第八章 非线性色谱原理及其在蛋白质分离与纯化中的应用.ppt

第八章非线性色谱原理及其在蛋白分离与纯化中的应用 第一节概述 色谱法起源于20世纪初 1906年俄国植物学家米哈伊尔 茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管 以石油醚洗脱植物色素的提取液 经过一段时间洗脱之后 植物色素在碳酸钙柱中实现分离 由一条色带分散为数条平行的色带 由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带 因此茨维特将这种方法命名为 这个单词最终被英语等拼音语言接受 成为色谱法的名称 汉语中的色谱也是对这个单词的意译 1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的想法 他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相 用氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸 气相色谱的出现使色谱技术从最初的定性分离手段进一步演化为具有分离功能的定量测定手段 并且极大的刺激了色谱技术和理论的发展 相比于早期的液相色谱 以气体为流动相的色谱对设备的要求更高 这促进了色谱技术的机械化 标准化和自动化 气相色谱需要特殊和更灵敏的检测装置 这促进了检测器的开发 而气相色谱的标准化又使得色谱学理论得以形成色谱学理论中有着重要地位的塔板理论和VanDeemter方程 以及保留时间 保留指数 峰宽等概念都是在研究气相色谱行为的过程中形成的 60年代 为了分离蛋白质 核酸等不易汽化的大分子物质 气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱 60年代末科克兰 哈伯 荷瓦斯 莆黑斯 里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪 开启了高效液相色谱的时代 高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱 提高色谱柱的塔板数 以高压驱动流动相 使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成 1971年科克兰等人出版了 液相色谱的现代实践 一书 标志着高效液相色谱法 HPLC 正式建立 在此后的时间里 高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段 在有机化学 生物化学 医学 药物开发与检测 化工 食品科学 环境监测 商检和法检等方面都有广泛的应用 高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料 检测技术 数据处理技术以及色谱理论的发展 一 色谱法的基本特点 1 分离效率高2 应用范围广3 操作参数多4 高灵敏度在线检测5 快速分离6 连续自动化操作 1 分离效率高每米可达十几万个理论塔板 几个厘米的色谱柱就可以分离多组分的蛋白质混合物 2 应用范围广从极性到非极性 离子型到非离子型 小分子到大分子 无极到有机及生活物资 以及其它热稳定或热不稳定的化合物 可以说无所不包 尤其是对生物样品的分离分析 是其他方法无法代替的 3 操作参数多流动相可以是气体 液体或超临界流体 各种流体中又有不同的物质可选用 固定相可用液 固两大类 每类中又有许多种可供选择 4 高灵敏度在线检测与其他分离手段相比 色谱具有高灵敏度在线检测的特性 有各种不同的检测器 适合于多种千差万别的样品需要 5 快速分离HPLC由于采用了高压溶剂传输系统 即使采用高效细颗粒填料 也能保证分离过程在一定的线速下进行 而且由于柱效提高 更加快了分离速度 6 连续自动化操作电脑用于色谱分离过程以后 从最初的简单数据处理发展到目前作为控制操作的中心 使大量的样品可以按事先设置的程序进行完全自动连续的操作 二 线性色谱与非线性色谱 线性和非线性是数学函数的概念 表示自变量与应变量之间的关系 在色谱学中 如果流动相中样品浓度Cm与固定相中样品的浓度Cs之间呈线性关系 那么在这种情况下的色谱分配过程就是线性色谱 即 Cs KCmK为分配系数 Cm流动相中样品的浓度 Cs固定相中样品的浓度 规律如果Cs和Cm之间不存在线性关系 而是出现其他的函数关系 那么对应的色谱分离过程就称为非线性色谱 在实践过程中得知 当样品浓度很低时 Cs和Cm之间往往保持线性关系 在高浓度时Cs和Cm之间往往不出现线性关系 非线性和线性色谱行为的根本不同表现在以下几个方面 1 样品的保留值可变 2 峰形不对称 3 色谱峰的峰高与浓度不是线性关系 第二节非线性色谱理论基础 非线性色谱理论是研究样品在固定相与流动相中的浓度处于非线性关系的状态下 各种实验参数对色谱分离过程的影响 建立起柱参数 溶质性质及操作条件之间的定量关系式 由于此时Cs与Cm不呈线性关系 所以必须首先了解他们之间的函数关系 也既要研究吸附等温线及相应的吸附模型 一 吸附过程及吸附等温线 吸附指一种通常发生在两相界面上的现象 处于界面上的分子或原子与其内部的分子或原子具有不同的能量与性质 产生了一种不平衡的倾向 造成界面的分子或原子数与内部不同 这种差异就形成了吸附现象 吸附过程主要分为两大类 化学吸附和物理吸附化学吸附热大 吸附过程往往是不可逆的 而物理吸附热小 吸附往往是可逆的 物理吸附与化学吸附 产生物理吸附的作用力是分子间力 即范德华力 产生化学吸附的作用力是化学键力 化学吸附时可发生电子的转移 原子的重排 化学键的断裂与形成等微观过程 物理吸附和化学吸附往往可以同时发生 如O2在W上的吸附 在不同的温度下 起主导作用的吸附可以发生变化 物理吸附与化学吸附的比较 吸附等温线是指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时他们在两相中浓度之间的关系 在HPLC领域内常遇到的吸附等温线可分为以下几类 即凸形 凹形 S形 H形和阶梯形 吸附等温线大致可归纳为五种类型 只有 a 符合单分子层吸附 其余皆为多分子层吸附 凸形吸附等温线是液固系统中常见的一种 通常出现于大多数小分子化合物 它反映了溶质分子在固体表面达到饱和时生成了单分子吸附层 H形等温线是凸形等温线的特殊状态 它代表了一类很容易在固体表面吸附的物质 而且很容易达到饱和态 这类吸附主要是一些分子量大的聚合物 如聚乙烯 聚苯乙烯等高聚物及酶 核酸 蛋白质 糖等生物大分子 凹形吸附等温线是适用于在低浓度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子 从而生成多分子吸附层的那些物质 S形等温线实际上是凹形和凸形两种等温线叠加的产物 它代表了被吸附的分子之间具有很强的作用力 能进一步吸附其它分子 而溶质分子与固体表面的作用力相对较弱 或者与表面覆盖率无关 图8 分布等温线类型及对色谱峰形和保留时间的影响 吸附等温线信息 1 可以预测代表了该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状 2 为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件 3 反映被分离物质分子与固定相表面的作用 从而研究分子的构型与吸附状态 4 建立分子结构 吸附之间的定量关系 从而由分子结构预测吸附性能 吸附等温线的测定 吸附等温线的测定可以分为静态法与动态法两大类 1 静态法 较简单 是一种经典的方法 是将被测物质溶解在溶剂中配成一定浓度的溶液 再放入一定量的固相吸附剂 等体系达到平衡后 根据溶液浓度的减少 C 溶液体积 V 和吸附剂量 G 就可以计算溶质在吸附剂上的浓度 q q C V G配制一系列溶液浓度 可以得到一系列q值 将q与其相平衡的C做图 即可得到该溶质在液固系统中的吸附等温线 2 动态法 动态法最早是用气相色谱原理来测定气固或气液两相中的吸附等温线的 常用的有4种方式 前沿分析 FA 特征点前沿分析 FACP 特征点洗脱 ECP 平台洗脱 EP 前沿分析法 frontalanalysis FA 是由James和Philips 1964年首先提出并将其用于单组分等温线的测定 FA实验过程是在色谱柱入口处每隔一定时间连续压入大量浓度不断递增的待测样品 在FA中 对每一个浓度的样品 进样量要足够大 以保证其洗脱曲线中与进样浓度呈线性关系出现浓度平台 由于FA在测定单组分等温线时仅需要洗脱前沿出现时的保留时间和与其浓度相对应的平台高度 可以克服由低浓度数据点产生的误差所造成的整个等温线偏离的缺陷 二 非线性色谱基本理论 非线性色谱理论是通过研究被分离物质在两相中呈高浓度情况下的浓度变化与吸附等温线 传质速率 进样方式等因素的关系 建立起定量的函数形式 从而能预测最佳分离条件 得到满意的分离结果 1 吸附平衡热力学当被分离的物质在色谱系统中达到热力学平衡时 它在液相与固相中的浓度关系可用吸附平衡方程式表示 2 吸附平衡动力学色谱分离过程实际上是一个由不平衡到平衡 周而复始的连续过程 平衡的速率由下式可以表达为 第三节非线性色谱的实验方法 由于非线性色谱涉及的样品浓度大大高于线性 分析型 色谱的 因此通常的分析型色谱仪及其流程就不完全符合非线性色谱的要求 某些部件必须加以改造才能满足要求 以便于在优化条件下使用 而且在实验方法上也需加以适当的改变 一 非线性色谱中的固定相及色谱柱 1 固定相在生物大分子分析型高效液相色谱中的固定相目前几乎都是用细颗粒大孔径的填料 但是在非线性色谱中 粗和细的可以两者都在使用 原则上讲细颗粒填料的柱效要高 但价格也贵 粗颗粒填料虽柱效低 但价格便宜 而且柱压降低适合于大型制备柱 材料 填料的基体仍以硅胶和有机树脂两大类为主 如果硅胶和有机树脂基体的理化性能 如孔隙度 颗粒大小 比表面及键合的官能团 都一样 那么他们呈现的色谱性能没有显著的差别 孔隙度 填料孔径大小的要求对不同生物大分子也不一样 例如分离核酸要求孔径至少在50nm以上 分离蛋白质一般要求在30 100nm 而且随分子量不同而异 30 50nm可分离30 100kD的蛋白质 而分离100kD以上的蛋白质要求孔径在80 100nm 孔径越大 比表面越小 因而 填料对样品的负载量也降低 而且机械强度也减弱 但是由于传质阻力减少而使不同范围的蛋白质都能得到分离 故使填料效率提高 分离生物大分子的主要填料 1 反向填料 烷基链长是很重要的因素 反向填料上键合的烷基链长似乎与蛋白质的分子量也有反相的关系 即长链烷基填料适合于分离小肽 短链烷基适合于分离多肽及蛋白质 2 疏水作用填料 这种填料的疏水作用比反向填料弱 主要是填料表面烷基密度小 链长短 3 离子交换填料 包括强阳离子 弱阳离子 强阴离子 弱阴离子4种填料 4 体积排斥填料 无机填料一硅胶为主 有机填料中常用Pharmacia出的琼脂类填料 5 亲和填料 亲和填料尽管选择性好 但最大的问题是商品种类太少 几乎对每一种生物大分子的分离都需要合成该种大分子所需要的特殊亲和填料 2 色谱柱及填充技术 以分离纯化为主要目的的非线性色谱与分析色谱一样 色谱柱是极关键的部分 色谱柱关键考虑两方面 一是色谱柱的长度 二是柱的填充 色谱柱长度的选择要考虑多种因素 1 为达到一定的分离度就要求有一个起码的柱长 否则分离的组分就达不到所需的纯度 2 不同的填充方法填充的色谱柱都有一个最长的限度 超过了这个限度 就无法得到均匀的填充床 3 柱效也不是与柱长永远呈比例增长 超过某一长度 柱效不再随柱长增加 4 高压泵的容量不允许使用很长的色谱柱 5 在置换色谱中 超过了最佳柱长 反而会降低产率 提高成本6 柱径的选择也很重要 柱的填充 柱的填充目前主要仍用干法和湿法两种 1 干法操作简单 方便 不需要特殊设备 但柱效一般较差 只适用于直径大于30 m的颗粒 而且更适用于直径较大的色谱柱 2 湿法填充主要适用于20 m以下的颗粒填料 分恒流与恒压填充2种 二 样品溶解与进样方法 用非线性色谱分离与纯化生物大分子时 制备合适的样品溶液是成败的关键之一 1 蛋白质的溶解度有限 通常需加入其他试剂一增加它在水中的溶解度 2 溶液的性质必须适应于所用的固定相 使大量的样品溶液导入色谱柱后不马上扩散 集中在柱头 以达到 塞式 进样目的 适当溶液制备后 进样方式也十分重要 保证大量样品溶液能均匀分布在柱的截面上 使轴向扩散与局部超载降至最小 目前进样方式有两种 1 采用带样品管的六通进样阀 若样品管的容积太大 如大于1ml 在空管中会产生Poiseuille径向速度分布 使样品溶液带进入柱头时加宽 所以一个较好的办法是用大于固定相颗粒2 3倍的惰性实心颗粒填充样品管 可大大减少径向速度不均引起的进样区变宽 2 用高压泵直接输送样品进入色谱柱 由于与流动相混合 所以能保证样品均匀进入柱头的横截面 要注意样品的浓度不能太高 以免析出沉淀 样品进入色谱柱也有多种方式 如中心注射 锥形注射 横截面注射等 中心注射在进样体积较小时 分离效果好 但随进样体积增大柱效逐渐降低 而横截面注射恰恰相反 三 非线性色谱中3种常用的展开方式 超载洗脱 前沿分析和置换展开是非线性色谱中常用的3中操作方式 在实际工作中究竟选择什么方式要取决于样品的性质 所需的产品纯度及要求的产率 1 超载洗脱所谓超载洗脱与传统的洗脱色谱差别不大 只是样品在固定相上的负荷超过了线性洗脱色谱的容量 当样品进入色谱柱后 其中不同组分随流动相以不同的速度移动 因而样品沿色谱柱展开时 由于不断被流动相稀释 浓度逐渐降低 形成较宽而平坦的峰 控制洗脱色谱中分离效率的主要因素有两个 样品的选择性 单位柱长的扩散效应 2 前沿分析前沿分析与洗脱展开不同 样品溶液不是作为一部分进入色谱柱 而是连续不断地输入色谱柱 即它本身起了流动相的作用 前沿分析不可能将样品中的每一个组分都分离回收 这与洗脱展开完全不同 但它很适合于浓缩痕量组分 使之进一步分离与纯化 也适合与产品的精制 出去痕量的杂质 前沿分析的另一个显著的特点是在分离过程中由于样品本身就是流动相 组分的浓度不会像洗脱展开中那样被逐渐稀释 3 置换展开与洗脱展开的主要不同是在样品输入色谱柱后 用一种与固定相作用力极强的流动相通入色谱柱 去替代结合在固定相表面的溶质分子 这种流动相称为置换剂 样品在置换剂推动下沿色谱柱前进 如果色谱柱长度足够 最后会使样品中各组分按作用力强弱的次序 排列成一系列前后相邻的谱带 每个谱带在置换剂的推动下 以相同的速度即置换剂的流速向前移动 此时系统达到了平衡 置换色谱的特殊优点 1 样品中各组分的浓度在展开过程中不但不会降低 有时甚至还能提高 即起到浓缩的作用 这是其他两种展开方式无能为力的 2 单位柱长的固定相利用率也是在3种展开方式中最高的 置换色谱的缺点 一 不易找到合适的置换剂 合适的置换剂要求 1 吸附等温线是凸型 而且吸附系数要大于样品中任何组分 2 在流动相中要易溶 3 不于样品及流动相发生任何化学反应 4 易于从固定相表面洗脱下来 此外还要考虑到价格 纯度等 二 要找到合适的固定相和流动相体系 使被分离的眼皮在此体系内的吸附等温线呈现凸形 否则无法进行置换展开 三 每次置换展开结束 一定要把色谱系统中的置换剂冲洗干净 即要使色谱柱再生后才能进行下一次展开 四 由于大多数色谱分析人员习惯于洗脱展开 对这种独特的置换展开较为生疏 也妨碍了它在分离于纯化中的广泛使用 四 色谱系统的生物相容性 色谱系统中所用的材料对于生物大分子的分离与纯化有相当大的影响 通常液相色谱仪中与流动相接触的部件一般采用316钢 然而这种材料对生物大分子的色谱分离并不合适 原因 腐蚀和吸附 为解决上述问题 1 选择合适的色谱条件 尽量减少生物大分子的吸附 2 采用其它金属材料 如钛等 以降低生物大分子在其表面的吸附性能 3 在316不锈钢表面用亲和性高分子材料进行化学处理 4 采用Peek工程塑料 第四节非线性色谱在分离与纯化蛋白质