（中医骨伤科学专业论文）兔皮质骨来源成骨细胞与三种支架材料的体外实验研究.pdf

目录 中文摘要 1 英文摘要 3 1 l l 日i j 吾 一 一 一 一 一 6 正文 第一章 兔皮质骨来源成骨细胞体外培养及鉴定的实验研究 8 1 实验材料 8 2 实验方法 1 2 3 实验结果 1 5 4 讨论 1 7 5 小结 2 0 6 参考文献 2 1 第二章 兔皮质骨来源成骨细胞与三种支架材料的复合培养 2 3 1 实验材料 2 3 2 实验方法 2 4 3 实验结果 2 6 4 讨论 3 4 5 小结 3 7 6 全文结论 3 8 7 参考文献 3 9 致谢 4 1 附图 4 2 文献综述 4 9 作者简介 5 6 f i i ii 1 111 1 11 1 111 11 11111l y 17 9 318 8 兔皮质骨来源成骨细胞与三种支架材料的体外实验研究 研究生 张善涛 中文摘要 对通过酶消化法获取的兔尺骨皮质骨细胞进行鉴定 探讨其体外生长 增殖能力 的作为种子细胞的代数 检测兔皮质骨成骨细胞在自制小牛脱蛋白松质骨 冻干 x k c f d b 系列同种骨 及可吸收性明胶海绵三种支架上的生长情况 对三种支 与兔皮质骨成骨细胞的生物相容性进行评价 并用不同的细胞密度与三种支架材 培养 探求合适的细胞接种密度 为骨组织工程的细胞来源 载体材料的选择和 动物体内试验提供实验依据 结果 兔皮质骨来源成骨细胞体外培养与鉴定的实验研究 从3 月龄新西兰大白兔 雌雄不限 获取尺骨皮质骨 通过酶消化法获取原代细胞 适时传代 每日倒置相差显微镜观察细胞形态及增殖特征 m t t 法检测细胞生长和增殖 情况 绘制生长曲线 检测第2 3 6 7 和8 代细胞a l p 行a l p 染色 i 型胶原免疫组织 化学染色及骨钙素免疫组化染色 对细胞进行鉴定 结果 分离培养出的原代细胞 形 态类似成纤维细胞 具有良好的体外增嫡能力 细胞倍增时间约为7 天 各项染色检测 呈强阳性 细胞增殖速度 第l 2 天 各代细胞无差别 p 0 0 5 第3 天开始第7 8 代 细胞落后于第2 3 和6 代细胞 一直持续到第l o 天 尺o 0 5 而第2 3 代同第6 代细胞 及第7 代同第8 代细胞之间无显著性差异 p o 0 5 a l p 检测 第2 3 6 代成骨细胞高 于第7 8 代细胞 尺0 0 5 第二章兔皮质骨来源成骨细胞与三种支架材料的复合培养 将成骨细胞接种到三种支架材料上 进行体外复合培养 用倒置相差显微镜 扫描 电镜观察细胞在支架材料上的生长 增殖情况 并进行m t t 细胞上架率 a l p 及骨钙素 检测 结果 倒置相差显微镜显示三种支架为多孔网状 孔隙互相通连 随培养时间的 延长 细胞生长旺盛 增殖迅速 扫描电镜显示复合培养3 d 时 有较多的细胞粘附并铺 展在支架上 培养6 d 时 细胞完全伸展 呈长梭形 l o d 时细胞分泌较多的细胞外基质 重叠生长并连接成网状 尤以两种骨性材料组明显 m t t 检测显示三种支架材料在实验 前期不影响成骨细胞的生长 增殖 p o 0 5 后期 9 d 1 2 d 能促进成骨细胞的增 殖及分泌 与对照组比较有显著性差异 尺o 0 5 而三种支架材料组之间无显著性差 异 d 0 0 5 细胞上架率 当细胞接种密度为lx1 0 6 m l 时 可吸收明胶海绵细胞上架 率最高 为4 5 5 2 3 1 5 a l p 检测 细胞密度为lx1 0 5 m l 时各组之间无显著性差异 乃0 0 5 细胞密度为l 1 0 6 m l 时三种支架材料组高于对照组 p o 0 5 三种支架 材料组之间无显著性差异 乃o 0 5 细胞密度为6 1 0 6 m l 及lx1 0 7 m l 时 可吸收明 胶海绵组 小牛脱蛋白松质骨组 冻干松质骨组 对照组 p o 0 5 在12 d 时细胞密度为 6 1 0 6 m l 的各组支架材料a l p 细胞密度为1 1 0 7 m l 的各组支架材料a l p 骨钙素检测 第1 4 天小牛脱蛋白松质骨组及冻干松质骨组明显高于对照组及可吸收明胶海绵组 尺 l o 0 5 第2 1 天及第2 8 天 小牛脱蛋白松质骨组 冻干松质骨 可吸收明胶海绵组 对照 组 p o 0 5 结论 1 兔尺骨皮质骨体外可以培养出成骨细胞 体外培养的成骨细胞具有增殖 分泌 功能 其中第2 3 6 代细胞增殖和分泌功能强于第7 8 代细胞 新西兰大白兔皮质 骨成骨细胞理想的作为种子细胞的代数为2 6 代细胞 2 三种支架材料与兔皮质骨成骨细胞理想细胞接种密度为lxi 0 6 m 1 6 1 0 6 m l 随细胞接种密度上升细胞上架率在下降 当细胞接种密度为1 1 0 6 m l 时 可吸收明胶 海绵细胞上架率最高 为4 5 5 2 3 1 5 3 在理想接种密度下 a l p 检测 可吸收明胶海绵 小牛脱蛋白松质骨 冻干松质 骨 对照组 骨钙素检测 小牛脱蛋白松质骨 冻干松质骨 可吸收明胶海绵 对照组 4 本实验制备的小牛脱蛋白松质骨与兔皮质骨成骨细胞具有良好的生物相容性及 骨诱导性 且制备方便 价格低廉 是很好的骨替代材料 把小牛脱蛋白松质骨与兔皮 质骨成骨细胞复合构建组织工程骨 进行进一步试验是可行的 关键词 组织工程 兔皮质骨源成骨细胞 小牛脱蛋白松质骨 c d c b 冻干松质骨 f d c b 可吸收明胶海绵 a g s a n i m a lt e s t i n gp r o v i d e df u r t h e re x p e r i m e n t a le v i d e n c e m e t h o d sa n dr e s u l t f i r s tp a r t r a b b i tc o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t s sc u l t u r ea n di d e n t i f i c a t i o ni nv i t r o u l n ac o r t i c a lb o n eo b t a i n e db yo p e r a t i o nf r o m3 m o n t h o l dn e wz e a l a n dw h i t er a b b i t s n ol i m i to fm a l eo rf e m a l e w e r ed e a l tw i t he n z y m ed i g e s t i o nt oo b t a i nc e l l s 矾t hm i c r o s c o p eo b s e r v e dc e l l u l a rf o r ma n dm u l t i p l i c a t i o nc h a r a c t e r i s t i ce v e r y d a y a s s a y c e l lg r o w t ha n d p r o l i f e r a t i o nw i t hm 订 d r a w i n gt h eg r o w t hc u r v e d e t e c t i o no f t h es e c o n d t h i r d 6t h 7 t h a n d8 t hg e n e r a t i o nc e l l s sa l p a p p r a i s a lc e l l sw i t ht h em e t h o do fs t a i n i n gc e l l sw i t ha l p i c o l l a g e na n db o n ec a l c i u me l e m e n t r e s u l t s t h ei s o l a t e da n dc u l t u r e dp r i m a r y c e l l sm o r p h o l o g yw e r es i m i l a rt of i b r o b l a s t s w i t hg o o dp r o l i f e r a t i o ni nv i t r o c e l l s sd o u b l i n gt i m ew a s a b o u t7d a y s a n da l lt e s tr e s u l t sw e r ep o s i t i v e d c e l lp r o l i f e r a t i o nr a t e t h ef i r s t1 2d a y s e a c h g e n e r a t i o no f c e l ld i dn o th a v et h ed i f f e r e n c e 伶0 0 5 f r o mt h et h i r dd a yt h e7 t h 8t hg e n e r a t i o nc e l l ss i g n i f i c a n t l yl a g g e db e h i n dt h es e c o n d t h i r da n d6t hg e n e r a t i o n c o n t i n u e dt ot h e f i r s t10d a y s p 0 0 5 w h i l es e c o n d t h i r da n d6 t hg e n e r a t i o n 7 t ha n d8 t hg e n e r a t i o nh a dn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 侈0 0 5 a l p t h es e c o n d t h i r da n d6 t hg e n e r a t i o no f o s t e o b l a s t s a l pe x a m i n a t i o nw e r eh i g h e rt h a nt h e7 t h 8 t hg e n e r a t i o no fc e l l s sa l p p 0 0 5 t h ec e l ld e n s i t yw a slxl0 6 m l t h r e ek i n do fs u p p o r tm a t e r i a lg r o u pw e r eh i g h e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p p s e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n e f e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e c o n t r o lg r o u p t h e12 d e a c hg r o u po f s u p p o r tm a t e r i a la l p w h e nt h ec e l ld e n s i t yw a s6 x10 0 m l e a c hg r o u po fs u p p o r tm a t e r i a l a l pw h e nt h ec e l ld e n s i t yi s1 107 m 1 b g p t h e14 t hd a y s e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e d c a n c e l l o u sb o n ea n df r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n eg r o u pw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r o l g r o u pa n da b s o r b a b i l i t yg e l a t i ns p o n g eg r o u p p f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e a b s o r b a b i l i t y g e l a t i ns p o n g e c o n t r o lg r o u p p s e l f m a d ec a l f d e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n e f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e c o n t r o lg r o u p b g p s e l f m a d e c a l f d e p r o t e i n i s e d c a n c e l l o u sb o n e f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e a b s o r b a b i l i t yg e l a t i n s p o n g e c o n t r o lg r o u p 4 t h es e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n et h a tt h i se x p e r i m e n tm a d ew i t ht h er a b b i t 4 u l n ac o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t sh a sg o o db i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t ya n d b o n ei n d u c t i v i t y m o r e o v e ri tp r e p a r e dc o n v e n i e n t l y h a st h el o wp r i c e s oi ti st h ev e r yg o o db o n es u b s t i t u t i o n m a t e r i a l t h es e l f m a d ec a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n ea n dt h er a b b i tu l n ac o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t sc o n f o r m e dt oc o n s t r u c to r g a n i z a t i o np r o j e c tb o n e a n dc a l t yo nf u r t h e r e x p e r i m e n ti sf e a s i b l e k e yw o r d s t i s s u ee n g i n e e r i n g r a b b i tc o r t i c a lb o n e d e r i v e do s t e o b l a s t s c a l fd e p r o t e i n i s e dc a n c e l l o u sb o n e c d c b f r e e z e d r i e dc a n c e l l o u sb o n e f d c b a b s o r b a b i l i t y g e l a t i ns p o n g e a g s 5 福建中医药人学硕十学位论文 前言 脊柱和四肢常因感染 损伤 畸形 肿瘤 手术等原因 造成较大骨缺损 仅靠残 留骨组织的自身修复 往往难以满足机体结构和功能的需求 因此骨组织缺损的修复仍 然是困扰骨科界的一大难题 这尤其表现在不能接受自体骨移植的移植 骨质疏松的老 年人或大段骨缺损的病人上 传统的治疗方法有自体骨移植 异种骨移植和生物材料替 代等 这些方法均不同程度地存在着来源困难 免疫排斥及成骨能力不确定等缺点 在 对较大骨缺损进行骨移植时 新骨形成之前移植骨可能已被机体吸收 造成植骨失败 而组织工程的创立和发展 为骨的修复与重建提供了新的思路和方法 成为骨缺损修复 研究的突破点 组织工程学 t i s s u ee n g i n e e r i n g 是2 0 世纪8 0 年代提出的一门新兴的交叉学 科 主要是应用工程学和生命科学的基本原理和技术 在体外构建具有生物功能的人工 取代物 以修复组织缺损 替代失去功能或衰竭的组织和器官的部分或全部功能 它包 括了生物学 工程学 医学等多个领域的交叉和融合 它指应用生命科学和工程学的方 法 利用细胞 合成材料 处理过的天然材料和组织 细胞因子和基因技术使组织重新 构建和再生 从而完成缺损组织的修复或器官解剖与功能的重建 骨组织工程是其重点 研究对象之一 其基本技术路线是 采集功能相关的健康而有生命的细胞 将其种植于 具有一定结构的支架上 然后将经初步分裂繁殖后的细胞群落与支架复合体植入体内 形成具有一定结构和功能的组织和器官 据组织工程学原理 骨组织工程的研究内容包 括支架材料 种子细胞 诱导因子和组织工程骨构建方式等多个方面 目前骨组织工程 的构建主要有三种方式 支架骨 种子细胞 支架材料 生长因子 支架材料 种 子细胞 生长因子 骨组织工程材料不仅影响种子细胞的生物学特性和培养效率 而且决定移植后能否 与受体很好地适应并结合在一起 从而发挥其修复骨缺损地作用 因而在目前骨组织工 程的研究中 寻找理想地支架材料是一大热点 理想的骨组织工程细胞载体材料的要求 有 良好的生物相容性 如无毒 不致畸性等外 还应利于种子细胞粘附 增殖 不 引起炎症反应 甚至利于细胞生长和分化 支架完成支持作用后应能完全降解 降解 速度与降解时间可人为调控与组织细胞生长率相适应 具有三维立体多孔结构 孔隙 率最好达9 0 以上 具有较高的面积体积比 利于细胞粘附生长 细胞外基质沉积 营 养和氧气进入 代谢产物排出 也有利于血管和神经长入 一定的机械强度 为新生 组织提供支撑 并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性 良好的材料一 细胞界面 材料应能提供良好的细胞界面 利于细胞粘附 增殖 更重要的是能激活细 胞特异基因表达 维持细胞正常表型表达 易消毒性 组织工程中种子细胞的选择也是备受关注的焦点 目前国内大多数试验室以骨髓基 质细胞作为种子细胞 但该途径具有定向诱导分化难 细胞表型不稳定等缺点 骨皮质 来源成骨细胞目前研究比较少 但据国内学者研究表明 骨皮质培养成骨细胞是可行的 成熟的成骨细胞在体内不发生增殖 但是体外培养 在合适的条件下 成骨细胞可以大 6 兔皮质骨米源成骨细胞与三种支架材料的体外实验研究 量增殖 目前其常用的培养方法是酶法和组织块法 二者各有优缺点 本实验属南京军区 十一五 重点计划课题 0 6 2 2 9 子项目及福建省青年科技人 才创新项目 2 0 0 4 f 3 1 4 6 子项目 前期的实验已经证实通过酶消化法可以从兔尺骨皮 质骨获得细胞 且已与其它组织来源的细胞进行了比较研究 本实验对采用酶消化法获 得的细胞进行进一步鉴定 探求合适代数的成骨细胞作为种子细胞 然后把种子细胞与 自制小牛脱蛋白松质骨 冻干松质骨 可吸收明胶海绵三种支架材料复合培养 对三种 支架材料与兔皮质骨成骨细胞的生物相容性进行评价 并用不同的细胞密度与三种支架 材料复合培养 选取理想的细胞接种密度 同时对三种支架材料进行对比 为骨组织工 程的细胞来源 载体材料的选择和进一步动物体内试验提供实验依据 7 福建中医药人学硕十学位论文 第一章兔皮质骨来源成骨细胞体外培养及鉴定的实验研究 1 实验材料 1 1 试验地点及动物 本实验在厦门大学生物医学工程研究中心完成 实验室内配备专用的动物实验室及 标准的细胞培养实验问 见图1 一图2 实验动物为3 月龄新西兰大白兔8 只 雌雄不 限 购自上海动物医学中心 1 2 主要试剂与仪器 见表1 表2 和图3 图6 1 3 主要溶液配制 1 3 1 常规培养基 d m e m f 1 2 培养基干粉一袋 超纯水7 0 0 m l 搅拌溶解 加入n a h c o 1 2 g 定容至1 0 0 0 m l 用n a o h 或者h c l 调节p h 值为7 0 7 2 过滤后p h 可上升0 2 0 3 以 蔡氏过滤器0 4 5 u m 和0 2 2 u m 双层滤膜过滤除菌 2 0 0 m l 每瓶分装 4 c 冰箱储存备用 使 用前添加1 0 胎牛血清和1 双抗 青霉素1 0 0 0 0u m 和链霉素1 0 0 0 0ug m 1 静置1 2 2 4 小时后可使用 1 3 20 1 m o l lp b s a 不含钙 镁的磷酸盐缓冲液 n a c l8 o g k c l0 2g k h p 0 40 2 g n a h p o 1 2 h 02 8 9 9 加超纯水7 0 0 m l 搅拌溶解 盐酸调节p h 7 2 定容至1 0 0 0m l 高压蒸汽灭菌2 0m i n 分装2 0 0 m l 每瓶 4 储存备用 1 3 30 2 5 的胰蛋白酶 用少许p b s 将2 5 0 m g 胰蛋白酶粉末调成糊状 再謇b p b s 至1 0 0m l 搅拌溶解 力h n a h c o 调p h 8 0 左右 室温放置4h 或4 c 冰箱过夜 超净台内用0 2 2 ji n 孔径的一次性滤器过滤除菌 用离心管1 0m l 每管分装 2 0 c 保存 使用前3 7 c 水浴 溶解 1 3 4o 1 的i 型胶原酶 用少许p b s 将l o o m gi 型胶原酶粉末调成糊状 再卒b p b s 至l o o m l 搅拌溶解 力f l n a h c o 调p h 8 o 左右 室温放置4h 或4 c 冰箱过夜 超净台内用0 2 2um 孔径的滤器过滤除菌 用1 5 m l 离心管分装 l o m l 每管 2 0 c 保存 使用前3 7 c 水浴溶 解 1 3 5 噻唑蓝 m 1 1 称取2 5 0 m g 噻唑蓝粉末 加入5 0 m l 的p b s 搅拌溶解 超净台内过滤 4 c 避光保存 有效期1 4 天 1 3 6p n p p a m p 溶液 p n p p2m m m g c l 2 m m a m p0 i m a m p 2 氨基 2 甲基一卜丙醇 0 9 m l 9 9 纯度 p n p p 对硝基苯磷酸二钠 六水 0 0 7 4 2 9 m g c l 2 6 h 00 0 4 0 6 6 9 先把p n p p m g c l 溶解于l o o m l 的超纯水 过滤除菌 4 c 储存 使用前加入a m p 1 3 70 2 结晶紫溶液 0 2 9 结晶紫 溶于l o o m l 超纯水 搅拌后 4 c 保存备用 1 3 8 电镜制样中常用固定剂的配制方法 1 3 8 1 磷酸缓冲液 0 2 m 甲液 n a h p o 1 2 h 0 7 1 6 4 9 3 5 8 2 r 兔皮质骨米源成骨细胞与三种支架材料的体外实验研究 加蒸馏水溶解成1 0 0 0 m l 5 0 0 m 1 乙液 n a h p o 2 h 03 1 2 1 9 1 5 6 0 5 加蒸馏水溶解成l0 0 0 m l 5 0 0 m 1 按下表混合甲 乙两液即得所需p h 的磷酸缓冲液 表l o 2 m 的磷酸缓冲液的配制 5 0 m 1 p h6 46 6 6 8 7 07 27 4 甲液 m 1 1 3 31 8 82 4 5 3 0 5 3 6 04 0 5 乙液 m 1 3 6 73 1 22 5 51 9 51 4 o9 5 1 3 8 2 固定液 2 5 戊二醛磷酸缓冲溶液 0 2 m 磷酸缓冲液5 0 m l 2 5 戊二醛水 溶液l o m l 加水定容至l o o m l 1 3 8 3 梯度乙醇液 3 0 3 份纯乙醇液 7 份超纯水 5 0 5 份纯乙醇液 5 份超纯水 7 0 7 份纯乙醇液 3 份超纯水 9 0 9 份纯乙醇液 1 份超纯水 9 5 9 5 份纯乙醇液 0 5 份超纯水 1 0 0 直接使用纯乙醇液 1 3 8 4 醋酸异戊酯 乙醇 1 1 v v 配制 9 对硝基苯磷酸二钠 p n p p 2 氨基 2 甲基 1 丙醇 a m p 酶免骨钙素 t r i t o nx 1 0 0 超纯水 培养皿 1 0 0 m i n 6 0m m 3 5 m m 细胞培养板 2 4 孔 9 6 孔 e p p e n d o f f 管 2m 1 离心管 1 5m l 5 0 m i 微孔移液枪 2 2 0 1 0 0 1 0 0 0 1 a l 微孔滤膜 o 4 5 岬 o 2 2t t m 血球计数板 冻干松质骨 x k c f i b 系列同种骨 s i g m a a c r o s 美国a d l a m r e s c o 厦门大学物理微机电中心 c o m i n g c o m i n g 上海生物工程技术公司 f a l c o n f i n n p i p e t t e 上海市新亚净化器厂 上海医用光学仪器厂 北京鑫辰医学科技发展有限公司 可吸收性明胶海绵 南京金陵药业股份有限公司 一一 1 0 电子天平 酶标仪 恒温磁力搅拌器 b s 2 0 0 s w e 北京采多利斯 灭j i 公j d e l x 8 0 0 8 5 1 立式自动电热压力蒸汽灭菌器l d z x 4 0 b i 电热恒温鼓风干燥箱 超低温冰箱 离心机 倒置相差显微镜 荧光显微镜 扫描电镜 d h g 9 1 4 0 a d f 8 5 1 4 k a 1 0 0 0 a e 2 0 a x i o v e r t2 0 0 b i o t e k 固 仁f u 器有限公i d i 海中立医疗器械厂 1 海褙宏实验设备有限公i d 美围两盟公ld 飞鸽牌 m o t i c c a r iz e i s s x l 3 0 e x e m p h l i p s 福建中医约人学硕十学何论文 2 实验方法 2 1 兔皮质骨细胞的获取及培养 2 1 1 原代细胞的获取及培养 取材前清洗并紫外消毒实验室 采用高压蒸汽或过滤方法灭菌实验用品 准备如下 用品 新西兰兔 硫化钠 脱毛 速眠新 碘伏 酒精 注射器 手术刀 镊子 血 管钳 骨锤 组织剪 线剪 无菌纱布 手套 帽子 口罩 手术衣 手术布巾 1 5 m l 离心管 见图7 一图8 3 月龄的新西兰大白兔称重为2 k g 左右 雌雄不限 用脱毛剂硫化 钠去毛后 皮下注射麻药速眠新 0 2 0 3m l k g 观察动物肌肉松弛后局部消毒 铺 巾 见图9 切开皮肤皮下组织 钝性拨开肌肉 暴露肱骨 尺骨 彻底去除尺骨上的 软组织 用手术刀片取尺骨上的皮质骨 见图1 0 注意不打通髓腔 将骨皮质置于1 5 m l 装有含双抗的p b s 液的离心管中 迅速转移至细胞问 然后将组织块转移j u l o o m m 培养皿 中 以含双抗的无钙 镁p b s p b s a 液反复冲洗至冲洗液无血色和杂质 用眼科剪将 皮质骨片反复剪切成1 2 m m 2 大小 过程中注意保持骨片湿润 然后将组织块用0 2 5 胰酶 消化3 0 m i n 1 去除消化液 重复消化5 次 然后加培养基培养 6 0 j 时后去除培养基 加入胰酶消化3 0 m i n 加入适量培养基终止消化 取上清液离心l o m i n 1 0 0 0 r m i n 沉 淀物用培养液悬浮 接种于培养皿内 重复3 次 直至离心后无沉淀物 3 天后观察换液 以后每2 天换液一次 并在显微镜下观察细胞形态 贴壁 生长情况 2 1 2 细胞的传代及培养 待细胞长至瓶底9 0 面积时 进行消化传代 传代过程如下 1 弃去旧的培养基 加入2 m lp b s 清洗2 次 2 加入0 2 5 胰蛋白酶l m l 摇晃培养皿 确保胰酶覆盖整个培 养皿底 3 1 0 3 钟后 弃胰酶液 重新加入0 2 5 胰蛋白酶2 m l 消化5 l o m i n 4 倒置相差显微镜下观察 发现细胞变圆 细胞间隙增大 细胞随液体移动时弃消化液 或者直接加入5 m ld m e m f 一1 2 培养基终止消化 用吸管反复轻轻吹打 制造细胞悬液 5 将细胞悬液转移到1 5 m 1 离心管中 以1 0 0 0 转 分 r p m 离 5 8 m i n 弃上清 加入培养基 重新悬浮细胞 用差速贴壁法纯化细胞 以1 3 比例传代 于培养箱中继续培养 2 1 3 细胞计数 传代时 取2 0 u l 细胞悬液 从盖玻片交接处滴入细胞计数池中 在1 0 倍物镜的倒置 显微镜下 调焦找到细胞 分别计数细胞计上四个角落中由横竖各3 条并行线组成的1 6 个小格上的细胞 细胞团计数为1 如果细胞压在线上 则数上不数下 数左不数右 用以下计算公式 四大格中细胞数x1 0 0 0 0 4 计数单位以个 m l 表示 2 2 兔皮质骨细胞的观察及检测 2 2 1 倒置相差显微镜观察 每天观察各代细胞的形态特征 生长及增殖情况 并照相 2 2 2 结晶紫染色细胞形态观察 待细胞基本长满皿底后行染色 去除培养液 p b s 冲洗两次 加入l m l1 0 的中性缓 冲福尔马林固定 3 0 分钟后吸除福尔马林 用去离子水冲洗两遍 风干 每孔加入l m l0 2 兔皮质骨来源成骨 细胞与二种支架材料的体外实验研究 的结晶紫溶液 室温下染色3 0 分钟 然后用超纯水多次冲洗 直到冲沈液基本无色 于 倒置显微镜下观察 拍照 2 2 3m t t 法测各代细胞生长曲线 消化收集第2 3 6 7 和8 代细胞 调整细胞密度为lx1 0 5 个细胞 m l 以每孑l 1 5 0 i ll 接种于9 6 孔培养板中 每代细胞设1 0 块板 每板设6 孔 置入3 7 c 5 c 0 2 饱和湿 度孵箱内培养 2 天换液一次 于接种后第l l o d 每天每代细胞各取出一块培养板用m t t 法测成骨细胞的光吸收值 a 4 9 2 每孔加5 m g m 1m t t 溶液2 0u1 3 7 2 5 c 0 2 饱和湿 度孵箱内继续孵育4 h 后 小心吸弃孔内上清液 p b s 液轻洗3 次 每孔加入二甲亚砜1 5 0 pl 振荡l o m i n 使沉淀充分溶解后 选择4 9 2 n m 波长 在酶联免疫检测仪上测定各孔的 光吸收值 a 僦 记录结果 并以时间为横轴 光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线 2 2 4 各代细胞碱性磷酸酶 a l p 检测 把第2 3 6 7 和8 代成骨细胞分别制成lx1 0 6 m l 的细胞悬液 以6 0 u 1 分别接种于 2 4 孔细胞培养板中 每代设2 4 个复孔 分别于第6 8 1 0 1 2 天去除培养基 每代细胞 每次取6 孔 然后 向每孔中力n 2 0 0ul0 5 的t r i t o n x 一1 0 0 并放置过夜 最后 向每 孔中力n 2 0 0ul 的p n p p a m p 溶液 含p n p p2m m o l l m g c l 2m m o l l a m p0 1m o l l 的 水溶液 并于3 7 c 孵育3 0 m i n 用4 0 0i j ll m o l ln a o h 终止反应 用紫外分光光度计 b e c k m a nc o u l t e rd u8 0 0 于4 0 5 n m 处检测上清液的吸光值 a 4 0 5 2 2 5 细胞a l p 染色 取第3 代细胞 接种于预置盖玻片的6 孔培养板 普通培养液培养 2 天换液一次 培养7 天取出盖玻片 按照以下方法操作 1 将培养板用冷丙酮在4 0 冰箱内固定1 8 2 4 小时 2 放入孵育液中置于3 7 c 温箱或水浴内孵育1 0 3 0 分钟 3 蒸馏水稍沈 4 2 硝酸钻水溶液处理2 5 分钟 5 蒸馏水速洗一次 6 1 硫化胺水溶液处理l 2 分钟 7 流水冲洗数分钟 8 自然脱水 于光学显微镜下观察 2 2 6i 型胶原免疫组织化学染色 取第3 代细胞 接种于预置盖玻片的6 孔培养板 普通培养液培养 2 天换液一次 培养1 2 天取出盖玻片 以p b s 洗涤三次 9 5 酒精固定2 0 分钟 按照以下方法操作 1 3 过氧化氢孵育5 1 0 分钟 以消除内源性过氧化物酶的活性 2 蒸馏水冲洗2 分钟x 3 次 加5 正常山羊血清封闭 室温下2 0 分钟 3 弃去多余液体 滴加5 0 u l 鼠i 型胶原单克隆抗体中作液 3 7 c 孵育1 小时 4 c 冰箱过夜 4 0 0 1 m p b s 漂洗3 分钟x 3 次 5 滴加生物素化羊抗鼠i g g 中作液5 0 u 1 3 7 c 孵育1 小时 1 3 福建中医药人学硕十学位论文 6 0 0 1 m p b s 漂沈3 分钟x3 次 7 滴加5 0 u l s a b c 复合液 3 7 孵育1 5 分钟 8 0 0 1 m p b s 漂洗3 分钟 3 次 9 滴加i o o u l d a b 显色液 室温显色3 1 0 分钟 光镜下控制显色时间 1 0 蒸馏水反复洗涤以终止反应 苏木素复染 脱水 透明 封片 2 2 7 骨钙素免疫组化染色 染色方法同i 型胶原免疫组化染色 操作过程中使用的抗体 一抗为骨钙素抗血清 二抗为生物素化羊抗人i g g 2 3 统计学处理 所有数据采用s p s s l 3 0 统计学软件进行处理 各组数据均以均数 标准差 s 表示 采用t 检验和单因素方差分析 o n e w a ya n o v a 检验 各检测时点两两比较采用 l s d 法进行统计学分析 尺0 0 5 有统计学意义 1 4 兔皮质骨米源成骨细胞与三种支架材料的体外实验研究 3 实验结果 3 1 倒置相差显微镜观察 3 1 1 原代细胞观察 倒置相差显微镜下可见新接种的细胞悬浮于培养液中 为圆形透亮细胞 见图1 1 4 5 h 后细胞开始贴壁 2 4 h 后细胞大部分贴壁 呈长梭形 短梭形及椭圆形 第2 3 d 细胞开始增殖 形态以长梭形为主 也有部分短梭形 见图1 2 第4 5 d 细胞增殖明 显 形成多个相对独立的细胞簇 细胞由簇中央向周围生长 第7 8 d 细胞继续增殖 并连成单层片状 形态以带长 短梭形为主 见图1 3 第9 l o d 细胞长满培养皿底 见图1 4 细胞形态较均一 多为长梭形 短梭形 也有少量呈三角形 3 1 2 传代细胞观察 倒置相差显微镜下可见 1 6 代细胞形态同原代细胞无明显差异 初期细胞在培养 液中呈圆形 2 h 后细胞贴壁 4 6 h 后 大部分细胞贴壁 形态以长梭形为主 也有少 量三角形 细胞之间相互连接 突起较短 2 4 h 后 细胞完全贴壁 第3 4 d 细胞增殖 明显 以长梭形 三角形为主 8 9 d 细胞长满培养皿底 从第7 代细胞丌始见少量空 泡细胞 细胞贴壁时间延长 4 6 h 开始贴壁 增殖速度减慢 第4 6 d 细胞丌始增殖 连续培养l o d 细胞仍未长满培养皿底 3 1 3 细胞结晶紫染色后的观察 各代细胞经结晶紫染色后 细胞形态如上述 但细胞之间的连接 细胞质 细胞 核以及核仁更加清晰可见 见图1 5 细胞基本形状为长梭形 胞内有一个细胞核 容 纳l 3 个核仁 核浆比例为1 4 1 2 不等 细胞之间分界清楚 但突起相互交织在一起 使细胞连成一片 核浆比例较小 单核 核仁一般为l 2 个 处于分裂期时双核 可有 5 6 个核仁 而且细胞分解更加清晰 见图1 6 各种细胞胞浆呈蓝色或淡蓝色 黑白 照呈灰黑色 细胞核圆形或椭圆形 淡染 核仁呈小圆点 深蓝色 3 2 各代细胞生长与增殖测定 5 种不同代数的细胞增殖过程如表3 所示 生长过程分为生长缓慢的潜伏期 增殖 迅速的对数生长期及生长相对缓慢的平台期 5 代细胞其大致增殖时间为 第1 2 d 细 胞数量无明显增加 第3 d 开始细胞数量明显增加 在第7 8 d 达到最高峰 然后进入缓 慢的增殖期 细胞增殖速度 第1 2 天 各代细胞增殖无差别 乃o 0 5 第3 天开始第7 8 代细胞增殖速度明显落后于第2 3 和6 代细胞 尺0 0 5 而第2 3 同6 代及第7 代 同第8 代细胞之间并无明显差别 乃0 0 5 福建中医约人学硕十学位论文 o 6 o 5 0 4 o 3 0 d 值 o 2 o 1 0 一贫j 2 代 德3 代 i 骂 笫6 代 笫7 代 d 一筇8 代 一 磊 7 多q 么 j 豫 f 一一 瘤 1 7 i t m h m 描 l d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 d1 0 d 表3m t t 法检测不同代数细胞生长曲线 f i g3t h eg r o w t hc u r v e so fc e l l sf r o md i f f e r e n tg e n e r a t i o nb ym t t 3 3 各代细胞a l p 表达情况 如表4 示 各代成骨细胞都随着培养时间的延长a l p 活性不断增高 在培养初期第 2 3 和6 代成骨细胞a l p 检测明显高于第7 8 代成骨细胞 而第2 3 与6 代及第7 代与第8 代之问无显著性差异 随培养时问的延长这种差异不断扩大 在第1 2 天时这 种差异尤为明显 p 0 0 5 与第3 代比较 p 0 0 5 与第2 3 6 代比较 p 0 0 5 3 4 细胞a l p 染色 细胞培养7 天行a l p 染色 a l p 染色呈阳性 细胞呈灰黑色 胞浆内有灰黑色颗粒 沉淀 见图1 7 a l p 染色阳性细胞数 7 0 3 5i 型胶原免疫组织化学染色 经染色后可见胞浆内及细胞间有大量的棕黄色颗粒存在 明显的强阳性 见图1 8 3 6 骨钙素免疫组化染色 细胞胞浆内有大量棕黄色颗粒存在 呈明显的强阳性 见图1 9 1 6 兔皮质骨米源成骨细胞与三种支架材料的体外实验研究 4 讨论 4 1 成骨细胞的来源问题 成骨细胞的生物学特性直接影响组织工程化活性骨的质量 因此 对成骨细胞的研 究是骨组织工程重要内容之一 成骨细胞来源多样 细胞取材常用的机体来源有动物如 猴 羊 猪 狗 兔 鼠等 胚胎及人类遗弃的组织或者新鲜尸体等 而其组织来源又 包括 骨膜 骨松质 骨皮质 骨髓基质干细胞 骨髓间充质干细胞 骨外间充质干细 胞 胚胎干细胞等 1 这些细胞来源各有优缺点 骨髓干细胞因取材较方便 具有多向 分化潜能 条件诱导下可向成骨细胞分化 是一种很有前途的种子细胞来源 是目前常 用的种子细胞之一 但干细胞需要分离纯化 且干细胞向成骨细胞分化 需要一定的诱 导条件 诱导成功后仍可能存在分化不够稳定等问题 近年来松质骨来源的成骨细胞的 研究很多 3 松质骨主要是疏松的骨小梁成分 来源广泛 具有培养过程简单 细胞增 殖较快等优点 但骨小梁上有骨内膜 且小梁间有很多骨髓成分 细胞成分 杂质较多 掺有不少成纤维细胞和造血细胞等 成骨细胞成份相对不纯 另一种常用的组织来源为 骨膜 细胞耿材常用的 般是外骨膜 其分为内外两层 内层较薄 结缔组织较疏松 纤维较少 除了丰富的小血管和神经 还含有较多的成骨细胞 骨原细胞和未分化的干 细胞t 4 1 生长时期 骨膜来源的成骨细胞在机体内具有很强的成骨能力 成年骨膜在创 伤应激下聚集较多促骨生长因子 5 1 而有很强的再生骨能力 因此骨膜来源的成骨细胞 具有较强的成骨能力和增殖速度 但由于其取材困难 容易掺杂肌肉组织 胶原成分较 多 容易混杂成纤维细胞及细胞容易污染等缺点 也限制了其作为种子细胞的广泛应用 关于骨皮质来源的成骨细胞目前研究比较少 骨皮质是由许多哈佛氏骨单位规则排 列而成的 发育中的骨单位表面具有活跃的成骨细胞 骨形成单位有1 0 0 4 0 0 个细胞 t 6 1 可不断形成类骨质 经钙化后成为新骨 此后成骨细胞一部分转化为骨细胞 部分 仍位于骨表面 并成为扁平的内衬细胞 在力学刺激及诱导下 4 8 小时后 可向成骨 细胞转换 但不发生增殖 电镜下观察皮质的成骨细胞后方总有一两层激活的间充质细 胞和前成骨细胞 可向成骨细胞分化 据国内学者研究表明 7 1 骨皮质培养成骨细胞是 可行的 成熟的成骨细胞在体内不发生增殖 但是体外培养 在合适的条件下 成骨细 胞可以大量增殖 本课题前期的试验已经证实通过酶消化法可以培养出细胞 本实验进 一步检验为成骨细胞 4 2 皮质骨源成骨细胞分离培养及体外生长特点 目前皮质骨源性成骨细胞的常用分离方法是组织块法和酶消化法 j a np a u l m f r o l k e 8 等用胶原酶结合组织块法培养皮质骨组细胞 a n g e l am i n h w e in g 1 等用 i 型胶原酶消化皮质骨过夜 p h w a r n k e 叮和s p r i n g e ri n g 嵋均用组织块法直接培养 组织块法操作简单 细胞损伤小 但原代细胞培养时间明显太长 考虑到取材时皮质骨 片的厚度 大小及贴壁等因素其培养时间约2 4 周不等 再加上后期细胞的消化 传代 而且在后期的换液中因骨片的存在增加了细胞污染的几率 因此整个种子细胞的培养周 期太长 会导致整个实验周期延长及浪费大量的人力和财力 酶消化法操作相对复杂 福建中医药人学硕十学位论文 胰酶会对细胞造成一定损伤 长时间的酶消化可能破坏成骨细胞细胞膜和表型相关的膜 表面分子 1 2 1 但原代细胞培养时间明显缩短 约1 2 周 如果在消化过程中注意酶及 消化时间的控制 不仅能较短时间的获得较好的种子细胞 而且能节约大量的时问和财 力 本实验采用酶消化法获取原代细胞 在倒置相差显微镜下可见新接种的细胞悬浮于 培养液中 为圆形 椭圆形透亮细胞 大小不等 随培养液移动 约4 5 h 后部分细胞 开始贴壁 约2 4 h 后大部分细胞贴壁 但在倒置相差显微镜下仍可见少量未贴壁的悬浮 在配液中的细胞 因此为保证不浪费细胞 刚消化接种的细胞其换液时间最后控制在 4 8 小时以后 第2 3 d 细胞开始增殖 形态以长梭形为主 第4 5 d 细胞增殖迅速 形成多个相对独立的细胞簇 细胞由簇中央向周围生长 第7 8 d 细胞继续增殖并连 成单层片状 以长 短梭形细胞为主 第9 一l o d 细胞长满培养皿底 细胞形态均一 为长梭形 在细胞增殖过程中 细胞密集区可表现为放射状 旋涡状或栅栏状 第2 6 代细胞间不存在接触抑制 随着培养时间的延长 相互重叠成多层 细胞密度增加 未 见细胞衰老现象 这可能是因为成熟的成骨细胞能分泌大量的i 型胶原 胶原纤维交织 成网状 将新增殖的成骨细胞包围其中 导致细胞形成多层 为钙化组织提供必不可少 的三维结构 与成骨细胞的特点相复合 在细胞培养过程中我们还发现每代细