电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用.doc

电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用电穿孔技术在转基因及动物克隆中的应用 Application of Electroporation in Gene Transfer and Animal Embryo Cloning 郝新保 范清宇 Hao Xin-bao Fan Qing-yu 第四军医大学全军骨肿瘤研究所 西安 710038 Institute of Orthopedic Oncology, Fourth Military Medical University, Xian 710038, China 摘 要 电穿孔技术利用电场造成细胞膜的改变从而将DNA导入细胞内，同时还可用于细胞融合以及动物克隆等。基因电转移的效率通常比化学法提高1-2个数量级，主要与脉冲波形、长度、缓冲液等有关。方波直流电脉冲应用广泛，在有关细胞核移植的多项研究报告中均指出其重要作用。关键词 基因转移，胚胎克隆，电穿孔 过去十年中，关于基因功能的研究取得了丰硕的成果，并因此带动了基因工程、基因治疗以及单克隆抗体技术的进步，而在动物生殖生物学领域的革命性技术进步则导致了绵羊、牛、猴子和小鼠等多种动物的克隆成功。电穿孔技术和仪器的发展在这些成就中扮演了重要角色，使得人类不但能从胚胎细胞克隆动物，甚至能从完全分化的成熟细胞获得克隆动物。全新的基因操作和生殖技术将为21世纪带来重要的科学成就。电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动物克隆等。 1、 在基因转移和杂交瘤中的应用 1.1 动物和昆虫细胞转染电穿孔技术在80年代初期开始用来将DNA导入多种动物细胞1，较之传统的磷酸钙和脂质体转染，电穿孔具有操作简便、转染效率高等诸多优点，特别是对那些其它方法难以奏效的细胞具有明显优势，但它的影响因素也比较多。电场强度：电压太低时，细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过，而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。对于大多数哺乳动物细胞细胞而言，250-2500V/cm的电压可获得有效转染2,3。电脉冲形状和长度：电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种，大多历时20-100毫秒。缓冲液：通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液，但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高，血清也可以提高转染效率4。其它诸如转染温度，DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。 1.2 大肠杆菌和酵母的转化电穿孔法在80年代末开始被用于转化大肠杆菌5，由于细菌相对较小，因此与DNA导入动物细胞相比，大肠杆菌通常要求4000-20000V/cm的脉冲强度才能获得有效转染。化学法感受态细胞的转染效率最高只能达到每微克DNA 106-108个转化体，而电穿孔法却可以达到109-1010个转化体的水平，较前者提高10-100倍，因此在制备cDNA文库等要求较高转化率的工作中就显得十分关键。 酵母菌电转化克服了乙酸锂和原生质体法烦琐和转化率低的不足，效率明显提高6。 1.3 细胞融合制备杂交瘤 细胞融合主要用于产生杂交瘤细胞7,8。在单克隆抗体的制备过程中，传统用PEG融合法产生杂交瘤细胞，这在现代化生产中存在许多局限性。而电融合法制备杂交瘤可以大规模地批量、高效融合，缩短了整个生产周期。除此以外，在细胞生物学研究中电融合还被广泛应用于其它杂交细胞的制备9。 2、胚胎工程的核移植和活化 在从简单的胚胎干细胞转染到核移植胚胎的电活化中，电穿孔技术都发挥了关键的作用，下面是一些重要的应用。 2.1 单性生殖、四倍体及嵌合体 2.1.1 单性生殖中的电活化 反复的直流方波脉冲可以激活卵母细胞使其发生分裂而产生单倍体胚胎。可以通过细胞松弛素B抑制第二极体或通过电融合来获得二倍体细胞。 2.1.2四倍体胚胎的制备 在胚胎的两细胞阶段应用直流脉冲可以导致细胞融合产生四倍体胚胎。这在小鼠和猪、牛都得到了应用10。 2.1.3 胚胎干细胞嵌合体的制备 通过胚胎干细胞的电转染可以制备嵌合体转基因小鼠。将干细胞注入受体的胚泡，然后将这个胚泡转入代理母亲子宫。出生的后代之间互相杂交产生纯合子可供用于生殖研究。已经制备了如小鼠、猪、兔和鳉的胚胎干细胞嵌合体11。 2.2 电融合在核移植技术中的应用 1938年当Hans Spemann提出核移植的设想时克隆技术已经初露端倪。首次在两栖类动物进行的克隆报道于1952年，但直到1970年青蛙才被克隆成功。核移植是目前多个物种生殖研究的热点技术。 核移植克隆的目的是将被克隆生物的细胞核转移到宿主系统中来指导胚胎的发育并产下新的个体。首先将针插入去核卵母细胞的透明带，把供体细胞注入卵母细胞的卵黄周间隙。细胞融合仪提供的交流电使供体细胞和卵母细胞排列好，随后1到数个直流波使核移植胚胎被激活而发生分裂。分裂产生的胚胎细胞被移植到代理母亲子宫妊娠直到生产。 2.2.1 供体和受体细胞的电融合 电融合首先使细胞膜融合，然后细胞变圆成为一个细胞。影响融合的因素有：细胞排列、融合缓冲液、脉冲参数、电极形状和卵母细胞成熟程度等。 融合过程的第一步是细胞排列。在这个过程中细胞被排成特定的方向使得发生融合的细胞膜与电场方向垂直。这个排列过程可以手工完成也可以用交流电场来控制，后者能够同时操作多个胚胎。 融合缓冲液通常是些较低离子强度的溶液如浓度在0.28-0.3M之间的甘露醇、葡萄糖和蔗糖。10-100mM的Ca2+能增强融合效率12。 脉冲参数包括电场强度、脉冲时间和脉冲次数。在核移植的卵母细胞融合时电场强度通常在600V/cm到3.6kV/cm之间，而脉冲时间多介于30-250ms之间。研究显示不同种类细胞需要的最佳参数各不相同。通常电场强度和脉冲时间呈反比关系，较强的电场可以弥补较短的脉冲时间13。单个脉冲即可使细胞发生融合，有学者认为增加脉冲数能提高融合效率，但有的观点却相反。 对电极的研究还不多，常用的是平行的柱状电极，间隙为0.2-0.5mm. 2.2.2 融合细胞的电刺激活化 细胞活化常用不同时长的直流方波。核移植过程中的电刺激活化对细胞融合必不可少也十分有效。Collas的研究显示成熟的卵母细胞活化效率比较高。活化效率与电场强度和脉冲时间无关，却与脉冲波形有关。非均一的电场能得到较高的活化效率。最佳的电场强度依赖电极间隙。脉冲数以及脉冲之间的间隔增加都可提高活化效率14。 3、供核来源不同的核移植 3.1 以胚胎为基础的核移植 由核移植产生的哺乳动物胚胎克隆涉及8-64个细胞胚胎的其中一个细胞与去核的成熟卵母细胞之间的融合。Ilmense 和Hoppe于1981年首次报道了产生成活个体的核移植15。他们的研究没有被重复出来，但却产生了效率更高的核移植技术16。许多物种成功的核移植实验都使用了电融合技术。 Li Meng和Don Wolf把这一技术应用于灵长类于1997年发表了克隆恒河猴的实验研究结果17。他们的工作为基因治疗提供了有效的动物模型。 3.2 以胚胎和初生动物细胞系为基础的核移植 应用胚胎分裂球作为细胞核供体有许多限制。如何产生合适的胚胎细胞是个瓶颈，而且分离的分裂球难以在体外进行遗传操作，使得克隆之前无法有效地向其转移基因。因此许多学者从事发展基于胚胎或初生动物细胞系的核移植策略。 1996年位于苏格兰的Ian Wilmut研究小组报告他们利用细胞系获得转基因绵羊的结果18。用于核移植的细胞系来自于胚胎，已经在体外培养了6-13代，在移植之前用血清饥饿法诱导其停止生长。1997年利用转染人IX因子基因的绵羊羊胎纤维母细胞获得的核移植绵羊克隆获得成功19。 Cibelli, Stice and Robl首次报告了使用永生化的胎牛纤维母细胞作为细胞核供体获得的克隆转基因奶牛。他们的工作首次证明活跃分裂的细胞在进行细胞核移植以后可以继续发育20。 3.3 以分化成熟细胞为基础的核移植 应用细胞系的核移植研究为分化成熟细胞的克隆扫除了障碍。Ian Wilmut于1997年报告了第一只来自分化成熟细胞的动物克隆-绵羊多利21，这一成果震动了整个世界。为多利提供细胞核的是一只成年绵羊的乳腺上皮细胞，同样应用了血清饥饿诱导法处理细胞。 此后不断有应用体细胞作为细胞核供体获得克隆动物的报告22-24，证明了多利的技术路线确实是可行的。 4、电穿孔设备的性能 早期电穿孔设备的波形和时间都是固定的，使用不便且效果差。20年来的发展使得设备本身和附件的技术水平都有了很大提高。 4.1脉冲形状早期的指数衰减式脉冲一直沿用至今，保留在低端产品的设计上，主要用于基因转染。新开发的方波脉冲产品成为目前市场上的主流，在众多品牌中方波脉冲的纯度和重现性并不完全一致，应选择那些专业厂家的产品。有的产品用一系列高频脉冲代替方波，其导入基因和细胞融合的效率还有待于进一步证实。除了直流脉冲以外，有些用于细胞融合的设备还可以产生非正弦交流波使细胞按电场方向排列，可比单纯直流脉冲获得更高的融合效率。 4.2