实验2 对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱法分析(边清泉).doc

实验二 对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱法分析一 目的要求1.学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量；2.熟悉高效液相色谱分析操作。二 基本原理高效液相色谱法（HPLC）是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它的基本概念与理论基础，如保留值、塔板理论、速率理论、容量因子、分离度等，与气相色谱法是一致的，但又有不同之处。高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点。（1） 流动相的不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；（2） 由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小45个数量级；（3） 由于流动相的化学成分可进行广泛的选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗提的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率（柱效能）；（4） 高效液相色谱采用510m细颗粒固定相，使流动相在色谱柱上渗透性大大减少，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；（5） 高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如：紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。与气相色谱相比较，高效液相色谱同样具有高灵敏、高效能和高速度的特点，但它的应用范围更加广泛。据估计在自然界数百万种有机化合物中，仅有20%可以不经过化学预处理，直接采用气相色谱法分析，而对于总数的75%80%，则可采用高效液相色谱进行分离分析，特别是许多高沸点、难挥发、热稳定性差的物质。如生物化学制剂、金属有机络合物等物质的分离分析，尤须借助于高效液相色谱方法。目前高效液相色谱已得到愈来愈广泛的应用。根据固定相的类型和分离机制，高效液相色谱可分为：液-固吸附色谱，液-液分配色谱，离子交换色谱和凝胶渗透色谱等几大类。高效液相色谱的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中，采用保留值定性，或与其他定性能力强的仪器分析法联用，如与质谱法、红外吸收光谱法等联用。在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分试样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，他们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。由于在一定得实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在各种条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类各组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知，且组分简单的混合物。本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式与气相色谱分析相同：%ci=(fiAi/nfi.Ai)100 对羟基苯甲酸酯类混合物属于同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相同的校正因子，故上试可简化为： %ci=(Ai/ni=1.Ai)100三 仪器高效液相色谱（HPLC）系统四 试剂1.对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇等均为分析纯。2.纯水去离子水，再经过一次蒸馏3.标准溶液的配置（1） 标准贮备液 分别于四只100mL容量瓶中，配制浓度均为1000 g.mL-1的上述四种酯类化合物的甲醇溶液。（2） 标准使用液 用上述四种标准贮备液分别于四只10mL容量瓶中，配制浓度均为10g.mL-1的酯类化合物的甲醇溶液，摇均备用。（3）标准混合使用液 于一只10mL容量瓶中，用上述四种标准溶液贮备液，配制浓度均含10 g.mL-1的酯类混合物的甲醇溶液，摇均备用。五 实验条件1.色谱柱 长15cm、内径3mm，装填C-18烷基键合相颗粒度为5m的固定相2.流动相 甲醇：水（55:45），3.流速 1mL.min-14.检测器 DAD检测器，254 nm，灵敏度0.04六 实验步骤1.将配制好的流动相甲醇水溶液置于超声波发生器上脱气15min。2.根据实验条件，将仪器按照仪器操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，图谱基线呈平直，即可进样。3.依次分别吸取5L的四种标准适用溶液及标准混合使用液个未知试样液进样，记录各色谱图，并重复两次。在每次进样后，于进样信号附近标明进样溶液名称。七 数据及处理1.记录实验条件2.测量四种对羟基苯甲酸酯化合物色谱图的保留时间，并