原位杂交实验步骤.doc

原位杂交实验步骤 专业 2010-04-27 19:48:18 阅读17 评论0 字号：大中小订阅 1质粒的转化和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌1 取400uL XL1-Blue菌种加入到含200ml LB培养基的锥形瓶中，37 、100rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1 molL CaCl_2重悬细菌，冰浴30 min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200 tube)，-80 保存。2 转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng1的质粒DNA41加入到8O1感受态菌中。3 轻轻摇匀，冰浴30 min。442 热激9O秒，然后迅速冰浴2 min。5 加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37 ，100转min水浴孵育60 min。6取200l菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mgml)-IPTG(200mgml)的 LB-氨苄青霉素50 mgml,1lml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37 培养12-16h。1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落1 用无菌牙签挑取单菌落，接种到10 ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37 ，200转分培养2h，取1 ml之一Eppendorf离心管，加50l10mmolL EDTA(pH 8.0)。2 加入50l新配置的0.2molL NaOH、0.5SDS、20蔗糖溶液后，振荡3O秒。3 在70 温育5 min，然后冷却到室温。4 加1.514molL KCl和0.51含0.4溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。5 12000g，4 离以 3 min，以除去细菌碎片。6 制备1的琼脂糖凝胶(含EB0.5gml)，取50l上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒压50V，进行电泳。7 当溴酚兰迁移到凝胶全长的23-34时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。1.3质粒的扩增和纯化1 用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml LB-氨苄青霉素(50gml)培养液的聚丙烯管中，于37 ，200转分培养3h。2 将菌液转入含70 ml LB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37 ，200转分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170 ml)。37 ，200转分培养12-16h。4. 将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4 离,th,15 min，沉淀细菌。5. 弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5 min 6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10 min。7. 加入预冷的溶液III 3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10 min，出现白色絮状沉淀。8 6000rpm，4 离心15 min，保留上清。9 将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入O.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10 min。(或-20 4h，或4 过夜，可便核酸沉淀)10.12000 rpm，4 离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。11于室温用70的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。12用500l TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5 ml Eppendorf管中。13加入用冰预冷的5molL的LiCl溶液600l，充分混匀。12000 rpm，4 离心15 min，以沉淀高分子量的RNA。14.将上清转移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。15.12000 rpm,4 离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。16于室温用70的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。17.400l含无DNA酶的RNA酶(20g/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另1.5 ml Eppendorf管中，室温放置1.5ml Eppendorf管中30min。18加入400l 13(vv)的PEG 8000-NaCl(1.6 molL)，混匀，4 12000rpm离心5 min以回收质粒DNA，弃去上清。19加入400l TE缓冲液(pH 8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。20将水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1体积(约5013M的醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积(大约1 ml)的无水乙醇，充分混匀后于4放置30 min。21于4 12000 rpm离心5 min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。22加入400 l处于4 的70乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4 12000 rpm离心2 min。23吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。24用100l TE缓冲液(pH 8.0)溶解沉淀。25取4l溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260D2801.8。OD260OD280对DNA而言其值大约为1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。；DNA浓度=OD260 X 0.05 X稀释倍数(gl)。26质粒DNA溶液于-20 保存待用。二、cRNA探针的标记1 将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。2 线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。3 进行体外转录，步骤如下：4 在冰上将各试剂加入一1.5 ml无RNA酶的Eppendorf管中。DEPC处理的三蒸水8l质粒DNA模板 0.05gl 1l10 x NTP地高辛标记混合物 1 x 2l0.1 M DTT溶液 10 mM 2l5 x转录缓冲液 1 x 4lRNAse抑制剂 2Ul 1lRNA聚合酶 2U/l 2l反应体系总体积 20l5 加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37 孵育2h。6 加入2l无RNA酶的DNA酶I(10U1)，37 孵育15 min降解模板DNA。7 加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2l终止反应。8 加入2.5l的4 M Licl和7.5l冷的无水乙醇，混匀，-20 放置2h。9 12000g下离以 15 min，弃上清，小心地用50 l冷的70乙醇洗涤沉淀。1O室温下稍干燥，溶于1001 DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20 下保持备用。三、原位杂交3.1冰冻切片与杂交前预处理1 将子宫样品从-80 取出，用OCT包埋，在-23 (切片机腔体温度)平衡至少30 min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10m厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mgm1)的玻片上(玻片预先经180 干烤6小时)，保存于-70 冰柜备用。2 冰冻切片经室温干燥10 min后，在4的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。3 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。4 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。5 在切片上滴加蛋白酶K(0.1gm1)，37 孵育15 min，重复步骤4)。6 经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25AA0.1M TEA (乙酸酐三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)7 5 x SSC中平衡15 min。3.2杂交8 在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 l玻片)，置于放有湿盒液(50甲酰胺vv；0.3 M NaCl；1Mm EDTA；10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的湿盒中，5558 下的烘箱中预杂交2 h。9 甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ngl)经70 变性1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60l玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在4858 下杂交18-30 h。3.3杂交后处理1O取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 预热的5SSC洗30 min。11在无DNA的RNA酶A(20gml)溶液中37 下孵育30 min。12分别依次用52 预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。3.4杂交信号检测13在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。14在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：5001:2000稀释于含0.5阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。15用缓冲液A洗2次，每次15 min。16在缓冲液B(0.1M Tris-HCl；0.1M NaCl；0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。 17硝基四氮唑蓝