 磺 酸 化 试 剂 磺 基 异 硫 氰 酸 苯 酯 S P I T C 详细 地研 究 了该 试 剂 在 d e o测 序 中的 条件 和 作 用 并 将 该 方 法 成 功 地 应 用 于 S D S P A G E 胶 点 的鉴 定 中 为 了解 决 磷 酸 化位 点 鉴 定 中碎 片离子 峰 复 杂 的 问 题 使 用 S P I T C化 学 辅 助 的 如 删 0测 序方 法被用 于磷 酸化 位点 的鉴定 中 I M A C微 柱 亲和 纯化 提 取 的磷 酸 化 肽 段 用 S P I T C衍 生后 直 接用质谱进行 de 删 D测 序获得理想结果 F i g 4显 示 的 是 磷 酸 化 肽 1 P M P E P 1 在 M A L D I T O F T O F 质谱上 的 de n o v o测 序 图谱 P M P E P 1 分 子量 为 1 6 9 2 加上 S P I T C修 饰基 团后 分子 量 增 加 2 1 5 故 修 饰 后母 离 子 峰 应 为 1 6 9 2 2 1 5 1 9 0 7 由 F i g 4可 见 选择 1 9 0 7 峰 片 段 进 行 碎 片 化 后 得 到 了背 景 清 晰 信 噪 比高 的 Y 离 子 系列 峰 且 v 1 至 y 1 6峰 全 部 出齐 在可被 磷酸 化 的位 点 T v r Y 处 可 见 T v r Y 并 非 以 1 6 3的质量 差 出现 而是 加 上 了 8 0 结 果表 明 该 T v r Y 已被 磷酸化 用 Y表示 在 序 列 中 只 存 在 单 个 可 被 磷 酸化 修 饰 的 氨 基 酸 只要 确定 此肽 为磷 酸化 肽 它 的磷酸 化位点 即 随 维普资讯 第 7期 陈平等 利用磺基异硫氰酸苯酯化学辅 助方 法鉴定磷 酸化肽修饰位点 5 9 5 2 O l O O 5 O F i g 3 T h e p r e c u r s o r i o n s c a n s p e c t r u m o f p l p h o p e p t i d e T h e l o s s o f I n a s s 8 O i s c o r r e s p o n d i n g t o t h e T y r mo d i fi c a t i o n l 誊 J R V G G G E A L F D G E G Y 砌 D A S P 兀 P 1 i I i l I I I I 1 一 J L I I I I I j l 一 I I L I I I J L I 上 I u l I j J J Fi g 4 MALDI TOF d e n OV O s e q u e nc i n g s pe c t r um o f PM PEP 1 On l y t h e s e r i e s o f Y f r a g me n t io n s i s s h o w T h e s h i f t i n p e p t i d e f r a g me n t IT l a s s 1 4 2 4 6 3 to 1 5 0 4 7 6 b y 8 O i s c o r r e s pon d i n g t o p h o s p h o r y l a t i o n o f T y 之确定 但是对于多磷酸化肽 磷酸化位点的确定就 变得 较 为 复 杂 了 我 们 合 成 的 磷 酸 化 肽 2 n A D p YG E G D p Y L AE Y G T V R C P M P E P 2 分子量 1 9 3 9 8 2 1 1 含 有 2个磷 酸 化位点 一个 存 在 于 N端 第 3位 一个 存在 于 N端 第 8位 另 外 在 N端 第 1 2 位还有 可被 磷酸 化 的 氨基 酸 用 同样 的 方法 将 该 合 成 的多磷 酸 化 肽 P M P E P 2用 I MA C微 柱 亲 和 纯 化 提取 使 用 磺 基 异硫 氰 酸 苯 酯 S P I T C 衍 生 后 进 行 d e 1 O V O测序 P M P E P 2 分 子 量 为 1 9 3 9 加上 S P I T C 修饰 基 团后 分 子 量 增 加 2 1 5 F i g 5显 示 的 是 P M P E P 2修 饰后母 离 子 为 2 1 5 4 1 9 3 9 2 1 5 的 峰 片段 在 M A L D I T O F T O F质 谱 上 的 de 1 O V O测 序 结 果 由 F i g 5可 见 在 MS M S条 件 下 得 到 了该 肽 片 段 的全 部 Y 离 子系列 峰 v 1 至 y 1 6峰全 部 出齐 且 背 景清 晰 信噪比高 用仪器所配置 的软件或用手工方法简 单 计算 两峰 之间 的分子 量差值 均 能极方 便地 解析该 维普资讯 中国生物化学与分子生物学报 2 2 卷 多磷 酸化 片段 的序列 在 N端 第 2位 D产 生 的 片段 峰 质 量 为 1 7 5 1 第 3位 Y产 生 的 片 段 峰 质 量 为 1 5 0 8 两 峰 之 间 的质量 差 为 2 4 3 正好 为 酪 氨酸 Y 的质量 数 1 6 3加 上 H P O 基 团 的 质量 数 8 0 表 明 N 端第 3位 的酪 氨 酸 被磷 酸化 了 从 图 中清 晰 可见 在 1 7 5 1 片段峰的旁边显示去掉 H P O 质量数 8 0 基 团 的峰 片段 1 6 7 1 进一 步确 证 了该 位 点 的酪 氨 酸 被磷 酸化 修饰 同样 的情 况发 生 在 N端 第 8位 的酪 氨酸 Y 上 在 N 端 第 7位 的 D产 生 的 片 段 峰 质 量 为 1 1 5 0 第 8 位 Y产生 的片段 峰质 量为 9 0 7 两 峰之 间 的质 量差 为 2 4 3 亦 正 好 为酪 氨酸 Y 的 质量 数 1 6 3 1 2 5 1 o 0 O 7 5 O 5 O O 2 5 加上 H P O 基 团 的质 量 数 8 0 且 1 1 5 0 片段 峰 旁边 也 显 示去掉 H P O 质 量 数 8 0 基 团 的峰 片 段 1 0 7 0 表 明 N端第 8 位 的酪 氨酸也 被磷 酸 化 修饰 但 N端 第 1 2 位 的酪氨 酸 情 况 不 同 在 其 1 1位 的 E产 生 的片 段 峰 为 5 9 3 在 其 1 2位 的 Y产生 的片段 峰 为 4 3 0 两 峰片段 之 间的质量 差 值为 1 6 3 正 好 为酪 氨 酸 Y 的 质量 数 表 明 N端第 1 2位 的酪 氨酸 没有发 生磷 酸化 修 饰 上 述 所有 的结 果 均 与 合成 的磷 酸 化 肽 完 全 吻 合 表明利用 M A L D I T O F质谱结合磺基异硫氰酸苯 酯 S P I T C 辅 助 的从 头测 序 方 法 完 全适 合 于多 磷 酸 化 位点 的鉴 定 R V T G Y E A L Y D G E G Y D A S P I TC j 1 l i l I L l l j j I I l j 1 j t一一 J L 1 i l L I l I 75 0 Fi g 5 M ALDI TOF d e R OP O s e q ue n c i n g s p e c t r u m o f mu l t i p ho s ph o r y l a t e d p e pt i d e PM PEP 2 On l yt h e s e r i e s o f Yf r a g me n ti o n si s s h o w T h e s h if t i n p e p t i d e f r a g m e n t ms s 1 7 5 1 3 9 t o 1 6 7 1 3 3 N t e r m i n a l 3 T y r a n d 1 1 5 0 0 2 t o 1 0 7 0 0 7 N t e r m i n a l 8 T y r b y 8 O i s c o r r e s p o n d i n g t o p h o s p h o r y l a t i o n o f T y r Th e T y r a t N t e rm i n al 1 2 i s n o n p h o s p h o r y l a t i o n 为 了进 一 步研究 此方 法是 否适合 于 酶解肽 混合 物 中磷 酸化 位点 的鉴 定 我 们对 酪 蛋 白 c a s e i n 进 行 了胰蛋白酶酶解 并 同样使用 固定金属 亲和色谱 I MA C 方法纯 化 出磷 酸 化肽 经 S P I T C衍 生后 进 行 d e O O测 序 F i g 6为 亲 和 纯 化 后 得 到 的 峰 片 段 2 0 6 1 8 2 理论 序 列为 n F Q p S E E Q Q Q T E D E L Q D K c 的 测序 图谱 从 F i g 6中可 见 母 离 子 峰 2 0 6 1 1 2 经 S P I T C衍 生 后 加 上 2 1 5为 2 2 7 6 2 3 在 母 离 子 峰 与 S P I T C衍生 峰之 间 出现 一 个 减 少 了 9 8的 峰片 段 表 明该 片 段 的 磷 酸 化 修 饰 发 生 在 丝 氨 酸 或 苏 氨 酸 S e r T h r 上 Y离子 系列 y 3 y 1 6峰全 部 出齐 在 N端 第 2位 Q产 生 的片段 峰质 量 为 1 7 8 6 第 3位 s产 生 的片 段峰 质 量 为 1 6 1 9 两 峰 之 间 的 质 量 差 为 1 6 7 正好 为丝 氨酸 s 的质 量 数 8 7加 上 H P O 基 团 的质 量 数 8 0 表 明 N端 第 3位 的丝 氨 酸 被 磷 酸 化 修 饰 了 此 结果 与理论 值 完全 吻合 3 讨论 综上所述 利用固相金属离子亲和色谱 I M A C 选择性地从混合物中亲和提取磷酸肽 采用磺基异 硫氰 酸 苯 酯 S P I T C 辅 助 的 从 头 测 序 策 略 结 合 M A L D I T O F质 谱进行 磷 酸化肽 分 离及磷 酸化位 点鉴 定 的方 法 操作 简单 快捷 易 行 避免 了磷 酸 酶 水解 以及放 射性 标记 等 繁 杂 步骤 同时 在 进 行磷 酸 化 位 点分析时 只有带有正电荷的 Y 离子系列出现在质 谱 图中 图谱背景清晰 信噪 比高 不存在一般的方 维普资讯 第 7期 陈 平等 利用磺 基异硫氰 酸苯酯化 学辅助方法鉴定磷酸化肽修饰位点 5 9 7 L E D E T Q Q Q E E p S Q F S P TC I 1 I D 暑 i i 鲁 l I 善 曼 三 1 一 一 IJ l t 5 oo 75 0 1 2 5 0 mf 1 75 0 2 25 0 Fi g 6 MAL DI TOF d e n o v o s e q u e n c i n g s p e d删o f c a s e m f r a g me n t 2 0 6 1 8 2 n F Qp S E EQQQT EDE L QDK c a l e r di g e s t e d b y t r y p s i n a n d p u r i fie d b y I M AC On l y th e s e r i e s o f Y f r a g n e n t i o n s i s s h o w T h e s h i ft i n p e p t i d e f r a n e n t ma s s 1 7 0 5 t o 1 7 8 5 b y 8 O i s c o r r e s p o n d i n g t o p h o s p h o r y l a t io n o f S e r 法中碎片离子峰复杂 图谱解析困难 的缺陷 单纯的 Y 片段 离 子 系列使 得 谱 图解 析变 得 非 常容 易 甚至 可以不需借助于任何软件 只需简单地计算质量数 增加 8 O的磷 酸化 氨基酸 即可极其 容易地 鉴 定 多磷 酸化修 饰 肽片段 的多 个 磷 酸化 位 点 该 方 法 的使 用 将极 大地 提高磷 酸化 蛋 白质或 多肽鉴 定 的准确 性及 其通 量水 平 参 考文献 R e f e r e n c e s 2 3 4 5 6 Hu b b a r d M Co h e n P On t a r g e t w i t h a n e w me c h a n i s m f o r t h e r e g u l a t i o n o f p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n J T r e n d s B io c h e m S c i 1 9 9 3 1 8 1 7 2 1 7 7 N a k a g a w a Y A o k i N Ao y a ma K S h i mi z u H S h i ma n o H Ya ma d a N Mi y a z a k i H Re c e p t o r t y p e p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e e p s i lo n P T P e p s i l o n M i s a n e g a t i v e r e gul a to r o f i n s u l i n s i g n a l i n g i n p r i m a r y h e p a t o c y t e s a n d l i v e r J Z o o l Sei 2 0 0 5 2 2 2 1 6 9 1 7 5 Wij k T Bl a n e h e t o t C H e o g J R e gula t i o n o f r e c e p t o r p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e d i m e r iz a t i o n J M e t h o d s 2 0 0 5 3 5 7 3 7 9 1 w a n a g a N Ka ma c h i M Ar a t a k e K I z u m i Y I d a H T a n a k a F T a ma i M A r i ma K N a k a mu r a H O r i gue h i T Ka waka mi A E gu e h i K Re gu l a t i o n o f alt e r n a ti v e s p l i c i n g o f e a s p a s e 2 t h r o u g h an i n t r a e e l l u l ar s i g n a l i n g p a t h wa y i n r e s pon s e t o p r o a po p t o ti c s t i mu l i l J J L a b C l i n M e d 2 0 0 5 1 4 5 1 0 5 1 1 0 Nu h s e T S S t e n s b all e A J e n s e n O N P e c k S C P h o s p h o p r o t e o mie s o f t h e Ar a b i d o p s i s p l a s ma me mb r an e an d a n e w p h o s p h o r y l a t io n s it e d a ta b ase J P l ant C e l l 2 0 0 4 1 6 2 3 9 4 2 4 0 5 L i m Y P D i o n g L S Q i R D r u k e r B J E p s t e i n R J P h o s p h o p mt e o mi e fi n g e r p r i n t i n g o f e p i d e r ma l g r o w t h f a c t o r s i g n a l i n g 7 8 9 1 O 1 1 1 2 1 3 and ant i e ane e r d r u g a c t i o n i n h u m a n t u m o r c e l l s J M o l C anc e r Th e r 2 0 0 3 2 1 3 6 9 1 3 7 7 S c h we p pe R E Ha y d o n C E L e wi s T S Th e c h a r a c t e riz a t io n o f p r o t e i n pos t t r ans l a t io n a l m odi fi c a t i o n s b y r Ia s s s pec t r o m e t r y J A c c Ch e m R e s 2 0 0 3 3 6 4 5 3 4 6I Le e s Mi l l e r S P An d e r s o n C W T w o h u man 9 0 k Da h e a t s h o c k p r o t e i n s are p h o s p h o r y l a te d i n v i v o a t c o n ser v e d s e r i n e s tha t are p h o s p h o r y l a t ed i n v it r o b y c a s e in k i n a s e J J B i o l C h e m 1 9 9 8 2 6 4 2 4 3 1 2 4 3 7 P e n n i n g t o n S R D u n n M J P r o t e o m i c s f r o m P r o te i n S e q u e n c e to F u n c t io n M U K B I O S S c ie n t ifi c P u b l i s h e r s L t d 2 0 0 1 L a r s e n M R R o e p s t o r f f P Ma s s s pe c t r o me t r i