（植物学专业论文）白杄花粉管微丝骨架介导信号传导的蛋白质组学研究.pdf

摘要 在高等植物有性生殖过程中 花粉管作为运输精子到胚珠的载体 它的生 长具有高度极性化 并且要依赖于微丝 由于花粉管本身所具的特性 它已经成 为研究细胞相互识别 胞内和胞外信号的模式系统 本文为了研究微丝在白杆 p i c e am e y e r ir e h d e tw i l s 花粉管生长中的作用 我们应用不同浓度的微丝 聚合抑制剂l a t r u n c u l i nb l a t b 处理花粉管 并通过激光共聚焦显微镜观察微 丝聚合状态的动态变化 结果发现 在低浓度下的l a t b 能使花粉管中的微丝严 重解聚 且抑制其顶端生长 我们进一步利用蛋白质组学的手段 分析了白杆花粉管微丝解聚后蛋白质 的表达图谱 通过双向电泳分离出5 0 0 个左右考马斯亮兰染色的蛋白质斑点 经 过软件分析发现 其中大部分蛋白质的表达量未发生变化 而只有l l o 个蛋白斑 点有较大变化 将这些蛋白斑点从胶上切下酶解后用于质谱鉴定 最终鉴定出 3 5 个蛋白 其中有1 8 个为上调蛋白 1 7 个下调蛋白 根据其主要功能 通常可 分为碳水化合物代谢 胁迫反应 信号和细胞扩展等几类 我们发现由于微丝解 聚引起的能量代谢水平降低 可能与依赖于信号传导的微丝重组过程相关 此外 当l a t b 浓度增加到5 0n m 时 与细胞壁多糖合成相关的两个蛋白 如r e v e r s i b l y g l y c o s y l a t e dp o l y p e p t i d e 和t y p ei l i am e m b r a n ep r o t e i nc p w a p l 3 几乎不表达 这说 明当微丝聚合完全被抑制后 依赖于微丝的分泌系统也受到影响 从而引起相应 蛋白质变化 最终导致细胞壁成分合成的减少 细胞骨架蛋白a c t i n 的下调 进 一步说明微丝在花粉管生长过程中起着提供或支持的一种机制 也就是能调节信 号介导的花粉管生长 并使其在特定的时期到达特定的部位 从而完成植物的受 精作用 关键词 白杆 花粉管 微丝 顶端生长 蛋白质组学 质谱 a b s t r a c t y a n m e ic h e n d i r e c t e db yp r o f j i n x i n gl i n p o l l e nt u b ea sac a r r i e rt od e l i v e rt h es p e r mt ot h eo v u l ed u r i n gt h ep r o c e s so f s e x u a lp l a n tr e p r o d u c t i o ni nh i g h e rp l a n t s p o l l e nt u b eg r o w t hi sh i g h l yp o l a r i z e da n d a c t i n c y t o s k e l e t o nd e p e n d e n t m o r e o v e rp o l l e n t u b eh a sb e c o m ear e l a t i v e l y w e l l c h a r a c t e r i z e dm o d e ls y s t e mi nw h i c ht os t u d yc e l l c e l lr e c o g n i t i o n i n t r a a n d i n t e r c e l l u l a rs i g n a l i n gi nh i g h e rp l a n t s t oi n v e s t i g a t er o l e so ft h ea c t i nc y t o s k e l e t o n i nt h e g r o w t ho fp o l l e n t u b eo fp i c e am e y e r ir e h d e tw i l s w eu s e da c t i n p o l y m e r i z a t i o n i n h i b i t o rl a t r u n c u l i nb l a t b u n d e rq u a n t i t a t i v e l yc o n t r o l l e d c o n d i t i o n st op e r t u r bt h ea c t i nc y t o s k e l e t o na n do b s e r v a t i o nw i t hl a s e rs c a n n i n g c o n f o c a lm i c r o s c o p e a tl o wc o n c e n t r a t i o n s l a t bd e p o l y m e r i z e da c t i nc y t o s k e l e t o n i nt h eg r o w i n gp o l l e nt u b ea n dt h i sr a p i d l yi n h i b i t e dt h e i rt i pg r o w t h p r o t e o m i c a p p r o a c hw a su s e dt oa n a l y s ep r o t e i ne x p r e s s i o np r o f i l ec h a n g e sd u r i n gt h ep o l l e n t u b e d e v e l o p m e n t w i t hd i s t u r b e d o r g a n i z a t i o n o ft h ea c t i n c y t o s k e l e t o n t w o d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i sd i s p l a y e dn e a r l y 5 0 0c o o m a s s i eb r i l l i a n t b l u e s t a i n e d p r o t e i ns p o t s a t o t a lo f110 p r o t e i ns p o t s w e r e r e p r o d u c i b l y d i f f e r e n t i a l l yd i s p l a y e da f t e r2 8h o u r so fl a t bt r e a t m e n t a n d 3 5 d i f f e r e n t i a l l y d i s p l a y e dp r o t e i n sw e r e i d e n t i f i e db ym a s ss p e c t r o m e t r y a m o n gt h ei d e n t i f i e d p r o t e i n s i nc a s eo f18p r o t e i ns p o t sa r eu p r e g u l a t e du p o nt ol a t bt r e a t m e n tw h i l e17 s p o t s a r ed o w n r e g u l a t e d t h e s ep r o t e i n sw e r eg r o u p e di n t od i s t i n c tf u n c t i o n a l c a t e g o r i e si n c l u d i n gp r o t e i n si n v o l v e di nc a r b o h y d r a t em e t a b o l i s m s t r e s s r e s p o n s e s i g n a l i n ga n dc e l le x p a n s i o n s o m e o ft h e ma r er e l e v a n tf o rt h ee n e r g ym e t a b o l i s mi n t h ec e l lw h i c hi sl i n k e dt ot h es i g n a l d e p e n d e n ta c t i nr e o r g a n i z a t i o n i na d d i t i o n t w o p r o t e i n s r e v e r s i b l yg l y c o s y l a t e dp o l y p e p t i d e 一1 a n dt y p ei l i am e m b r a n ep r o t e i n e p w a p 13 i d e n t i f i e di nt h i ss t u d yd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya n da l m o s td i s a p p e a r e d w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fl a t bi n c r e a s e dt o5 0n m t h e s et w op r o t e i n sf u n c t i o ni n c e l lw a l l p o l y s a c c h a r i d eb i o s y n t h e s i s w h i c hi n d i c a t e t h a tt h ea c t i nd i s r u p t i o n i n t e r f e r e sw i t hs e c r e t o r ys y s t e ma n dd e p o s i t i o no fc e l lw a l lc o m p o n e n t s f i n a l l y t h e d o w nr e g u l a t i o no fa c t i nf u r t h e rr e v e a l e dt h a tt h ea c t i nc y t o s k e l e t o nm a yf u n c t i o ni n p o l l e nt u b eg r o w t hb yp r o v i d i n g o rs u p p o r t i n g am e c h a n i s mt h a tr e g u l a t e sas i g n a l m e d i a t e de l o n g a t i o nt oa l l o wt h ep o l l e nt u b et oa t t a i ni t sf i n a ld e s t i n a t i o ni np a r t i c u l a r t i m ed u r i n gt r a n s p o r to fs p e r mc e l l s k e y w o r d s p i c e am e y e r i p o l l e nt u b e a c t i nc y t o s k e l e t o n t i pg r o w t h p r o t e o m i c s m a s ss p e c t r o m e t r y 白杆 p i c e am e y e r i 花粉管微丝骨架介导信号传导 的蛋白质组学研究 一 莉罱 j 在高等植物的有性生殖过程中 花粉作为雄性生殖单位的载体 在其发育 和成熟中均含有大量孢子原浆基因的表达产物 它们分别来自于花药壁绒毡层 以及生殖核和营养核基因的表达 当成熟花粉落在适合的柱头上 在花粉中储藏 的r n a 蛋白质和具有生物活性的小分子会促使其迅速萌发和花粉管的生长 随后花粉管穿入柱头和花柱 到达胚囊 这时花粉管顶端破裂 并将两个精子及 其内容物释放到胚囊中 其中一个精子细胞与卵融合 而另一个与两个极核融合 这就是高等植物实现双受精的重要前提 通常 花粉管的生长和受精作用均是在 严格的基因和细胞调控下完成的 因此 研究上述过程的机理是植物生殖生物学 中一个重要的课题 同益受到人们的关注 花粉管的生长仅限于顶端伸长 也即极性生长 该过程的高度极性化与微 丝骨架系统有着密切的关系 t a y l o r a n dh e p l e r 1 9 9 7 微丝作为细胞骨架的重要 组成成分之一 在花粉萌发和花粉管生长中执行着多种功能 其中包括维持和建 立细胞极性 参与细胞质流动与细胞器的运动 以及对各种环境刺激作出反应等 除此之外 在自交不亲和反应中 微丝也是钙信号破坏过程中的一个目标 大多 数这些信号都传达到第二信使 并与离子和活性氧一起参与到花粉管顶端生长过 程中 这些第二信使会与a c t i n 连接蛋白相互作用 从而影响微丝骨架的动态变 化 反之 微丝骨架的动态变化也会影响与极性生长相关的其他过程 f r a n k l i n t o n g 19 9 6 近年来 关于花粉发育的研究大多集中在细胞和基因水平 而在蛋白质组 水平上的报道较少 由于与微丝骨架相关的大量蛋白都参与调控花粉发育的信号 通路中 p e n d l e t o ne la 1 2 0 0 3 为此有必要应用蛋白质组技术来构建调节花粉 管顶端生长与微丝骨架动态相关的信号网络 i i 花粉管顶端结构特征 柑稍物界q 顶端 一k 足 种较为背遍的m 长 式 如托i j i 蔺丝体的牛长 藻类台于萌发的顶端生长 植物根尖和花粉管的顶端 l 长 其 j 于花粉管h 有 独特的细胞结构 它不仅对研究细胞器的组成及信号传导也有着重要意义 而月 还可作为研究细胞生k 分子调控机理的一个模式体系 以便深入研究细胞的极悱 生长 细胞问相互作用以及信号传导等 以往关于花粉管研究的撤道 大部分都 集中仵被子植物方丽 而对裸子植物则研究较少 圈1 花粉管项端仄域结杜j 示意瑚 f r a n k l i n t o n g1 9 9 9 f i g u r ei d i a g r a m m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h es f t l c t l l f e o f t b e l i dr e g i o no f ap o l l e n t u b e 一个典型花粉管的基本结构如图l 所示 f r a n k l i n t o n g 1 9 9 9 将其简单 的概括为 在花粉管中胼胝质塞将细胞质与花粉管的其余部分分隔丌 细胞质都 集中在花粉管的顶端生长区 在花粉管的生长过程中 肼胝质后面的区域液泡化 因此无论花粉管生长多长 细胞质仍然集中在花粉管的前端 同时生殖核和营养 核 以及其它细胞器 如线粒体 高尔基体 内质网和细胞骨架等也位于这个区 域 现以百合花粉管为例 其极顶端是透明区 高度富集分泌小泡 后面为亚顶 端区 富含内质网 线粒体和赢尔基体 这是细胞壁物质前体和细胞质蛋白合成 活跃的区域 再其后是核区 为生殖核和营养核或精细胞的所在场所 朱微和徐 是雌 2 0 0 2 日d 对于花粉管摄顶端透明区的认识 以及组成成分的动忐变化 等均小甚了解 并还存在一些争议 而对花粉管壁的研究则报道鞍多 其 p 包 括花粉钎壁通常由外蹙和内壁组成 外壁主要由聚胶质 半纤维索和纤维嚣封1 成 内世f 要m 肼胝质组成 但在花粉管顶端区无肼胍质内屡 f r a n k l i n i b n g 1 9 9 9 柯的研究表明 粜胶质是确墒尔耩体内聚合和酯台后 再由分泌小池远输到 壮1 最后果胶质去酯化后与c a 2 相互结合 从而形成为花粉管生长提供支持的峰硬结 构 f r a n k l i n t o n ge ta 1 1 9 9 6 分泌小泡携带果胶质和其他细胞壁成分 倚赖于 胞质流产生的动力运输到花粉管顶端 并形成一个圆锥形的区域 h e l p l e re la 1 2 0 0 1 由此可见 花粉管的生长不同于其它植物细胞的生长 即它主要集中在 顶端相对较小的区域以一种特殊的方式生长 目前有关花粉管研究的报道多数都集中在被子植物中 而对于裸子植物的 研究较少 由于裸子植物在进化上较被子植物原始 因此表现在花粉管的结构上 两者具有许多不同特点 例如被子植物花粉管细胞质呈倒喷泉式流动 r e v e r s e f o u n t a i n 1 i k e 即细胞质从花粉管两侧流向顶端 然后再从中央向后返回 t a y l o r a n dh e p l e r 1 9 9 7 而裸子植物花粉管的细胞质则呈喷泉式流动 即细胞质从中 央流向花粉管顶端 而后再沿细胞骨架返回 d ew i ne ta 1 1 9 9 6 另外 裸子植 物花粉管顶端区不含有倒圆锥式的分泌小泡 而由一个大小为2 0 一3 0 岬 并富 含内质网和内膜系统的透明区域所组成 d ew i ne la 1 1 9 9 6 l a z z a r o 1 9 9 6 1 2 花粉和花粉管内微管骨架的分布 在花粉管中微管 m t 主要位于临近质膜的外周胞质 以及整个花粉管的 胞质中 并平行于长轴排列 而在尖端缺乏 微管蛋白一般在花粉水合及花粉萌 发时才组装成m t 孙大业等 2 0 0 1 认为 m t 对胞质流动及花粉管生长没有 影响 但在营养细胞中m t 形成一个峰硬的支持物 可能有助于在其上构建微丝 网络 根据百合花粉萌发期问骨架的变化发现 肌动蛋白丝在萌发时起主要作用 微管排列可以稳定由肌动蛋白排列所构建的细胞极性 另外 文献报道在花粉管 中发现的微管马达蛋白 k i n e s i n 可能在细胞器与m t 间的动力学联系方面起作 用 因此m t 的主要功能可能是控制花粉管的细胞质组织 不过这一活性分子的 基础尚不清楚 t i w a r i 和p o l i t o 1 9 9 0 a 在刚萌发的洋梨花粉内观察到 微管首先聚集在萌 发孔部位 并朝向币在突出花粉萌发孔的花粉管部位汇集 而汇集在花粉管部位 的微管比存在花粉粒其它部位的短粗 t i w a r i 和p o l i t o 还认为 微管的汇集方向 可能是受到微丝的影响而排列的 换言之 他们认为当花粉管延伸时 微丝所起 的作用比微管大 但到底两者的作用如何区分 则有待于进一步的研究 当花粉 管延伸出萌发孔并继续伸长 在延伸的花粉管内可以看到许多与花粉管长轴平行 排列的微管 这些微管主要集中分布在靠近花粉管的肼胝质壁之下的周侧胞质 内 从电镜下可以看到这些微管都是以单个存在 很少形成粗束 至于为什么微 管都与花粉管长轴向平行排列的原因还不清楚 但这很可能是受到胞质在花粉管 内流动方向地影响 也可能是受微丝分布地影响 因为在许多情况下 可以看到 微管和微丝都是在同一方向平行的和重叠的分布排列在花粉管内 当微管延伸至 花粉管顶端时 微管消失 从而显示微管在顶端部位解聚 至于这些解聚的微管 又如何重新聚合起来形成微管则不清楚 还有待于进一步研究 p i e r s o ne ta 1 1 9 8 9 a s t r o m 等 1 9 9 1 应用低温 4 处理花粉管时 发现在花粉管内的微 管大多数消失 及解聚 但在近萌发孔和花粉管顶端部位的微管则较能抗低温 尤其是在靠近膜层和核部位的微管 其抗低温能力则更强 由此显示微管与膜层 的连接对微管增强抗低温能力有所帮助 此外 他们还发现经低温处理的花粉管 内 微丝的分布并未受到影响 而微管消失 营养核和生殖细胞核均停止移动 特 别是在一些新形成的花粉管内 在生长时间较长的花粉管内 徼管并未受到很 大的影响 生殖细胞也继续移动 由上可见 营养核和生殖细胞在花粉管内的移 动与微管有一定关系 a s t r o m 1 9 9 2 用单克隆抗体进一步显示 存在花粉管内 的微管大多数属于酩氨酸化的微管蛋白 并显示花粉管内的微管是比较不稳定和 具动态的 1 3 花粉和花粉管内微丝骨架的分布 唐肖晶等 1 9 8 9 a 用免疫印迹法证明 烟草花粉管提取物中存在肌动蛋白 并用罗丹明鬼笔环肽 r h o d a m i n e p h a l l o i d i n 染色 观察到花粉管中微丝沿着花 粉管长度分布 唐肖晶等 1 9 8 9 b 还用肌球蛋白重链的单克隆抗体 对烟草花 粉管中的肌球蛋白进行免疫化学鉴定 结果证明烟草花粉中存在有分子量为1 7 5 k d 的重链 用免疫荧光显微镜观察表明 整个花粉管中存在无数荧光斑点 这 些斑点被认为是花粉管中的囊泡或细胞器 马永泽与阎隆飞 1 9 8 9 对玉米花粉 肌动蛋白与兔骨骼肌肌动蛋白的生物化学进行了比较研究 结果表明这基本上相 同 它们都具有相同的分子量 4 2k d 花粉肌动蛋白可与兔抗鸡胃肌动蛋白 4 抗血清产生免疫沉淀反应 同时它们的羧基术端氨基酸的序列相同 都是l y s c y s p h e c o o h 它们的圆二色谱基本相同 并由此计算得到的二级结构也基 本一致 周嫦等 1 9 9 0 用f i t c 鬼笔环肽作为荧光显微探针 观察到玉米花粉 水合后微丝呈不规则网状 萌发前转变为极性排列 由与萌发孔相对一极向萌发 孔极辐射 并汇集到萌发孔 当唐菖蒲 g l a d i o l u sg a n d a v e n s i s 花粉原生质刚 分离后就有不规则的微丝细网出现 培养1 7 小时后 原生质体萌发出花粉管 此时原生质体中微丝呈极性分布 并向花粉管汇集 花粉管中微丝呈纵行排列 周 嫦等 l9 9 0 朱徵等 1 9 9 1 用非固定的荧光探针研究了紫萼玉簪 h o s t a c a e r u l e a 花粉管中肌动蛋白微丝的形式 结果发现未萌发花粉粒中有结晶状的 梭状体 此为肌动蛋白的一种储藏形式 在花粉萌发时这种梭状体转移到花粉管 中 并逐渐分解 分支并形成肌动蛋白丝形成与花粉管长轴平行的细丝占优势的 网络系统 肌动蛋白丝一直分布到花粉管的末端 徐是雄 1 9 9 2 应用激光共聚 焦显微镜 观察了百合 l i l i u mh o l l a n d i u m 杂交种花粉原生质体中肌动蛋白微 丝的分布状况 在将近成熟的花粉原生质体中 肌动蛋白的网络系统是由粗微丝 束组成 而在刚成熟的花粉原生质体中则由较为细而稠密的微丝束组成 在原生 质体内的生殖细胞中还另有一个微丝网络 如果将花粉原生质体放在适于花粉萌 发的b k 培养基内培养 则原生质体会逐渐液泡化 数小时后 大液泡把原生质 体内的胞质分隔开 形成许多胞质纤维束 在这些胞质中微丝的分布除集中在生 殖细胞及营养核周围形成一个紧密网络外 还在胞质纤维束内形成许多粗微丝 束 同时在微丝束的一端常与膜层紧密连接 显示微丝与细胞膜的联系十分密切 1 9 9 2 年 刘雄与阎隆飞改进了肌动蛋白的纯化方法 他们先将玉米花粉制成 丙酮粉 然后进行硫酸铵分级沉淀 d e a e 纤维素层析 聚合解聚及s e p h a c r y l s 2 0 0 凝胶过滤 最后纯化肌动蛋白的得率可达1 9 m g 1 0 0 m g 花粉 通过免疫印 迹法鉴定花粉肌动蛋白与兔肌肌动蛋白完全相同 花粉肌动蛋白的氨基酸组成也 与兔肌肌动蛋白极为相似 由阎隆飞等 1 9 9 2 所纯化的玉米g 一肌动蛋白具有 很高的生物学活性 在o 1m o l lk c 及1 0m m o l lm g c l 2 中聚合成肌动蛋白丝 当g 一肌动蛋白聚合成f 一肌动蛋白时 粘度明显升高 其比粘度与肌动蛋白浓 度呈线性关系 花粉肌动蛋白可激活肌球蛋白a t p 酶活性7 倍 玉米花粉g 肌 动蛋白与f 一肌动蛋白的紫外光谱与兔的光谱非常相似 在透射电镜下观察到微 丝的直径为7n n l 并具有螺旋状结构 如用h m m 修饰花粉f 一肌动蛋白 可形 成箭火状修饰 1 4 微丝的装配动态 如图2 所示 微丝是由肌动蛋白亚单位组成的螺旋状纤维 每隔3 7 n m 拧成 一圈 每个肌动蛋白分子 g a c t i n 呈近球形 并都具有极性 当装配成纤维时 它们头尾相接 所以整个微丝也具有极性 微丝的装配必需在一定赫浓度 主要 是m g 下进行 一定的g a c t i n 则装配成纤维状肌动蛋白 f a c t i n 通常微 丝的组装可分成两个阶段 即种子形成 成核 阶段和延长阶段 在种子形成过 程需要一定时间 这个时间称为延迟时间 g a c t i n 在这段时间内丌始聚合 最 初形成的二聚体不稳定 易于解聚 只有解聚成三聚体时才稳定 即种子形成 一旦种子形成 g a c t i n 便立即迅速地在种子两端聚合 其中聚合快的一端为 f 极 另一端为负极 此时便进入了延长阶段 如图2 汪垫仁等 1 9 9 8 在微丝组装过程中 a t p 的作用主要表现在延长阶段 通常由一个g a c t i n 分子与一个a t p 分子结合 结合a t p 的a c t i n 一一a d p a c t i n 对纤维末端的亲和 性高 当a t p a c t i n 结合到末端后 使a c t i n 构象改变 然后a t p 水解为a d p p i 而a d p a c t i n 对纤维末端的亲和性低 容易从未端脱落 使纤维缩短 a t p a c t i n 浓度与其聚合速度呈j 下比 当a t p a c t i n 处在高浓度时 a t p a c t i n 在未端聚合的 速度快 由于a t p 水解为a d p p i 在稍后发生 从而在纤维未端形成一连串的 a t p a c t i n 由此被称为a t p 帽 a t p c a p 而在近纤维中部的为a d p a c t i n 当 a t p a c t i n 不断耗竭后使其浓度下降时 a t p a c t i n 在末端的聚合速度也就下降 如果a t p 水解为a d p p i 的速度不变 结果会使a t p 帽不断缩小而消失 最终 将暴露出a d p a c t i n 由于a d p a c t i n 对术端的亲和性小 结果a d p a c t i n 不断从 末端解聚脱落 使纤维缩短 因此 在a c t i n 溶液中 其f a c t i n 是由带a t pc a p 和失去a t pc a p 的两类纤维组成 即一些纤维在延长 而另一些则缩短 a d p a c t i n 从f a c t i n 解聚脱落后 其a d p 可被a t p 置换重新形成a t p a c t i n 参加聚合 一 些缩短的纤维在其术端可重新形成a t pc a p 和继续延长 因此 就每一根纤维来 说 其长度并非固定不变 它们不是延长便是缩短 呈动力学不稳定状态 6 e 固 m 龠亍 图2 肌动蛋白及微丝的极性 引臼a l b e n s 1 9 9 4 a 和b 肌动蚩闩的土掌形分子结构 a t p 结台他点竹r 分子内部 f a c f t n 聚合成微蛙后a t p 即水解成a d p 依扶循环 c 丰 d 在微丝中所有单体的极性指向同一方向 故微丝也贝有极性 f i g u r e2 a c l i na n d t h ep o l a r i l ye r a c t i n f i l a m e n t a l b er t s 9 9 4 aa n dba c t i n i s8g l o b u l a r p r o t e i n w i t ha na t pb i n d i n gs i t e i n t h ec e n t e ro f t h e m o l e c u l ea t p i s h y d r o l y z e di m m e d i a t e l ya f t e rt h em o l e c u l ei si n c o r p o r a t e di n t oa na c t i nf i l a m e n t t h e na ne x c h a n g ec a l lo c c u r ca n ddt h ep o l a r i t yo fa c t i nf i l a m e n t 掘此 9 8 4 年 c a r e e r 等人提出的 动力不稳定模型 d y n a m i ci n s t a b i l i t y m o d e l 学说来解释微丝迅速重组具有一定的合理性 试验证明 a c l i n 聚台的速 度与萁浓度呈l 眦l 而在一端a c t i n 的解聚则4 i 依赖于a c t i n 的浓度 它是处卜 个恒定速度解聚脱落 当纤维延长时 出于a c t i n 单体的消耗 其浓度逐渐f l 碍 当降至一定水平时 有嘲纤维延长长度 聚合速度 称此叫的a c t i n 单体浓度为 临界浓度c c 试螗证叫纤维两端的c c 是不同的 负端c c 犬于一端 但阿端挪 在延长 反之 则两端便解聚而缩短 只有当a c t i n 介于两端c c 之问的一定浓度 时 其i l 一端延k 长度等于负端缩短长度 其纤维长度不变 根掘f a c t i n 的极 及喇端c c 的不同 有人曾提出了f a e t i n 的特殊平衡状态理论模型一一踏车模型 t r e a d m i l l i n g m o d e l 在一定的a c t i n 浓度下 f a c t i n 币端聚合速度与负端解聚 速度相同 使f a c t i n 处于平衡状态 其纤维长度不变 新聚合上的a c t i n 单体不 断从正端向负端作踏车式移动 如图3 踏车行为所需能量 则由a t p 水解提 供 若以与a t p 结构相似的化合物代替a t p 这种化合物结合的a c t i n 单体虽可 在j 下端聚合 但出于它不能水解 聚合上的a e t i n 单体不能移动 于是便不能发 生踏车行为 这说明蹒4 二行为需要山a t p 水解提供能量 汪堑仁等 1 9 9 8 图3 f a c t i n 聚台成微丝的动态平衡理论一一蹄中摊1 1 微丝一段减少的讴基由兄 i 啪加 的弧蜒求补充平衔 微 聚合艟 e 端由亚鉴的浓度严格调控 引白a l b e r l s 1 9 9 4 f i g u r e3 l r e a d m i l l i n gm o d e l ad y n a m i cb e h a v i o ro fa c t i nf i l a m e n l si n w h i c ht h el o s so f s u b u n i l s f r o mo n ce n do f t h e f i l a m e n l i sb a l a n c e db y t h e i ra d d i t i o n i o i h eo t h e re n di i i sacr i t i c a l c o n c e n l r a t i o na 1w h i c hp o l y m e r i z a t i o n s o c c i j a l b e r t s1 9 9 4 1 5 微丝骨架介导的信号传导 植物细胞不仅反应胞外或胞内的刺激 而且还伴随着快速 活跃的胞质重 排 这一系列的细胞动态变化与细胞骨架 如微管网络 微丝骨架及其连接蛋白 等密不可分 越来越多的证据表明 在大多数细胞反应过程中 信号传导通路都 与细胞骨架相关 尤其是微丝系统 不仅是一个结构成分 同时也参与建立和保 持细胞极性 并为反应各种环境刺激提供细胞器的运动轨道 f r a n k l i n t o n g 1 9 9 9 下面将概述细胞骨架介导的几种信号刺激通路 以及与信号中介相关的 蛋白及其功能等 1 5 1a c t i n 连接蛋白 在生物有机体中 现已发现至少有7 0 种a c t i n 连接蛋白 k r e i s 和v a l e 1 9 9 9 它们的主要功能是控制g a c t i n 库的大小和活性 微丝成核现象 n u c l e m i o n 亚细胞位点 微丝翻转速率和微丝聚合 单体连接蛋白 例如p r o f i l i n a d f c o f i l i n a d e n y l a t ec y c l a s e a s s o c i a t e dp r o t e i na n dt h y m o s i n 1 34 用于调节聚合亚基的数量 并保持g a c t i n 的组装特性 成帽因子 如c p c a p ga n dg e l s o l i n 通过控制微丝 末端亚基来调控微丝的组装和去组装 成核因子是通过增加a c t i n 聚合的 种子 从而克服了微丝聚合的限速步骤 如a r p 2 3c o m p l e xa n df o r m i n g h o m o l o g y p r o t e i n s 动态因子 e g a d f c o f i l i n 通过增加微丝尖端亚基的脱落 以加速其翻 转 上述几类因子大多已在植物中发现 它们的分子和生化功能也已经有所了解 d er u i j t e r e m o n s 1 9 9 9 m c c u r d ye la 1 2 0 0 1 s t a i g e r h u s s e y 2 0 0 3 有趣 的是 在植物中尚未发现t h y m o s i nb4 w a s p q a c t i n i n f i l a m i na n ds p e c t r i n l i k e p r o t e i n s a c t i n 连接蛋白在胞外信号和骨架重组之间起作用 f r a n k l i n t o n g 1 9 9 9 n i c k 19 9 9 s t a i g e r 2 0 0 0 w a s t e n e y s g a l w a y 2 0 0 3 这类蛋白大多是p t d l n s 4 5 p 2 b i n d i n gp r o t e i n s 或c a 调节的蛋白 n i g g l i 2 0 0 1 还有研究表明 部 分a c t i n 连接蛋白可作为刺激反应之间的中介子 即把外界信号以第二信使的方 式传导到微丝 从而影响肌动蛋白的组装或动态变化 f r a n k l i n t o n g 1 9 9 6 然 而胞外刺激和微丝重组之问的信号通路 尚未见在花粉或其它植物细胞中有报 道 研究表明 大多数a c t i n 连接蛋白能够与磷酸肌醇相互作用 尽管磷脂酰肌 9 醇只是植物细胞膜磷脂的重要组成成分之一 但过去2 0 多年的研究表明 在植 物细胞中磷脂酰肌醇头部几个位置能够被磷酸化 即形成磷酸肌醇 d r o b a k 1 9 9 2 m u n n i ke ta 1 1 9 9 8 d r o b a ke ta 1 1 9 9 9 所有磷酸肌醇在真核细胞中都广泛存在 d r o b a ke ta 1 1 9 9 9 到目前为止 在植物中已发现有下列几类磷酸肌醇 p t d l n s 3 p p t d l n s 4 p p t d l n s 5 p p t d l n s 3 4 p 2 p t d l n s 3 5 p 2 a n dp t d l n s 4 5 p 2 这些磷酸肌醇几乎大多数都参与细胞信号事件 d r o b a ke la 1 1 9 9 9 m u n n i ke la 1 1 9 9 8 在动物细胞中 三磷酸肌醇参与膜相关的信号传导 同样 多聚磷酸肌 醇在植物细胞中也参与大量信号传导 但目前为止研究多聚磷酸肌醇在细胞中的 成分很少 不过它们与结构磷脂相比 其转换速率却相当高 另外 多聚磷酸肌 醇还可提供第二信使前体和蛋白质合成的前体 d r o b a ke la 1 19 9 8 m u n n i ke la 1 1 9 9 4 有关在植物细胞中多聚磷酸肌醇的分布状况 目前尚不清楚 故有待于 进一步的研究 1 5 2 微丝骨架作为信号传导中的目标和中介 微丝骨架是信号网络中的一个目标 也可作为信号传导子 在下面几节将 简述有关微丝参与花粉管自交不亲和反应中的研究进展 不过有必要说明的是 尽管微丝在花粉自交不亲和反应中起很重要的作用 但在不同种之间差别较大 例如罂粟属与芸苔和烟草中 可从它们的进化方面研究其差异 近期的研究主要 集中在微丝感应各种刺激如重力和冷胁迫 1 微丝调节花粉管生长 高等植物的生殖控制是一个重要的过程 其中包括花粉管和柱头间相互作 用的严格调控 花粉管落在柱头后水合 萌发并输送精子到胚囊 以启动受精 花粉管的极性生长高度依赖于微丝骨架 目前研究已经肯定了微丝对花粉萌发和 花粉管生长中的作用 在这个过程中将涉及到几种骨架成分 以及与其相关的其 他成分 目前 大多数研究都将生长中的花粉管 根据不同f a c t i n 排列分为三 个主要区域 m i l l e re la 1 1 9 9 6 k o s te ta 1 1 9 9 8 g i b b o ne la 1 1 9 9 9 g e i t m a n ne t a 1 2 0 0 0 f ue ta 1 2 0 0 1 f u 等 2 0 0 1 认为 在花粉管顶端无大量f a c t i n 的 区域 称 无a c t i n 区 其实在顶端仍有高度动念的f a c t i n 所以也有称之为 短 l o a c t i n 束区 s h o r ta c t i nb u n d l e s 也即s a b 亚顶端区域存在一个密集的f a c t i n 网络以环状 呈领口形或篮子形排列 通过表达g f p t a l i n 的花粉管表明 这两 个区域含有高度动态的肌动蛋白 并随着花粉管的生长而有节奏的振荡 在这个 区域后面是更加稳定的微丝束充满花粉管的细胞质中 微丝束通常沿花粉管呈纵 向或螺旋状排列 几种药理学的研究表明 在花粉管中不同数量的f a c t i n 可能 是分离或相互重叠而发生作用 f a c t i n 为依赖于肌球蛋白细胞器运输提供一个 结构框架 也可作为一个 轨道 允许胞质流输送分泌小泡到生长的花粉管顶 端 同时在花粉管顶端区的s a bf a c t i n 对其顶端生长起着重要的作用 h e p l e r e a 1 2 0 0 1 还有肌动蛋白的聚合状态 在该过程中也具有很重要的意义 g i b b o n e fa 1 1 9 9 9 f ue ta 1 2 0 0 1 v i d a l ie ta 1 2 0 0 1 当花粉管的顶端生长被低浓度a c t i n 聚合抑制药物抑制后 胞质流并未受太大影响 g i b b o ne la 1 19 9 9 v i d a l ie la 1 2 0 0 1 通过对花粉管中f a c t i n 直接定量表明 花粉管生长需要动态的肌动蛋白 聚合 即使是该过程的轻微打乱 最终也会导致顶端生长受到严重抑制 g i b b o n e f 口 1 9 9 9 2 小g 蛋白在花粉管中对肌动蛋白聚合的意义 关于微丝与控制花粉管顶端生长之问的信号作用 可从分析r h o 小g 蛋白 在花粉管中的意义得出证据 在动物细胞中高度保守的r h o 小g 蛋白作为分子 转换器 调节微丝聚合与微丝相关的细胞反应 通过过去几年大量研究工作的积 累表明 植物中r h o 类似的小g 蛋白 r o p s 在调节花粉管顶端生长中是一个 重要的分子转化器 由于r h o 类似的小g 蛋白参与其它真核细胞中微丝的聚合 和重组 因而可以合理的推测r o p 在花粉管中也有类似的作用 g ue la 1 2 0 0 3 花粉特异的r o p 定位是在花粉管质膜的顶端区 并在控制花粉管顶端极性 生长信号事件中起着重要的作用 l i ne t a l 1 9 9 6 杨振彪等 2 0 0 0 认为 r o p 的定位可形成一个活动的反馈环 r o p g a p s 是r o p 的负调节子 w u e ta 1 2 0 0 0 2 0 0 1 它在生长的花粉管中表达了g f p t a l i n 可结合f a e t i n 的动态微丝骨架 另外一种r h o 类似的小g 蛋白 可调节微丝的聚合和花粉管的顶端生长 k o s te l 口 1 9 9 8 r o p 和r a c 的过量表达可诱导细胞生长去极性和微丝错乱组装 l ie t 口 1 9 9 8 k o s te la 1 1 9 9 9 而r a c 也可调节花粉管中微丝束的组装 k o s te la 1 1 9 9 9 通过使用活细胞图像研究表明 花粉管顶端区域s a b 的形成和动态依赖 于并且被r o p 信号调节 f ue la 1 2 0 0 2 g ue la 1 2 0 0 3 由上表明 r h o 小g 蛋 白和依赖于f a c t i n 极性生长之间有相互联系 同时 r a c r o p 和a c t i n 连接蛋白 a d f c o f i l i n 之间也具相互作用 c h e ne ta 1 2 0 0 3 从有关数据显示 r a c r o p 可 调节a d f 的磷酸化作用 因而在调节烟草花粉中a d f 活性和肌动蛋白动念变化 中具有重要意义 c h e ne ta 1 2 0 0 2 c h e u n ge la 1 2 0 0 3 花粉管中r o p 小g 蛋白 和信号组分有相互作用 并且都涉及到微丝这条信号通路 在这些信号组分可作 为r o p a c t i n 之间的中介子 k o s t 等 1 9 9 9 认为 单磷酸肌醇激酶可作为r a c r h o 潜在的效应子 能与r a c 相互作用 另外还有几种特异的单磷酸肌醇激酶与细胞 骨架相关 x u e t a l 1 9 9 2 d o v e e t a l 1 9 9 4 单磷酸肌醇产物二磷酸肌醇 可说 明花粉管中r h o 类似的小g 蛋白与肌醇信号传导之间有相互联系 三磷酸肌醇 参于花粉管中钙的释放 并可调节花粉管的生长 f r a n k l i n t o n ge la 1 1 9 9 6 第 二信使与r o p 相互作用 其最有力的证据是与钙离子有关 当前的假说认为 r o p 可调节花粉管顶端钙离子流 因而调节顶端聚合的钙离子梯度 l ie ta 1 1 9 9 9 z