如何通过伽马辐射提高免疫测定灵敏度：抗HIV—1酶联免疫吸附测定中的聚苯乙烯表面的改性、应用及表征.doc

如何通过伽马辐射提高免疫测定灵敏度：抗HIV1酶联免疫吸附测定中的聚苯乙烯表面的改性、应用及表征摘要：经60CO 射线辐射的改性聚苯乙烯（PS）微量滴定板用于间接酶联免疫测定抗人类免疫缺陷病毒1型（抗HIV1）。用9 kGy（最佳剂量）辐射过的板在血清学诊断试验中表现出比未处理组高25倍的检测灵敏度，并且比控制组低3倍的酶浓度仍是可检测的。吸附/解析实验结果、原子力显微镜（AFM）图像和X射线光电子能谱（XPS）分析为这种性能提升提供了证据。在辐射期间形成的氧化表面对包被抗原呈现出更高的结合亲和力，并能均匀地吸附更大量（1.53倍）的蛋白质。关键字：ELISA，射线辐射，HIV1，聚苯乙烯表面，蛋白吸附前言 PS微量滴定板常作为酶联免疫吸附测定（ELISA）中蛋白质吸附的固相载体，现在作为一种成熟的技术已被广泛应用于生物科学和医学实验室诊断。由于这种检测方法是基于固相免疫反应，所以生物活性化合物对板的吸附是非常重要的。然而，由于小分子几乎没有结合位点，所以低分子量的抗原/抗体很难通过随机吸附固定在PS表面。PS表面和小分子蛋白的弱相互作用限制了ELISA测定法的灵敏度。通常，在PS表面这种类型的固定要涉及共价偶联步骤，因蛋白质不适当的构象呈递和定向，这是耗时的并且可能改变抗原表位。为了保持它们的构象和生物活性，不同的方法，如生物素链霉抗生素蛋白桥和亲和配体已被用于定向固定化。在这项研究中，我们用一定剂量的60CO 射线辐射了PS微量滴定板，并将这改性的板用于低分子量的HIV1重组抗原（分子量：32kDa）的吸附。我们通过在一个典型的间接ELISA测定系统中检测抗HIV1评估了辐射对PS板的性能效果。此外，吸附/解析实验、AFM和XPS被用来进一步研究蛋白质在PS表面的吸附。试验辐射处理 在3 m3/min 的空气流速下，PS 96孔微量滴定板（Nunc，丹麦）被60CO源（福建农业科学研究院，中国）在剂量率为1 kGy/h下，分别以0、3、6、9、12、15 kGy的水平进行辐射。ELISA研究步骤 在辐射之后，用pH为7.2，10 mL的磷酸缓冲液（PBS）稀释HIV1重组抗原（gp 120gp41，贾大勇博士友情提供），然后以100 uL/孔加入ELISA平板中，在4 C过夜（这个过程通常为包被）。接着，用含0.05%（v/v）的Tween20的PBS溶液洗涤板，并用封闭剂（含2.5 mg/mL BSA的PBS）在37 C下封闭2 h。在板的每个孔中加入100 uL稀释的血清样品（含有抗HIV1抗体的阳性样品，来自全国临床检验中心，中国）。在37 C下经过0.5 h的孵育后将板洗涤，然后加入适宜浓度的辣根过氧化物酶偶联羊抗人IgG（HRPIgG，Sigma，美国），接着再培养0.5 h。各孔再次洗涤以除去任何未结合的轭合物，接着再加四甲基联苯胺（Sigma，美国）培养15 min。加入50 uL的2 mol/L的硫酸终止比色反应，用550酶标仪（BioRad，美国）在450 nm处检测吸光值。所有实验重复4次，以吸光值（OD450nm）的算术平均值计算。解析实验 在每个包被孔中加入100 uL的pH为7,100 mmol/L KNO3溶液，在37 C下剧烈振动孵育2 h。收集该溶液后，解析的HIV1抗原量由溶液中蛋白质浓度来确定。解析实验用99 mmol/L KNO31 mmol/L HNO3溶液（pH值为3）和90 mmol/L KNO310 mmol/L KOH溶液（pH值为12）重复进行。使用微BCA蛋白检测试剂盒（Pierce，美国）测定蛋白质浓度。AFM和XPS 在封闭之前，包被板的孔底可用AFM和XPS测量。AFM用的是接触式Nanoscope a型多模式扫描探针显微镜（数字化仪，美国）。XPS测定是用SSX100分光仪（表面科学仪器，美国）结合单色化的AlK X射线源（能量为1486.6 eV）在150 W条件下运行。结果与讨论免疫测定特性 各种剂量辐射的效果通过ELISA灵敏度进行评估。表1表明吸光度值随着辐射剂量的增加而逐渐增加，最大辐射剂量为9 kGy，更大剂量的辐射会让吸光值降低到一定程度。与未处理组相比，经9 kGy辐射的板在抗HIV1系列稀释液（446倍）中（图1a）或包被浓度的一个宽的范围内（0.11000 ug/mL）（图1b）都表现出25倍更高的检测灵敏度。表1示出使用经9 kGy 辐射过的板ELISA的信噪比（信噪比，阳性样本吸光度的平均值与阴性样本吸光度的平均值的差值除以阴性样本吸光度值得到的百分比）高达25.9，比控制组低3倍浓度的HRPIgG溶液仍然是可检测的。相反，使用未经处理板的 信噪比分析比较差，分别用1:2400和1:800稀释HRPIgG时，只有7.7和6.5。图2表示在9 kGy辐射板上的蛋白质吸附比未经处理的要吸附得更快并更早地达到平衡态。吸附/解析行为 为了确定是主要由于改型表面吸附能力的增加还是由于包被抗原更好的构象呈递提高了ELISA检测的灵敏度，已被包被抗原包被的未处理板和9 kGy辐射板与辣根过氧化物酶标记的兔抗HIV1（兔多克隆抗体，通过将HIV1重组抗原注射到兔子里产生）在一个直接的ELISA系统（这里名为吸附实验）反应。如果ELISA灵敏度的提高主要是由于改性表面吸附能力的增加而不是包被抗原更好的构象呈递，使用辐射板的直接ELISA系统的吸光值应该会增减，因为多克隆抗体无论包被抗原有什么样的构象，都能识别它们。结果发现，吸附实验中所有包被浓度测定（8、40和200 ug/mL），使用9 kGy辐射板的直接ELISA的吸光值比未处理组的大24倍。从这个实验得到的结论和下文的XPS结果一致。抗HIV1ELISA测定系统中的PS表面 通过解析实验评估了包被的稳定性。当包被浓度为40 ug/mL时，吸附在经9 kGy辐射表面的HIV1抗原不能被pH为7的100 mmol/L KNO3溶液或者pH为12的90 mmol/L KNO310 mmol/L KOH混合溶液去除。然而吸附在未经处理表面的HIV1抗原却能在同样条件下被去除11%和29%。在pH为3时，大约6%/48%包被在经辐射过/未辐射过的板上的包被抗原被从PS表面去除。从其它包被浓度实验中获得类似结果。此外，结果发现，抗原在包被过程中通过共存的表面活性剂和盐几乎能不受干扰地吸附在改性表面，甚至加入5%（v/v）Tween20和0.5 mol/L NaCl后也没有观察到明显的免疫反应性损失。这些结果表明，与未处理板相比，抗原优先吸附在辐射过的板上而且在很宽的pH范围内不易解析。表面表征 为了探讨辐射板性能的改进，表面特性通过AFM和XPS进行检测。包被板的表面形貌通过AFM测定，示于图3.HIV1抗原表现为大约宽0.1 um，高0.05 um，平均间距0.15 um的聚合物。相比，改性后的表面，未处理板上的抗原分布是不均匀的，有些区域完全没有。这似乎是未处理板和经9 kGy辐射板的变异系数（CV，见表1）和ELISA检测灵敏度有所差异的主要原因。 在蛋白质吸附前，在PS表面的XPS分析中只检测到碳和氧。未处理板含有1.7%的氧（可能来自添加剂和灭菌处理），在用最佳辐射剂量9 kGy辐射后，含量上升到13.1%，表明其中可能包括羟基、羰基、羧基等含氧基团的发展。因此，在辐射过程中表面氧化因亲水性也有相应的提高 ，所以可能是改性板性能提高的主要原因。在HIV1抗原包被后，固定在PS表面的蛋白质总量能通过XPS检测到的N总量推断出（蛋白质的平均含氮量约为16%）。由图4可看出，在所有包被浓度试验（1.61000 ug/mL）中，在经9 kGy辐射过的板上吸附的蛋白质总量大约比未处理板上吸附的蛋白质总量多1.53倍。这和以上提到的ELISA结果一致，并表明经适当剂量60CO辐射预处理的PS板确实表现出对包被蛋白更好的亲和力。结论 低分子量的HIV1重组抗原能够被经9 kGy（最佳剂量）