人参单体皂苷Rh2抑制缺氧条件下人视网膜血管内皮细胞增殖及整合素_v_3表达的研.pdf

人参单体皂苷Rh2抑制缺氧条件下人视网膜血管内皮细胞增殖及 整合素 v 3表达的研究 杨成明 刘 伟 1 赵燕颖 2 张丽华 3 吴雅臻 吉林大学第二医院眼科 吉林 长春 130041 摘 要 目的 探讨人参单体皂苷Rh2对缺氧条件下人视网膜血管内皮细胞生长及整合素 integrin v 3表达的影响 方法 建立人视网 膜血管内皮细胞缺氧模型 并给予其不同浓度的人参单体皂苷Rh2 应用MTT法观察人参单体皂苷Rh2对人视网膜血管内皮细胞增殖的影响 应用 流式细胞术检测人视网膜血管内皮细胞凋亡的情况 用RT2PCR检测对Integrin v和 3基因的表达 结果 MTT结果显示 缺氧对照组细胞增殖活 性明显强于正常对照组 P 0105 缺氧细胞加用Rh2后的增殖明显受到抑制 与缺氧对照组比差异具有显著性 P01 05 RT2PCR结果表明 和正常对照组比 缺氧对照组的细胞Integrin v和 3基因的 表达明显增强 Rh2可显著下调Integrin v和 3基因表达 结论 人参单体皂苷Rh2在缺氧条件下能明显抑制人视网膜血管内皮细胞的生但无明 显诱导凋亡的作用 关键词 人参单体皂苷Rh2 整合素 v 3 增殖 凋亡 中图分类号 R77411 文献标识码 A 文章编号 100529202 2008 0620557203 1 吉林大学第四医院眼科 2 吉林大学基础医学院病理生理教研室 3 吉林省人民医院 通讯作者 吴雅臻 19502 女 教授 博士生导师 主要从事眼底病的诊 治研究 作者简介 杨成明 19722 男 博士 主治医师 主要从事眼底病的诊断 和治疗研究 研究表明 整合素在血管生成中起着关键作用 其中尤以 整合素 v 3与新生血管生成的关系最为密切 1 整合素 v 3 选择性地表达于新生血管内皮细胞中 与配体结合后通过丝裂 原激活的蛋白激酶途径使内皮细胞增殖 分化和迁移形成血 管 2 但在正常细胞中不表达 人参单体皂苷 Rh2具有提高机 体免疫力 抗病毒等功效 主要用于抗肿瘤方面的研究 3 近 年来 其抗血管生成方面的作用逐渐引起人们的关注 4 实验 表明 人参单体皂苷Rh2通过抑制内皮细胞增生使肿瘤缺乏新 生血管网的供应而无法生长和转移 5 但尚未见人参单体皂 苷Rh2抑制视网膜微血管内皮细胞增生报道 本研究旨在探 讨人参皂甙对人视网膜新生血管内皮细胞生长的影响 1 材料与方法 111 材料 人参单体皂苷Rh2 由本校基础医学院药物化学 教研室提供 系由西洋参中提取 纯度 9915 噻唑蓝 MTT 购自Sigma公司 人视网膜血管内皮细胞株 human ret2 inal capillary endothelial cells HRCEC 为本实验室冻存 细胞在 I MDM培养基 Gibico公司 10 胎牛血清 Hycolon公司 条 件下培养 112 HRCEC缺氧模型的建立及分组 选用第3 6代 HRCEC进行实验 待细胞长满瓶底后 用橡皮塞密封培养瓶 口 插入两个中枪头作为进气及排气孔 将输液用滴管通过进 气孔向瓶内充入5 CO295 N2混合气体 0 15 kg cm2 持续 30 min 使瓶内处于相对缺氧状态 再放入5 CO2孵箱中继续 培养 HRCEC来自于吉林大学中日联谊医院前列腺研究中心 实验室 实验共分四组 正常对照组 缺氧对照组 两个加药组 即缺氧联合低剂量人参单体皂苷Rh2组 5mg L 及缺氧联合 高剂量人参单体皂苷Rh2组 10 mg L 113 细胞生长抑制实验 用相差显微镜观察比较不同加药组 和对照组细胞的形态变化 用MTT法检测细胞生长抑制率 细胞缺氧模型建立后 取对数生长期的后三组细胞以每孔 1 104的浓度接种于96孔培养板 培养24 h后向两个加药组 加药 每组设4复孔 分别于加药24 h 48 h 72 h后加MTT 5 g L 15 l 继续孵育4 h后每孔加 150 l DMSO 震荡 10 min 用酶标仪测定570 nm时各孔光吸收值 A 值 计算 细胞生长抑制率 抑制率 30 为细胞对该药敏感 细胞生长抑制率 1 加药组A值 缺氧对照组 A值 100 114 细胞凋亡及周期检测 将细胞缺氧模型建立后的后三组 细胞经0125 胰酶消化后传代接种于培养瓶中 每瓶细胞 1 106 24 h后加药 Rh2终浓度为5 mg L和10 mg L 对照组 加等体积PBS 各瓶终体积为4 ml 24 h后 收集三组细胞 用 冷PBS pH 71 2 清洗2次 70 的冷乙醇4 固定24 h 用 FACStarpous流式细胞仪检测 计算凋亡率和各期细胞所占比 例 G1峰前出现的亚2倍体峰即为凋亡峰 比G1期细胞DNA 含量少的细胞确定为凋亡细胞 同时观察细胞周期变化 115 RT2PCR 建立细胞缺氧模型 24 h后向后两组细胞加 药 继续培养24 h后收集全部四组细胞 按Trizol操作说明 提 取RNA 紫外分光光度计定量 以GAPDH为内参 RNA样品 经逆转录反应合成cDNA 然后进行PCR扩增 Integrin v扩 增产物 为574 bp 上 游引 物 为 5 2CCAAAGCAAACACCAC2 CCAG23 下游引物为 5 2TTGAAATCTCCGACAGCCAC23 In2 tegrin 3扩增产物为250 bp 上游引物为 5 2TGACAATCAT2 TACTCTGCCTCC23 下 游 引 物 为 5 2ACGCACTTCCAGCTC2 TACTTT23 GAPDH扩增产物为309 bp 上游引物为 5 2GG2 GAAACTGTGGCGTGAT23 下 游 引 物 为 5 2AAAGGTGGAG2 GAGTGGGT23 PCR产物经1 琼脂糖凝胶系统电泳 含溴化 乙啶 拍照鉴定和分析 116 统计学处理 采用SPSS 1110统计软件对数据进行处 755 杨成明等 人参单体皂苷Rh2抑制缺氧条件下人视网膜血管内皮细胞增殖及整合素 v 3表达的研究 第6期 理 使用 2检验进行统计分析 2 结 果 211 对细胞生长状态的影响 各组HRCEC加药24 h后光镜 下观察 正常对照组细胞呈梭形贴壁 铺满整个瓶壁 缺氧组 细胞亦呈梭形贴壁 但生长速度明显加快 可在24 h内铺满整 个瓶壁 加药组细胞部分呈圆形贴壁 培养液中漂浮有细胞和 细胞碎片 细胞数较对照组明显减少 且高剂量用药组的细胞 状态比低剂量用药组更差 见图 1 212 Rh2对HRCEC增殖的影响 MTT结果显示 与缺氧对照 组相比 高剂量及低剂量的人参单体皂苷Rh2对HRCEC均有 生长抑制作用 并呈明显剂量依赖性 二者间差异显著 P 0105 5 mg L人参单体皂苷Rh2给药组生长抑制率为 3411 而10 mg L人参单体皂苷Rh2给药组生长抑制率为 5213 二者比较差异具有显著性 P 01 05 见图2 A缺氧对照组 B 5 mg L Rh2组 C 10 mg L Rh2组 图1 不同浓度Rh2处理视网膜血管内皮细胞的生长抑制率 图2 不同浓度Rh2处理HRCEC的生长抑制率 213 Rh2对HRCEC凋亡的作用 流式细胞检测结果显示 与 缺氧对照组相比 不同剂量的给药组细胞均被不同程度地阻滞 在G22M期 差异显著 P 0105 缺氧对照组凋亡率为1131 低剂量给药组凋亡率为 1193 高剂量给药组凋亡率为2136 见图 3 214 RT2PCR检测Rh2对Integrin v和 3mRNA表达的影响 电泳结果显示 Integrin v 3及 GAPDH的扩增片段大小与 设计的完全一致 缺氧对照组与正常对照组相比 Integrin v 和 3mRNA表达水平有明显提高 而各用药组与缺氧对照组 比较Integrin v和 3mRNA表达水平明显降低 差异显著 P 0105 见图 4 图3 Rh2处理HRCEC 48 h后流式细胞仪检测结果 1 marker 2 正常对照组 3 缺氧对照组 4 5 mg L Rh2组 5 10 mg L Rh2组 图4 Rh2对HRCEC中I ntegrin v和 3mRNA表达的影响 3 讨 论 视网膜新生血管形成是个极其复杂的过程 通常认为当视 网膜缺血缺氧时 在各种生长因子及细胞因子的刺激下 已经 存在的微血管网内皮细胞发生有丝分裂 迁移 以出芽的方式 形成管腔 因此内皮细胞增生是其关键步骤 如能有效地打 断这一环节 新生血管将无法形成 6 7 本实验结果表明 人 参单体皂苷Rh2在体外同样能有效地抑制HRCEC增生 从而 为人参单体皂苷Rh2体内抑制视网膜新生血管形成提供了研 究基础 Integrin是一类细胞表面受体家族 由 和 两条链通过 非共价键连接而成的异源二聚体跨膜糖蛋白 6 这一类受体 参与细胞与基质 细胞与细胞之间的黏附 在很多重要的生理 过程中起重要作用 迄今为止发现23种Integrin亚型 其中 Integrin v 3在新生血管内皮细胞有高度表达 v 3与配体结 合后通过丝裂原激活的蛋白激酶途径使内皮细胞增殖 分化和 迁移形成血管 因此 Integrin v 3逐渐被认为是新生血管组 织的标记物 已有实验证明缺氧可诱导Integrin v 3表达的 增高 而缺氧调节 v 3基因的表达是血管形成的重要调节因 子 尽管众多资料显示Integrin与血管生成密切相关 但其确 切机制尚不清楚 可能与生长因子受体激活途径相整合 与蛋 白激酶C PKC Ras癌基因蛋白 sh2包含蛋白 促分裂素原活 化蛋白激酶 Ras shc MAPK 成簇黏附激酶 FAK 等信号分 子相互作用 调节细胞骨架和血管生成相关基因以及血管内皮 细胞整合素受体的表达 影响内皮细胞和细胞外基质的相互作 用 导致血管生成的发生和维持 或血管的消退 凋亡 从而影 响血管内皮细胞的生长或消退 8 9 本研究结果表明 通过建立缺氧模型并人为给予不同剂量 的人参单体皂苷Rh2 在体外能明显抑制HRCEC的增殖和生 855 中国老年学杂志2008年3月第28卷 长 且呈明显的剂量依赖性 可能是人参单体皂苷Rh2通过抑 制Integrin v 3在HRCEC的表达 使细胞阻滞在G22M期 从 而达到抑制HRCEC增殖的作用 但对凋亡的诱导作用却并不 明显 可能是我们所研究的细胞并非肿瘤血管内皮细胞的缘 故 其机制尚待进一步深入研究 综上所述 本实验结果证明了人参单体皂苷Rh2具有抑制 HRCEC增殖和生长的作用 这为其在临床视网膜静脉阻塞 眼 缺血综合症 增殖性糖尿病视网膜病变等眼缺血缺氧性疾病的 治疗提供了一定的实验基础和理论依据 因人参单体皂苷 Rh2是从人参中提取的天然产物 毒副作用小 更具安全性 4 参考文献 1 Polverini PJ1Cellular adhesion molecules newly identified mediators of angiogenesis J 1Am J Pathol 2006 14 8 1023291 2 Brooks PC1Roles of integrin in angiogenesis J 1Eur J Cancer 2001 32 11 2423291 3 窦德强 靳 玲 陈英杰 1人参的化学成分及药理活性的研究进展 与展望 J 1沈阳药科大学学报 1999 16 4 151261 4 Ruegg C Domondo O Marriotti A1Endothelial cell integrins and cox22 mediators and therapeautic targets of tumor angiogenesis J 1Biochim BiophysActa 2004 1654 1 512671 5 王 兵 1王杰军 徐 钧 等 1人参皂苷R对胃癌诱导血管内皮细 胞增殖的抑制作用 J 1肿瘤防治杂志 2001 8 3 234261 6 CapetandesA GerrirsenME1Simplifiedmethods for consistent and selec2 tive culture of bovine retinal endothelial cells and pericytes J 1Invest OphthalmolVis Sci 2006 31 1 1740241 7 Stromblad S Cheresh DA1Integrins angiogenesis and vascular cell surviv2 al J 1Chem Biol 2006 3 1 881251 8 Byzova TV Goldman CK Pampori N et al1A mechanis m for modulation of cellular responses to VEGF activation of the integrins J 1Mol Cell 2000 6 4 8512601 9 FriedlanderM Brooks PC Shaffer RW et al1Definition of two angiogenic pathways by distinctAv integrins J 1Science 1995 270 10 1500221 2008201211收稿 2008202215修回 编辑 章 木 PI3K P70S6K在胰岛素抵抗大鼠脂肪中的表达及其意义 王艳军 尤雪娜 赵 丹 中国医科大学附属盛京医院内分泌科 辽宁 沈阳 110004 姜苒华 辽阳糖尿病医院 刘国良 中国医科大学第一临床学院内分泌科 摘 要 目的 测定不同饮食喂养大鼠产生胰岛素抵抗 I R 的情况 观察大鼠脂肪中PI3K P70S6K的表达及大鼠血清中游离脂肪酸 FFA 和超敏C反应蛋白 hs 2CRP 的变化 方法 4周龄W istar雄性大鼠40只 随机分为4组 分别以普通 高糖 高脂 高糖高脂饲料喂养大鼠8 w后 行 高胰岛素 2 正常血糖钳实验 对大鼠IR程度进行评估 应用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中FFA及hs2CRP 分别用原位杂交 Western印迹方法检测 大鼠脂肪中的PI3K P70S6K 结果 高脂 高糖高脂饲料组大鼠产生IR 普通 高糖饲料组未出现IR I R组大鼠FFA及hs2CRP明显高于非IR大鼠 P 0101 PI3K表达在IR组大鼠明显低于非IR组大鼠 P70S6K的表达在I R组大鼠明显高于非IR组大鼠 P 01 01 结论 高脂 高糖高脂饲 料喂养大鼠8 w可成功诱导大鼠产生I R IR的产生可能与肥胖 高FFA及炎症反应有关 PI3K在IR组表达降低 P70S6K升高 关键词 胰岛素抵抗 IR 游离脂肪酸 FFA 超敏C反应蛋白 hs 2CRP PI3K P70S6K 中图分类号 R233 R58711 文献标识码 A 文章编号 100529202 2008 0620559203 The expression and sign ificance of PI3K and P70S6K in insulin2resistant rat fat WANG Yan2Jun JI ANG Ran2Hua L IU Guo2L iang et al1 Endocrine Department of Shengjing Hospital Affiliated to Chi na M edical Un iversity Shenyang 110004 L iaon i ng China Abstract Objective To deter mine insulin resistance IR of individually fed rats by detecting the expression of PI3K P70S6K in fat and the changes of free fatty acid FFA and high sensitive CRP hs2CRP in serum1M ethods FortyW istarmale rats aged four2week were randomly divided into four groups hyperinsulinemic euglycemic clamping experimentwas used to evaluate I R of rats fed respectively by general fatty hyperglycemic and fatty2hyperglycemic food for 8 w1Enzyme2linked immunosorbent assaywas used to determine serum FFA and hs2CRP hybridization in situ andWestern blotwere used to detect PI3K and P70S6K in fats1Results IR was found in rats fedwith fatty and fatty2hyperg