植物组织培养的理论基础.doc

11.1 植物组织培养的理论基础（重点在概念）植物细胞工程的概念(Definition of plant cell engineering)：植物细胞工程是植物生物技术的一个重要组成部分，是在离体培养条件下，在细胞水平上对植物材料进行遗传操作的技术，即对植物体的任何一个部分（器官、组织、细胞、原生质体）进行离体诱导使其称为完整植株的技术。细胞全能性的一般概念：每个细胞都含有个体的全部遗传信息，都有分化成一个完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱: 营养生长中心 形成层 薄壁细胞 厚壁细胞(木质化细胞) 特化细胞(筛管、导管细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为： 顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生组织 薄壁组织(基本组织) 厚角组织 输导组织 厚壁组织。所谓细胞分化，是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。分化细胞在一定条件下，可以转变为胚性状态，重新获得分裂能力，称为脱分化。外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。愈伤组织的种类:胚性愈伤组织 （Embryonenic callus）和非胚性愈伤组织：细胞的再分化（redifferentiation)是脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在一定条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株。由愈伤组织再分化形成再生植株，可经过器官发生和胚状体发生两条途径。通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式： 第一种方式是先芽后根； 第二种方式为先根后芽； 第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。一般认为，芽和茎原基通常起源于培养组织中比较表层的细胞，即外起源，而根原基则发生在组织较深处，是内起源。 影响器官分化的因素1.外植体- 位置、状态及组织类型2.生长调节剂3.光照4.温度培养细胞变异的类型1、自发产生的变异，2、诱发产生的变异，影响离体培养细胞遗传变异的因子1、供体植株 倍性水平、基因型、外植体细胞的分化程度2、培养基及培养方式 培养基的成分、物理状态及培养类型原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养的变异，而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异3、继代培养的次数一般来讲，继代时间越长、继代次数越多，细胞变异的几率就越大。优良变异的筛选方法（1）直接筛选法(2)间接筛选法体细胞无性系变异的利用1创造育种中间材料或直接筛选新品种2遗传研究3发育生物学研究4生化代谢途径研究变异的抑制1、利用比较稳定的品种材料。 2、利用茎尖、幼胚等再生能力较强的组织进行培养。 3、 避开使用高浓度激素。 4、不经过愈伤组织，而直接从脱分化细胞再生。 5、尽量促使植株早再生，使培养时间缩短。11.2植物组织培养（重点在无菌操作）简述植物离体培养中无菌操作过程。1、实验器具和材料的准备2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。4、用7075的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。5、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。7、收拾台面。n 分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件n 比例高时产生芽,比例低时产生根11.2.4 种质保存超低温保存技术1、保存材料的选择 2、（冷冻前材料）预处理 （3、添加冷冻防护剂 ）4、冷冻处理（快速冷冻、慢速冷冻、预冷冻、干燥冷冻） 5、材料保存6、保存材料解冻（快速解冻、慢速解冻）7、保存材料复苏培养（再处理）11.2.5 细胞培养（重点在细胞培养方法、细胞同步化方法、植物细胞培养的特性及悬浮细胞系的建立）植物细胞培养（plant cell culture）是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术由完整的植物器官分离单细胞，叶片是分离单细胞的最好材料。机械法、酶解法（用果胶酶）由培养组织分离单细胞：(1) 诱导产生愈伤组织；(2) 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性：（3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物细胞悬浮培养的概念： 悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，均一性好，细胞生长迅速。 悬浮细胞的同步化：细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期常用的处理方法：1、物理方法：1）分选法，通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。2）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度2、化学方法：1）饥饿法，悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。2）抑制剂法，通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。3）有丝分裂阻抑，用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜。在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期。细胞平板培养概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。 植板率()(形成的细胞团数/接种的细胞数)100看护培养概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。微室培养概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。特点：（1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程（2）培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂饲养层培养基技术将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到一个饲养作用。植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。植物次生代谢产物生产的理想途径是规模化细胞培养，优点是可以保护生态环境、提高生产效率和发展新型生物技术产业。 培养系统: 1、悬浮培养系统 2、固定化培养系统植物细胞规模培养技术关键 1、细胞系的建立与选择； 2、优良细胞系的增殖培养； 3、大规模培养体系的建立 植物细胞培养的特性1植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；2培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；3细胞生长的中期及对数期易凝聚为直径达350JJm一400Pm的团块，悬浮培养较难；4培养时需供氧，培养液粘度大：5具有群体效应；6 因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；7细胞培养过程具有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；8 悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（2500050000个/ML）。n 细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：n 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐b、聚丙烯酰胺等；n 附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。三.植物细胞规模培养技术要点n 1.细胞系的建立和选择2.优良细胞系的增殖培养3.大规模培养体系的建立n 一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。n 两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。n 如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。n 植物细胞生长与产物合成的关系生长偶联型 产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等； 中间型 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型； 非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。 12 植物的快速繁殖（重点在概念、快繁体系的建立及脱毒的方法与原理）离体无性繁殖(propagation in vitro) ：利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传形状一致的个体的方法。也称之为微繁(micropropagation)、快速繁殖（rapid clone progagation）。植物脱毒（virus elimination）：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染的病毒，生产健康的繁殖材料。体细胞胚或胚状体：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。繁殖系数（breeding coefficient）：也叫增殖率，指每块外植体在一个培养周期内增殖的倍数快速繁殖意义（1）繁殖速度快，经济效益高（2）占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗，（3）保持植物种性（4）繁殖各种珍稀、濒危、名贵、突变物种。离体无性繁殖程序：（1）无菌培养物建立（2）培养物的增殖（3）生根培养（4）炼苗和移栽（5）再生植株的鉴定无菌培养物的建立程序包括：外植体的选择外植体灭菌接种培养等基本过程。培养物的增殖：腋芽增殖；不定芽增殖；胚状体增殖; 愈伤组织增殖；原球茎增殖腋芽增殖其特点是：培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。这一繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。 不定芽增殖特点：繁殖系数高，遗传稳定性较好。但继代次数有限。培养物继代一定次数以后，不定芽形成能力即减弱，需要重新建立起始无菌培养物。此外，不定芽需要进行生根培养才能形成真正的植株。 诱导不定芽一般需要同时加入外源生长素和细胞分裂素，二者的配比一般是细胞分裂素要略高于生长素，其二者的总体使用浓度应尽可能的低，以免产生过多的愈伤组织。以保证繁殖品种的遗传稳定性。胚状体增殖特点：增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外(人工种子)，这一途径还没有用于快繁技术愈伤组织增殖其特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，移栽要抓三个关键：水分的平衡（不要失水过多）温度和光照（不能太高）光合能力逐步形成或加强提高移栽成活率的技术措施移栽前的工作a、培养瓶生壮苗b、炼苗：将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为1030D。移栽时应注意的问题a、防止菌类滋生：苗底部培养基要洗干净；杀菌剂处理苗的根部 ；定时用杀菌剂处理种植基质b、保持小苗水分供给平衡：在移栽后5-7d内，应给予较高的空气湿度条件（90%），使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当57d后，发现小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。c、移栽时选择合理的种植基质：基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭、锯木屑等。d、注意一定光照，温度条件应用领域（1）珍稀植物资源和育种原始材料，如工程植株、果树芽变分离（2）经济效益高，但难于繁殖的植物，如名贵花卉（3）用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等。（4）用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。（5）繁殖销量大，但用常规的方法难以满足数量上需要的植物，如草皮。当前脱除植物病毒的方法有：茎尖培养脱毒法；热处理脱毒法；微体嫁接离体培养脱毒法；珠心组织培养法；愈伤组织脱毒（一）、茎尖脱毒1、茎尖脱毒的依据。病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点约（0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。2、茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键（1）、被脱毒植物携带病毒的诊断及其在体内的分布（2）.母体植株的选择和预处理：材料的品种典型性；植体健康程度选择；高温预处理（3）、茎尖的剥离（4）. 脱毒效果检测(5).脱毒苗的保存与繁殖(二)热处理脱毒法1、原理热处理不能杀死病毒，能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去浸染能力；热处理可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差异，选择适当的温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。（三）微体嫁接离体培养脱毒法（四）珠心组织培养法珠心组织与维管系统没有直接联系，而病毒一般认为是通过维管组织传播的，因此珠心组织培养可获得无病毒植株（五）愈伤组织脱毒通过愈伤组织培养获得再生无病毒植株的原因有以下几种可能：（1）病毒在植物体内不同器官或同一器官不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。（2）有些愈伤组织细胞病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂的过程中，病毒的复制能力衰退或丢失（3）愈伤组织产生抗性变异细胞。13 花药和花粉培养（重点在概念及花粉与花药培养的差异）花药培养(anther culture) 概念把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株的过程.n 花药和花粉培养：在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。2、花药培养的基本程序是：外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养-移栽（1）外植体的选择基因型的选择：应选择那些容易培养成功的材料来做。 供试材料的生理状态： 在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导频率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低。 花粉的发育时期：单核花粉 双核花粉为最适期(2)花药预处理A低温预处理n 低温预处理的作用机理，学者们提出以下几点：n 1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。 n 2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。 n 3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。 n 无论哪种机理正确，但结果是预处理能促进花粉启动，提高诱导率和再生率。 B热处理C、离心预处理D乙烯利预处理E甘露醇预处理：可能是由于这种处理方式使小孢子处于碳饥饿状态，导致花粉从正常发育途径转向雄核发育途径。(3)外植体的消毒（4）接种（5）培养基及培养条件用的基本培养基：H 、C17、MS（Murashigc & Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976)。 附加成分：蔗糖, 植物生长调节物质培养条件温度和光照：不同植物对温度的要求不同， 光照：先弱后强 （6）移栽（7）花粉植株的倍性及染色体加倍技术花粉植株的倍性鉴定，最可靠的方法是对茎尖或根尖细胞进行染色体记数。 染色体人工加倍最有效的方法是用一定浓度的秋水仙碱处理单倍体植株的生长点或分蘖节。3影响花药培养的因素基因型发育时期植株的生理状态预处理培养基和培养条件花药的接种密度（密度效应）培养的方法与方式：固体培养、液体培养（Ficoll）、双层培养、分步培养、条件培4、花药培养中单倍体形成的途径A、通过胚状体形成单倍体植株 B、通过愈伤组织形成植株 高浓度生长素产生愈伤组织，低浓度利于胚状体的诱导。 通过愈伤易产生混倍体5、花药培养的意义a、缩短育种年限 常规育种，杂种F2代开始分离，继续自交，通过不断选择和淘汰，一般需到F5F6代能得到纯合后代。 用花药、花粉（n）培养，得到单倍体植株，染色体加倍后，获得纯合二倍体（2n）。这样，从杂交到获得纯合株系，只需二个世代。因此，可缩短育种年限34个世代。b、提高选择效率F1花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型，进而发育成花粉。用花粉培养获得单倍体再生植株（n），配子基因型在再生植物体中完全表达，即再生植物基因型是多种多样的，为育种选择提供了广泛的变异类型。并且隐性基因可以得到充分表达。单倍体植物经染色体加倍可获得二倍体植物。因此，花药、花粉培养与常规育种相结合，可以大大提高育种选择效率。 6、现阶段花药培养存在的问题诱导频率低。频率最高的烟草也只有30%，低的只有百分之几，千分之几体细胞（花丝、药壁、药隔）干扰问题倍性变异药壁毡绒层细胞对花粉发育的作用，如何用合成培养基代替毡绒层的作用，还不十分清楚，目前培养基成分带有一定的盲目性。白化苗问题花粉培养(pollen culture) 概念:也叫小孢子培养(microspore culture),是从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离的状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.优点（与花药培养比）：a、花药培养容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生植株会出现不同倍性的个体，而分离的花粉培养可以克服这一不足。b、能更好调节控制核发育的各种因子，而且可以直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程，为研究雄核的生理生化等问题提供方便。c、原则上将，从花粉培养能得到更多的花粉植株。n 花粉培养与花药培养两者的异同点n 培养目的相同，均获得小孢子植株。n 花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。n 花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。2花粉培养的一般方法 预处理或预培养花粉粒的游离分离花粉粒，应达到以下标准a：成活率较高，发育齐整 b：达到一定的数量 c:无菌，无杂质常用的分离方法有：A是自然散粉法B机械分离花粉粒 培养方法 3、影响花粉培养的几个关键A、在培养前分离的花粉应多次洗涤，否则其生长和形态发生将受影响，不洗涤的花粉不能生长或只能形成愈伤组织B、冷处理已广泛用来提高花粉雄核发育的频率C、培养基中增加蔗糖和肌醇的浓度能明显提高雄核发育的频率。14 植物胚胎培养（重点在幼胚培养的生长方式）n 胚胎培养是指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。n 根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养。n 胚珠和子房培养由于取材的时期不同，又包括： 受精以后的胚珠子房培养 未受精胚珠和子房胚胎培养的意义和类型A 克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物 B 打破种子休眠，缩短育种年限。主要有以下两种：（1）使种胚发育不全的植物获得后代。例如天麻、兰花种子成熟时，胚只有6-7个细胞，利用离体培养可以打破休眠提早萌发。（2）使含抑制性物质不发芽的种胚发芽。苹果属离体胚培养48h即可萌发，而用种子则要9个月C、使生活力低下或无生活力的种子萌发D、使柑橘类植物合子胚正常发育E、获三倍体或单倍体植株F、快速繁殖特殊植物(椰子，山楂）G、用于基础研究研究胚胎发育过程、胚胎发生的条件以及影响因素，胚乳生长发育及形态建成过程。1、胚培养的概念与类型 概念：在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法 （1）成熟胚培养 成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。（2）幼胚培养 幼胚是指子叶期以前的幼小胚，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，因此，其研究和应用越来越深入和广泛。幼胚培养的关键技术：取材 取材时期 大多数幼胚培养成功的实例证明，适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷形胚。（原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体）以幼胚抢救为目的的胚培养取材，必须在胚退化衰败之前。 幼胚剥离 胚剥离的成功与否是幼胚培养成功与否的关键。幼胚是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，一定要注意保湿，且操作要迅速。 培养条件的控制（是否需要特殊处理）剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。在培养之前必须对所培养的对象在自然发育条件下的特性充分了解，比如胚的休眠问题、是否需要春化作用、胚萌发的温度等。 （2）幼胚离体培养的生长发育方式胚性发育(embryonal development) 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。早熟萌发(early mature sprouting) 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发（未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象叫早熟萌发）。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。愈伤组织(callus) 在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。 （3）离体幼胚培养的影响因素培养基胚的成熟程度不同，所用培养基的类型也不同。成熟胚的培养基有：Tukey、White等。未成熟胚有：Rijven、Nitch、MS等。培养基的渗透压对幼胚培养至关重要，渗透压的调节主要依赖糖。常用的是蔗糖，不同发育时期的胚要求蔗糖的浓度不同，胚龄越小糖浓度要求越高。确定适宜蔗糖浓度的方法是在接种前将幼胚剥出后放入若干浓度的蔗糖溶液中，观察质壁分离现象，以确定等渗溶液的浓度。附加物环境条件：对于幼胚培养，初期弱光和黑暗更适宜，幼胚启动发育后给予和其自然光周期一致的光照条件有利于幼胚发育。 培养的温度一般以该植物种子萌发的适宜温度为好。培养材料：植物培养材料的基因型和胚发育程度对离体胚培养有重要影响。显然，材料基因型不同，胚培养的难易程度也不同。胚发育阶段以越幼嫩的胚越难以培养。子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。n 授粉前子房培养是为了获得孤雌生殖的单倍体植株，适用于那些胚囊分离特别困难的植物；n 授粉后子房培养适用于那些获得种子特别困难，胚分离不易操作的植物，以获得种子或果实或植株。1材料的选择： （1）品种间的差异；（2）胚囊发育时期：以八核胚囊和成熟胚囊期的子房培养具有较高的诱导频率。诱导培养阶段蔗糖浓度要高一些，分化培养时蔗糖浓度要低一些。3.接种方式主要考虑两个方面的问题：极性；营养吸收花柄直插比平放效果好影响胚乳培养的因素（1）胚乳的发育时期： 胚乳发育时期大致可分为早期、旺盛生长期和成熟期。旺盛生长期为最佳时期，这时的胚乳细胞处于细胞形成期并保持旺盛的分裂能力。 几种植物胚乳培养的最佳时间(授粉后天数（2）基因型（3）培养条件：常用培养基是MS和White，需要附加水解酪蛋白和酵母提取物。在诱导期一般需要高浓度的生长素、较高的pH，分化期需要较高浓度的细胞分裂素。（4）胚因子：胚对胚乳的培养有一定的影响4胚乳培养的形态发生n 愈伤组织形成 最适发育时期的胚乳在离体培养条件下经过一定时间即可形成愈伤组织。n 直接进行器官分化污染的含义：（重点污染的途径及污染的预防）指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。污染途径：（1）外植体带菌（2）培养基及接种器具灭菌不彻底（3）接种操作时带入（4）环境不清洁污染的预防措施：A、 防止外植体带菌（1） 选择好外植体采集时期和采集部位 外植体采集以春秋为宜； 优先选择地上部分作为外植体； 阴雨天勿采，晴天下午采集； 采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。（2）室内或无菌条件下进行预培养。（3）外植体严格灭菌 灭菌效果实验 多次灭菌和交替灭菌 B、保证培养基及接种器具彻底灭菌1 分装时，注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口2 检查封口膜是否破损3 扎瓶口要位置适当，松紧适宜4 保证灭菌时间和高压锅内温度5 接种工具用前彻底灭菌6 工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌C、操作人员严格遵守无菌操作规程D、 保证接种与培养环境清洁（1） 污染瓶经高压灭菌后再清洗（2）接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭氧灭菌机消毒（3）定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实验；接种前1520min打开风机，风速调整到2030m/min，并对台面用75%酒精喷雾消毒（4）定期对培养室消毒，防止高温人工种子的概念（重点在概念、包埋的方式及人工种皮的要求）狭义 的概念是指植物离体培养中产生的胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。广义 而言，人工种子是在胚状体或一块组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体目前研制的人工种子的结构：体细胞胚、人工种皮、人工胚乳人工种子制备的技术要点一繁殖体的处理 体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用ABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长期贮存。 微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表面及多余的水分，同时要进行表面消毒处理以防止包被后的感染。为了延长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当的休眠处理。 芽为繁殖体的类型，则不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。 二繁殖体的包埋1、包埋介质的要求： 首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。 同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽的需要。 此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。 2、常用的人工胚乳液配方有两种： MS（或SH、White）培养基加入1.5%的马铃薯淀粉水解物； SH（0.5）培养基加入1.5%的麦芽糖。 3、包埋的方法主要有液胶包埋法、干燥包埋法 和水凝胶法 等。液胶包埋法是将胚状体或小植株悬浮在一种黏滞流体胶中直接播入土壤的方法。干燥包埋法是将体细胞胚经干燥后再用聚氧乙烯等聚合物进行包埋的方法。水凝胶法是指用通过离子交换或温度突变形成的凝胶包裹材料进行包埋的方法。4、以海藻酸钠作包埋剂的操作程序是： 在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀。（添加糖、防腐剂、抗生素、农药等，防止病虫害侵染。） 将其逐滴滴入2.0%-2.5%的CaCl2溶液中，经2030min.的离子交换作用即形成含有繁殖体具有一定刚性的人工种子， 用无菌水漂洗20min.以终止反应。 海藻酸钠易失水干缩，为克服此弱点，采用二重结构，即在胶囊中包埋培养液、保水剂，使体胚悬浮于培养基中，为防止发芽时杂菌感染，添加抗菌剂等。 三人工种皮的装配理想的人工种皮应该是： 具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失，同时又具有良好的透气性。 具有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作。 无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。 配制简单易行，成本低。 人工种子还在继续研究中，目前还不能大面积用于生产，因为还存在着难题：体细胞胚诱导及其可能发生变异；人工种皮还存在缺陷；贮藏、发芽技术尚待解决；人工种子工厂化生产配套设施、及种子成本过高等。这些问题一旦解决，人工种子的应用将会展现广阔前景。第16章 植物原生质体融合技术（重点在原生质体的概念、原生质体的制备中的影响因子及原生质体融合的常用方法及原理）1、Protoplast 原生质体l A cell from which the entire cell wall has been removed l Isolated protoplasts have been described as naked cells because the cell wall has been removed by either a mechanical or an enzymatic process. In the isolated protoplast the outer plasma membrane is fully exposed. 2、protoplast culture： Protoplasts isolated from a variety of species can be placed in the appropriate medium and growth conditions. The protoplast can be induced to regenerate a cell wall and grow into a callus from which plantlets generate 3、Reasons for protoplast culture（1）Protoplasts can be induced to fuse to produce a hybrid plant, which cannot be produced by conventional plant breeding due to incompatibility（不亲和）（2） Isolated protoplast are capable of ingesting 摄取foreign material into the cytoplasm. This material includes the introduction of nuclei, chloroplast, mitochondrion DNA, plasmids, bacteria and viruses3）Protoplast can be used to study wall synthesis and deposition 沉积（4）Protoplasts can be studied as single cell systems16.1 Protoplast Isolation16.1.1 Method for plant protoplast isolation. （1）Mechanical isolation of protoplasts（2）Enzymatical preparation of protoplasts16.1.2 影响原生质体产量和活力的因子1、材料的来源：无菌试管苗叶片、上胚轴和子叶；温室或生长室栽种的植物；培养细胞2、前处理：A、材料用黑暗处理、低温处理和不同光质照射；B、消毒；C、保证酶解充分进行，促使酶溶液渗入到叶片的细胞间隙中。3、酶处理l 分离植物细胞原生质体所必须的两种酶是纤维素酶和果胶酶，后者的作用主要是细胞间的果胶质降解，前者是消化细胞壁纤维素。l 对于某些组织来说,除了纤维素酶和果胶酶外可能还需要半纤维素酶.比如:大麦的糊粉细胞以纤维素酶处理以后并不能把原生质体释放出来,这是因为在原生质体周围还留下一层抗纤维素酶的壁,这类细胞称做原生质球,只有用半纤维素酶处理才能把它们剩余的壁除掉.酶处理的效果：酶浓度：植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。酶解时间酶解温度：酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在4050但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25左右进行酶解。酶液pH值：4.7-5.8；纤维素酶，p H5.4，果胶酶5.8，两种混合5.45.64、渗透压渗透剂：常用的两种系统为l 糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.400.80mmolL。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；l 盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。l 另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。5、细胞质膜稳定剂 细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细胞分裂等。 常用质膜稳定剂有：葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid， 2-( N-吗啉)乙烷磺酸 作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调节pH值。16.1.3 Purification of the isolated protoplasts l 酶解后的混合物包括：解离酶液中，有原生质体，有破碎细胞的细胞器等，也有未解离的组织或细胞。而培养只要干净的原生质体。所以要进行纯化。l 净化的方法：A、清除较大碎屑：酶解后的混合物穿过一个镍丝网（50-70um）（过滤法）B、清除较小的物质：1.沉降法2.漂浮法3.界面法影响原生质体活力的因素l 分离材料的生理状态l 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压l 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间l 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响16.1.4 原生质体的培养一、原生质体的培养基二、培养条件三、原生质体培养方法五、原生质体的发育与植株再生l 细胞壁再生 l 细胞分裂与生长l 愈伤组织形成与分化 l 植株再生16.2体细胞杂交l 体细胞杂交是指两个离体细胞通过一定诱导技术使质膜接触而融合在一起随后导致两个细胞核物质融合的技术。l 理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源,这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义.A.融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,为远缘物种间的遗传物质交换提供有效途径;B.体细胞杂交产生的杂种,细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分裂和增殖过程中，双亲的叶绿体、线粒体、DNA、亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。l 根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类：l 对称融合（asymmetric fusion）即两个完整的细胞原生质体融合。l 非对称融合（symmetric fusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，它可以分为几种：1