（微生物学专业论文）生孢噬纤维菌的多糖合成及其淀粉降解特性研究.pdf

摘要 生孢噬纤维菌( 咖钞芒印硇卵) 能够分解纤维素、淀粉、蛋白质、脂肪、脂类等 生物大分子，同时可以产生胞外多糖并且胞外多糖具有免疫增强活性等多种生物学功 能，是重要的微生物资源。以往都是进行该菌株降解纤维素的研究，对其降解淀粉产生 多糖的特性以及淀粉降解特性尚未有报道。本论文的目的是对其以淀粉为底物产生多糖 的特性进行研究，研究对其产生的淀粉酶的定位及产酶条件的优化，为该菌株的胞外多 糖产业化奠定基础。 实验结果具体如下： 1 勋0 1 朋手印惦卵s p j l 一0 1 和s d 一0 1 都能够降解淀粉产生多糖，通过比 较研究，儿一0 1 比s d 0 1 菌株生长速度快，多糖产量高。通过对儿一0 1 部分产多糖条 件优化，确定其在以蛋白胨为氮源、接种量为1 、p h 值为7 ，培养4 8 h 时多糖产量最高， 1 4 4 h 时多糖几乎为o 。产糖量为o 2 5 m g m 1 。 2 儿一0 1 和s d 一0 1 在基本淀粉培养基上生长产生淀粉酶，采用液体发酵，离 心得上清和沉淀，分别测上清和沉淀的酶活。沉淀菌体通过超声波破碎。结果表明，j l 一0 1 和s d 一0 1 均产生胞外淀粉酶，胞内酶活极低。 3 通过培养基优化，发现儿一0 1 和s d o l 能在p h 较低的环境下正常生长，最适p h 均为4 0 。在液体发酵的条件下，确定了温度、p h 、碳源、氮源等因素对于生孢噬纤 维菌分解淀粉产生淀粉酶特性的影响。结果表明，儿一0 1 菌株初始p h 为4 o ，最适温度 3 2 ，淀粉添加量为o 5 ，尿素为主要碳源，摇床培养至3 6 h 酶活力达到高峰。s d - 0 1 菌株酶活达到高峰时摇床温度为3 0 ，其它培养条件与儿一0 1 相同。儿一0 1 菌株产生 的胞外酶活高于s d 一0 1 。 4 对儿一0 l 菌株产生的淀粉酶的性质进行研究，将粗酶液进行了超滤， 盐析、透析、s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶层析和冷冻干燥，聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到单一淀 粉酶组分。对该酶的性质研究表明，该酶的分子量为6 1 0 0 0 d a ，最适反应温度为6 0 ， 最适反应p h 4 o ，在温度4 0 6 0 ，p h 4 0 6 0 条件下较稳定。 关键词：生孢噬纤维菌；多糖发酵；降解淀粉机制；胞外淀粉酶特性 a b s t r a c t 印口，d 哕f d p 矗口舶c 孤d e c o m p o s ec e l l u l o s e ，s t 缸c h ，p r o t e i n ，f a t ，芦e a s em a c r om o l c u l e ，t h e y c a np r o d u c ce x o p o l y s 砌l a r i d ew h i c hh a v es o m eb i o l o g yf u n c t i o ns u c h孵 i m m u n i t y r e i n f b r c i n ga c t i v i t ya n ds 0o n ，i t i s i m p o n a n lm i c f o b er e s o r e c e s i nd a 罗so fo l dw ec a r i y t h r o u g l l r e s e a r c ho f 跏d ，d 哕卸咖口g 口d e 黟a d a t i o nc e l l u l o s e b u tt h ec h a m c t e r i s t i co ft h e y d e 伊a d a t es t a r c hp r o d u c ep o l y s a c c h a r i d e 锄d 锄y l 弱ee i l z y m o l o g yi s n o tr e l ) 0 n e d t 1 l e p u 叩o s eo ft h ep a p e ri s o r i e n t a t eo fa m y l a s e 弱w e l l 弱o p t i m i z eo fa m y l a s e ，a n dp r i m a r y m e a s u r cy i e l do fe x o p o l y s a c c h a r i d e ，d i s c u s st h ep r o c e s so fd e 乎a d a t eo fs t a r c h 1 飞e 陀弱u l t0 fe x p e r i m e n ta sf o l l o w s ： 1b o t h 写印，d 砂蛔砷母弘唯j l 一0 1 觚ds d - 0 1 伽d e g r a d a t es t a r c hp r o d u c ea m y l o s e ，觞a r c s u l t0 fc o p a r a t i v e ，j l 一0 ls t r a i ng r o w 也m o r es o o n 也a ns d o l ，锄y 1 0 s ey i e l dm o f c h i g l l w eo p t i m i z e t h cc o n d i t i o no fj l 0 1p r o d u c ca m y l o s e ，吣e p e p t o n c i s n i t r o g e n u r c c ，i n o c u l u ms i z e1 ，p hi s7 ，b r i n gu p4 8h o u 璐，t h ey i e l do f 锄y l o s ei st i p t o p ，1 4 4 h o u 娼 锄y l o s ea l n l o s ti s0 n eq u 锄t i t yo fi s0 2 5 m 跏n 1 2j l 0 1 觚ds d - 0 1 咖g r o w t hi nb 嬲i cs t 鲫c hm e d i u m 卸dp r o d u c e 锄y l a ，a d o p t l i q u i df e 姗e n t a t i o n 姐dc e n t r i f u g c ，w eg e t t t l e0 fu p s i d e 趾dp r e c i p i t i o n 皿e 弱u r ct h e i r e n z 珊ea c t i 、，i t y n ed e p o s i t i o no ft h a l l ii sb r o k e nu pb yu l t m n j c n er e 蛐l ti n d i c a t et h a t m e i r 锄y l 弱ea l la r e0 u t s i d co fc c l l ，t h ea c l 融yo fi n s i d ec e l li s1 0 w 3b ym e 锄s0 fo p t i i n i z eo fm e d i u m ，w ef o u n dj i 广0 1 明ds d - 0 1c 觚g r 0 州hi na c i d i t y c o n d i t i o n ，t h e f i l n h e s t a d a p t i o np h a r e4 w b a d o p t f l u i df b 珊e n t a t i 伽，c o n f i 册 t c m p e r a t u r e ，p h ，c a r b o ns o u f c c ，n i t r o g e ns o u 觥a n ds oo na c t0 ns p 0 帕c y t o p h a g aa n dh a d m ei m p a c to na m y l 弱e t l l l er e s u l ti n d i c a t e ，j i ，0 1s t r a i no r i g i i l a lp hi s4 ，t h et e m p e r a t u r eo f 眦k i n gb e d i s3 2 ，q u 孤t i t yo fs t a r c hi s0 5 ，t h em a j o rc a r b o n u r c ei su r e a ，r o c k i n gb e di s 3 6 h ，t h ee n z y m ea c t i v i t ya c h i e v ep i 衄a c l e t l l l et e m p e r a t u r eo fr o c l 【i n gb e do fs d 一0 1i s 3 0 ，o t h e rc u l t i v a t i o nc o n t i o ni st h es a m ea sj l 0 1 弧ea c t i v i l y0 fj l 0 1i sm o r eh i g l lt h 孤 s d 0 1 4w et a k et h es t u d yo fa m y l a s ec h a r a c t e r ，u l t r a f i t r a t i o ng r u f fe n z y m e ，s a l t0 u t ，d i a l l y s i s ， s e p h a d e xg - 1 0 0g e lc h r o m a t o g r a p h y 柚d 骶e z ed r ) r i l l g ，p a g e ，w eg e ts i n 舀ea m y l a s e g r o u m e 觚a l y s i si n d i c a t e ，t h em o l e c u l a rw e i g l i to ft h ee n z 舯ei s6 1 0 0 0 d a ，t l l e m o s tr i 班 r e a c t i o n t e m p e r a t u r e i s 6 0 ，p h i s4 h l4 0 - 6 0 ， p h 4 o - 6 0 c o n d i t i o ni s r e l a t i v e l y s t a b i l i z a t i o n k e yw o r d s ：5 妒厂d 哕蛔砷口朋；p o l y s a c c h a r i d ef e 肋e n t a t i o n ；d e 黟a d a t i 伽s t a r c l ld e c h a n i s m ； c e l lc i l t s i d ea m y l a s ec h a r a c t e r i s t i c 1 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：逸丝趁立 日 期：型堕：! ，牛 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：乏樾 日期：垒丛：多! f d 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 一生孢噬纤维菌研究概述 1 生孢噬纤维菌对纤维素、淀粉等大分子的降解 纤维素类物质包括纤维素、半纤维素以及木质素，约占地球总生物量的4 0 一5 0 ， 是地球上最丰富的可再生物质资源n 。微生物是纤维素类物质生物转化的主要执行者， 利用微生物产生的纤维素酶将纤维素类物质转化为人类急需的能源、食物和化工原料， 对人类社会的可持续发展具有非常重要的意义。 纤维素降解微生物多种多样，包括真菌、厌氧性细菌、好氧细菌，甚至古生菌，不 同微生物类群产生的纤维素酶均含有多种纤维素酶组分，构成纤维素酶系。纤维素酶系 中各组分作用方式不同，但是可协同催化纤维素的水解。重要的水解纤维素的酶包括内 切葡聚糖酶( e n d o l ，4 一bg l u c a n a s e ，e c 3 2 1 4 ) ，外切葡聚糖酶 ( e x o _ l ，4 一b g l u c a n a s e ，e c 2 3 1 9 1 ) ，纤维二糖水解酶( c e l l u b i a s eo r 一g 1 u c a n a s e ， e c 3 2 1 2 1 ) 。内切葡聚糖酶降解纤维素分子的无定形部分，产生水溶性的纤维寡糖 ( c e l l o o l i g o s a c c h a r i d e s ) ，并可以进一步降解形成纤维二糖和葡萄糖；外切葡聚糖酶 从非还原端降解纤维素的无定型区产生纤维二糖和葡萄糖；纤维二糖酶则降解纤维二糖 和可溶性纤维寡糖形成葡萄糖，形成的纤维二糖和葡萄糖可被细胞吸收利用。这些酶单 一组分均不能有效地降解结晶纤维素，但协同作用可以降解结晶纤维素。这是丝状真菌 纤维素酶结晶纤维素的一般机制盥1 。丝状真菌纤维素酶是分泌到细胞外的游离酶，到目 前为止，所有对纤维素降解机制的认识主要是通过对丝状真菌纤维素酶的研究获知的。 自然界中，另一类降解天然纤维素的重要微生物类群是细菌。到目前为止，已报道 的好氧性纤维素降解细菌主要有幻- j ，j 删s 劢p 啪6 j 疗血印伽钞芒印岫鹧 罗卿p 芒伽妒e s 肋阳州妇等；厌氧性纤维素降解细菌则主要集中在甜d s 川以蚴 r u m i n o c o c c u s 。c a l d i c e l i u l o s i r u p t o r 。b u t y r i v i b r i o 。a c e t i y i b r i 0 f i b r o b 8 c t e r 等属。其中，对分解纤维素的好氧性细菌的研究是整个纤维素微生物降解研究中非常重 要的环节。目前已经报道的好氧性纤维素分解细菌主要为锣亡印加鄂、她钞芒筇忆明， b a c n l u s 、s o r a n g i u mc e n u i o s u m 以及淑缓菌中懿s t r e p t o m y c e ，c a r d i a 等属钓? 意聃 【2 3 4 ，5 】 o 其中，生孢噬纤维菌是一类具有较强纤维素降解能力的好氧性滑动细菌，该菌株的 分离纯化相当困难，原因在于滑动细菌依靠滑动生长很难形成单菌落，而杂菌有足够的 时间繁殖并扩展到纤维素降解菌菌落中去，故国内外有关这类滑动细菌的分离纯化的报 道甚少，四十年来，国内外有关生孢噬纤维菌的研究仅有不到2 0 篇的相关研究报道， 并且大部分为菌株分离及形态学研究的报道1 们。生孢噬纤维菌是革兰氏阴性滑动细菌， 能够在固体表面快速滑动，依靠滑动能够吸附到赖以生长的不溶性固体介质表面，获取 东北师范大学硕士学位论文 营养。根据以1 6 s r r n a 为主要分类依据的最新伯杰细菌系统鉴定手册1 ，该菌株在分类 上属于鞘脂杆菌纲( 勋 j 聊6 a c 芒甜妇) 、鞘脂杆菌目( 5 融，啊矽6 a c f 盯歹a e 曲、弯曲细菌 科( 用甜j 6 a c 舌盯妇c 朗占) 、生孢噬胞菌属( 慨f 印施翱) ，与以前的分类地位有所不 同；其g + c 百分含量高达6 7 ，与其它滑动细菌的亲缘关系较远，与勿f 印细韶、胁j s c 沁， 膨c ，d s c j 如、胎j 幽鲫6 a 拍妇，砌p 厶等属的亲缘关系较近。该菌株的特点是可以利 用纤维素与纤维二糖作为碳源和能源进行生长，并且在生长的后期形成小孢囊休眠体 1 刳。该菌株能够分解大分子，如纤维素、淀粉、蛋白质、脂肪、脂类等，并以产生胞 外多糖并且胞外多糖具有免疫增强活性等多种生物学功能而著称，是重要的微生物资 源。 2 0 0 1 年本实验室从吉林土壤中筛选得到了一株生孢噬纤维菌菌株瓣缈芒印幻韶 儿一0 1 研究发现，该生孢噬纤维细菌对结晶纤维素的降解能力很强，在好氧条件下能够 在仅含有纤维素和无机盐的培养基上有效降解天然纤维素而快速生长，生长的同时产生 胞外多糖；该特性也是生孢噬纤维细菌分离纯化甚至分类的依据之一。生孢噬纤维菌在 纤维素固体表面快速滑动，可以明显地观察到纤维素分解现象；为了研究该菌株的纤维 素酶特性以及对纤维素的降解特性，我们采用扫描电镜对菌株印d ，d 钞芒叩蛔弘j l 一0 1 对滤纸纤维素的降解过程进行了动态观察n3 | 。结果显示，生孢噬纤维菌接种于滤纸平板 后，在生长的初期细胞沿滤纸纤维有规律的运动并迅速扩展，该菌株通过菌体伸长形成 细长的杆状细胞吸附到纤维素上进行纤维素的快速降解，而细长的杆状细胞并且只有细 长的杆状细胞才具有天然纤维素的降解能力；随后出现滤纸的快速降解和细胞的快速增 殖，进入大量生长期，生长的同时产生胞外多糖；与细胞接触到的滤纸被利用殆尽时， 细胞的生长也就停止了，此时大量产生胞外多糖，并进入孢囊形成阶段。 2 生孢噬纤维菌多糖的研究现状 微生物多糖主要由细菌、真菌和蓝藻类产生，其中许多细菌由于处于特殊的生态环 境，其遗传及生理特性与其它的生物相比具有较大的不同，因此具有产生功能独特的活 性多糖的潜力。通过对多种细菌多糖的研究，人们已经发现多种具有抗肿瘤、增强免疫 作用、抗病毒、抗细菌、抗辐射等生物学活性的细菌多糖，如湿润黄杆菌( 用a 阳施c 于盯j 删 “j 括j 力蚴m p 5 5 ) 产生的胞外多糖( i i l a r i n a c t a n ) 具有明显的抗肿瘤活性n 劓， 店p ，如舢ss p h a 3 1 8 的胞外多糖具有很强的抗h i v 活性n 朝，坚韧肠球菌 ( 励舌踟c d c c 淞反，r a j r 7 曲z 2 2 2 的胞外多糖e p s l 具有免疫细胞调节作用n 们，从海洋弧菌属 n 7 3 中提取的胞外多糖具有抗肿瘤活性，一株海洋假单胞杆菌属细菌w a k l 1 8 1 产生的粘多 糖和硫酸化的胞外多糖具有明显的抗病毒h s v l 活性，而肠膜状明串珠球菌n 们产生的右 旋糖酐，其硫酸酯有阻止脂类异常引起的高血脂动脉硬化的作用。对细菌多糖的广泛研 究结果充分地显示了细菌活性多糖开发的重要意义啪2 1 2 铂。 生孢噬纤维菌作为一类具有较强纤维素降解能力的好氧性滑动细菌，该菌株的分离 纯化相当困难，原因在于滑动细菌依靠滑动生长很难形成单菌落，同时该菌株产生大量 的胞外荚膜多糖，因而使得杂菌有足够的时间繁殖并扩展到纤维素降解菌菌落中去，故 2 东北师范大学硕士学位论文 国内外有关这类滑动细菌的研究报道甚少。国内目前只有东北师范大学生命科学学院本 课题组、山东大学微生物技术国家重点实验室高培基教授的课题组、湖南农业大学动物 科技学院肖克宇教授的课题组心钉分别从土壤中筛选得到了生孢噬纤维菌菌株，并进行了 相关的研究。 作为具有较强纤维素降解能力的好氧性细菌，生孢噬纤维细菌与堆囊菌、噬纤维细 菌等同属于能够降解纤维素的滑动细菌，它能够在固体表面快速滑动，且依靠滑动，吸 附到赖以生长的不溶性纤维素固体介质表面，获取营养，在降解纤维素的同时产生大量 的粘性多糖。已有的研究结果表明，这类纤维素滑动细菌在降解纤维素的过程中，可以 产生包括抗癌药物、免疫活性多糖在内的多种活性物质。例如黏细菌( 协彻6 a c 芒们a ) 中 的如阳馏f 姗c p j ，j 叩姗( 纤维堆囊菌) 乜2 5 1 通过降解纤维素就产生类似紫杉醇的抗癌 物质印d 动j j 伽p s ，它有类似紫杉醇的生物活性，但较紫杉醇的结构简单、水溶性好， 目前已进入大规模的产业化阶段。同样作为滑动细菌的生孢噬纤维菌产生的活性多糖因 此也受到了人们极大的关注，在1 9 9 1 年再版的t h ep r o k a r y o t e s ：ah a n d b o o k0 nt h e b i o l o g yo fb a c t e r i a 中，c o u g h l n 等人指出，生孢噬纤维菌多糖具有高免疫增强活性等 多种生物学功能，可用于开发免疫增强剂和其他多糖类药，是极其重要的微生物资源。 东北师范大学生命科学学院于2 0 0 1 年从吉林土壤中筛选得到了一株生孢噬纤维菌 菌株西姗钞芒蝴儿一0 1 啪1( g e n b a n k 收入的a c c e s s i o nn u m b e r 为勋d ，d 钞芒蚀卵 s p j 卜0 1 ：d q l 8 6 9 7 1 ) ，研究发现，该生孢噬纤维细菌对天然结晶纤维素的降解能力很 强，在好氧条件下能够在仅含有纤维素和无机盐的培养基上有效降解天然纤维素而快速 生长并产生胞外多糖；生孢噬纤维菌在纤维素固体表面快速滑动，可以明显地观察到其 分解纤维素产生胞外多糖的现象阱1 。2 0 0 3 年，进行了以纤维素物质为底物发酵生产生 孢噬纤维菌多糖的研究，在此基础上，我们又进行了生孢噬纤维菌多糖的结构研究啪1 ， 研究中，采用水提、超滤、浓缩、醇析、常规干燥获得不含蛋白质等杂质的纯多糖样品， 进而测定了生孢噬纤维菌荚膜多糖的结构，g c 结果表明荚膜多糖的单糖组成主要为g a l ， g 1 c ，g 1 c a ，m a n ，红外光谱图可以得出如下结论：该多糖在3 4 3 2 c m 、1 4 5 3 c m 。处有多 糖吸收峰，从在1 4 5 3 c m _ 的吸收峰来看，该多糖所含甲基、亚甲基的量比正常多糖多； 而其在8 8 1 c m 1 处的峰位显示，其含有不典型b 糖苷键特征吸收峰，其分子中有可能同 时含有q 糖苷键与b 糖苷键。在生孢噬纤维菌荚膜多糖的应用方面，湖南农业大学动物 科技学院肖克宇教授啪瑚1 的课题组系统而全面地进行了生孢噬纤维菌菌株胞外多糖用作 动物饲料添加剂的研究。肖克宇教授的实验结果表明，该多糖安全无毒；对草鱼非特异 性免疫功能有显著的促进作用，其最适添加量为1 0 0 m g k g ；同时该胞外多糖具有极其显 著的抗菌效果；此外，投喂粗品多糖的实验组鱼体的存活率和免疫保护力均显著高于对 照组。这些试验结果显示，生孢噬纤维菌胞外多糖是活性强而且免疫增强效果显著的活 性多糖，可以应用到动物养殖中提高动物的非特异免疫能力及存活率。 细菌作为低等原核生物，其所处的生活环境特殊，其遗传及生理特性与真核微生物 有所不同，具有产生结构新颖、功能独特的活性多糖的潜力，是开发新型多糖类免疫调 节剂的重要资源。生孢噬纤维菌作为一类具有较强纤维素降解能力的好氧性滑动细菌， 3 东北师范大学硕士学位论文 该菌株通过可利用纤维素、纤维二糖、淀粉等作为碳源和能源进行生长并产生胞外多糖， 同时产生的胞外多糖具有免疫增强活性等多种生物学功能。而以淀粉为底物，生产生孢 噬纤维菌胞外多糖具有重要的工业化前景。因此，本研究从生产开发的角度，研究以淀 粉为底物的生孢噬纤维菌胞外多糖的发酵及其淀粉降解机制。 二淀粉发酵生产微生物多糖的研究概况 微生物多糖是细菌、真菌、蓝藻等微生物在代谢过程中产生的对微生物有保护作用 的生物高聚物。其中研究较早且最多的是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它在医药上主 要用于疫苗。微生物多糖在工业生产与生活的许多领域具有广泛的应用价值，如作为微 生物絮凝剂、食品添加剂、保鲜剂、抗癌医药品包装材料等口。微生物多糖生产周期短， 不受气候和地理环境条件的限制，可以在人工控制条件下利用各种废渣、废液进行生产， 减轻了环保压力。另外，由于潜在用途不断被开发，应用前景比动植物多糖更为广阔。对 于微生物多糖，必须满足三个条件才是有价值的：能分散或溶解于水中；具有优于 或等同于传统胶的稳定功能等特性；具有特殊的流变特性。在食品工业中还要保证绝 对的安全性。我国在这方面起步较晚，当前只有很少种类的多糖及产生菌用于工农业生 产，因此有必要对微生物产多糖的情况进行深入研究。 淀粉是食品加工业的基础原料。随着世界粮食生产的发展，淀粉产量逐年增加，淀粉 行业的飞速发展，使淀粉深加工技术日益显示出重要的作用。将淀粉进行多层次深度加 工，可生产改性淀粉、淀粉糖、发酵制品等几类产品约2 0 0 0 余种，使淀粉增值3 2 0 倍口副。 其中，以淀粉为原料的发酵产品，因现代生物技术日新月异的发展而获得了更加广阔的 发展空间，使其成为一项市场前景好、增值多、经济效益大的淀粉深加工的重要产品之 一。近年来，以淀粉为原料利用生物技术开发出的新产品一微生物多糖，因其安全无毒、 理化性质独特等优良性质而倍受关注。微生物多糖包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。 胞外多糖是由微生物大量产生的多糖，易与菌体分离，可通过深层发酵实现工业化生产。 一般微生物多糖是以淀粉水解为碳源发酵生产，也可直接利用可溶性淀粉经微生物酶作 用制得。据d e e v e l e i g h 3 1 统计，已经发现4 9 属7 6 种微生物产生胞外多糖，但真正有应 用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种。近几年，随着对微生物多糖研究的深入， 世界上微生物多糖的产量和年增长量均在1 0 以上，而一些新型多糖年增长量在3 0 9 6 以 上。近年来又兴起对一些新型微生物多糖如海藻糖( t r e h a l o s e ) 、透明质酸 ( h y a l u r o n i c a c i d ) 、壳聚糖( c h i t a s a n ) 等的研究。目前，许多微生物多糖已作为胶凝剂、 成膜剂、保鲜剂、乳化剂等，广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域副。 微生物多糖在食品工业中的应用比较广泛，可以用作食品添加剂、抗凝剂，保鲜剂 等。已经获得工业应用的有结冷胶、黄原胶、海藻糖、琼脂糖、短梗多糖、凝结多糖等。 短梗多糖用淀粉水解物一蔗糖或其他糖类，由短梗霉发酵生产，易溶于水，不凝胶化， 不老化，可以任意加工成形，无任何毒性，是很有前途的工业用多糖。由于可塑性良好， 有人称之为“从淀粉制造的塑料 。凝结多糖可用于多种食品中如果冻、面条、香肠、 4 东北师范大学硕士学位论文 汉堡包、冰淇淋、微波食品等。作为一种食品添加剂，它可以改善产品的持水性、粘弹 性、稳定性，并有增稠作用。豆腐是日本和中国的传统食品，它具有柔软的质构，加入凝 结多糖将豆腐做成面条状，赋予它不同的质构，还可将豆腐进行高温消毒，也可冷藏。黄 原胶也是食品工业中应用较多的一种微生物多糖。黄原胶易溶于水，在冷水、热水中分 散性稳定，在低浓度下能产生很高的粘度，增稠性良好，水溶液呈透明胶状，具有较高的 假塑性、良好的稳定性，也具有良好的分散和乳化作用。黄原胶在食品工业中可用作稳 定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂、泡沫增强剂和加工辅助剂并得到了广泛应用m 1 。普鲁 兰多糖作为主食和糕点的低热值食品原料和食品品质的改良剂和增塑剂，广泛应用于食 品工业中。如普鲁兰多糖与适量的小麦粉、豌豆粉混合可制成低热值人造米、面等，糕 点中添加部分普鲁兰多糖可提高其风味。由于普鲁兰多糖不为人体消化酶消化，食物纤 维的生理功能对各种常见老年疾病有辅助疗效作用。在冰激淋生产中，添加普鲁兰酯或 普鲁兰多糖，产品的滑润性能增强，风味好，口感好。 微生物多糖在医药领域的应用研究主要集中在多糖成分的生物活性功能、药理作用 与免疫保健作用。它具有抗肿瘤抗病毒活性并可作为免疫育苗等作用。药理和临床试验 发现，高等真菌中有5 0 个属1 7 8 种的提取物具有抑制小鼠s 一1 8 0 肉瘤及艾氏腹水瘤等细 胞生长的生物学效应。真菌多糖抗肿瘤机制中目前被大家广为接受的是免疫调节机制 d 7 1 ，即真菌多糖是一种免疫增强剂，能激活免疫细胞，激活网络内皮系统( r e s ) 、吞噬、清 除老化细胞和异物，调节机体抗体和补体的形成，提高机体抗肿瘤免疫力，对肿瘤细胞有 抑制作用。能增强机体免疫功能的微生物多糖还有环蜜菌多糖，高浓度环蜜菌多糖具有 广泛的生物学活性，可参与多种生理过程和免疫调节作用如免疫活性细胞的调节、造血、 抗肿瘤等。中国卫生部已批准香菇多糖、灵芝多糖、云芝多糖、银耳多糖、猪苓多糖、 虫草多糖、金针菇多糖、黑木耳多糖、茯苓多糖、猴头多糖等具有免疫调节功能啪1 。如 冬虫夏草多糖能与肝腹水癌细胞结合，抑制胞外葡萄糖进入癌细胞，使癌细胞缺乏能量 而致死。灵芝多糖可使t 淋巴细胞增多，升高正常人和白细胞减少者的白细胞数。香菇 多糖对原发性自身癌的生长有强抑制作用，对化学致癌及病毒致癌也有抑制，将其用于 不能手术或再生性胃癌患者，可延长生存期啪1 。研究者还发现某些多糖对艾滋病病毒有 抑制作用，菌类多糖对该病毒显示出了优异的活性。从裂褶茵属，小菌核属和 胁以s c 以淞甩融，粥中分别提取出了三种多糖：裂褶菌素、硬葡聚糖、悬垂素。这些 多糖的硫酸化衍生物对h i v 增殖均表现出强烈的抑制作用，且可抑制巨细胞的形成。蘑 菇多糖和凝乳糖的硫酸脂的m t 4 细胞培养抗h i v 活性试验，发现硫酸凝乳糖具有很高的 抗h i v 活性和低阻凝活性，透性很低，被认为是一种较有前途的爱滋病治疗药物。 据估计，全世界微生物多糖年工业产值可达5 0 亿一1 0 0 亿美元。综上所述，微生物多 糖的工业化生产和应用有着巨大的发展潜力。海藻糖、透明质酸和壳聚糖是近年来微生 物多糖的研究热点附4 3 1 ，其中利用微生物水解淀粉的生产可能是短期见效的可行途径。以 淀粉为原料的微生物多糖发酵产品的生产，具有原料来源丰富廉价，生产不受区域和气 候条件的影响并容易被微生物所降解等优点，为淀粉深加工产业开辟新市场、新用途，为 消费者提供了崭新的产品，且使普通的农产品大幅度增值，为玉米进入高效农业做出了 5 东北师范大学硕士学位论文 贡献。因此，应充分利用我国丰富的淀粉资源，采用高新技术，深入开展淀粉发酵微生物 多糖的研究及产品开发，促进以淀粉为发酵原料的工业化生产迅速发展。 三淀粉降解的研究进展 淀粉酶是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称 h 4 1 。在淀粉工业、食品工业以及酿酒行业中被广泛应用。它是最早用于工业化生产并且 迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。人类对淀粉酶的应用开始于几千年前， 但是酶提取出来使用是从十九世纪开始的。1 8 3 3 年，p a y e r 从麦芽糖提取液中加酒精沉 淀获得淀粉酶，1 8 9 6 年日本人高峰让吉用麸皮培养米曲霉，用水提取，再以酒精沉淀得 到淀粉酶做为消化剂，并在美国设厂从事微生物酶的生产和研究。1 9 2 0 年左右，法国人 b i o d i n 和e f f r o n t 等又先后发现枯草芽孢杆菌可以分泌耐热并且活性更高的q 一淀粉 酶，于1 9 2 6 年在德国设厂生产，为微生物酶工业生产奠定了基础h 5 1 。淀粉酶作为工业 酶制剂的重要组成部分，占了酶制剂市场约2 5 的份额m 1 。淀粉酶可广泛应用于饮料的 发酵、青贮饲料的生产、药物的生产、工业副产品的加工以及工业生产废品的利用和处 理等领域。 l 淀粉酶的种类及降解机制 淀粉是高分子碳水化合物，是由单一类型的糖单元组成的多糖。淀粉的基本构成单 位为d 一葡萄糖，葡萄糖脱去水分子后经由糖苷键连接在一起所形成的共价聚合物就是淀 粉分子。淀粉属于多聚葡萄糖，游离葡萄糖的分子式以c 6 h 。：o 。表示，脱水后葡萄糖单位 则为c 6 h ，：0 。，因此淀粉分子可写成( 6 h 。：o 。) 。，n 为不定数。组成淀粉分子的结构单体( 脱 水葡萄糖单位) 的数量称为聚合度，以d p 表示。 水解淀粉的酶制剂按照水解的糖苷键的不同以及水解产物的不同可以分为以下几 种4 7 1 q 一淀粉酶 q 一淀粉酶的国际酶分类编号为e c 3 2 1 1 。 q 一淀粉酶是内切型淀粉酶，它作用于淀粉时是从淀粉分子的内部任意切开q 一1 ，4 键，使淀粉分子迅速降解，失去粘性和碘呈色反应，同时使水解物的还原力增加，这种 现象称液化作用。在以直链淀粉为底物时，反应一般分二步进行，它首先任意切开q 一1 ， 4 键，使直链淀粉迅速水解生成麦芽糖、麦芽三糖和较大分子的寡糖，然后再将麦芽三 糖和寡糖缓缓水解成麦芽糖和葡萄糖。第二步，q 一淀粉酶作用于支链淀粉时，它可以 任意水解q l ，4 键，但不能切开分支点的q 一1 ，6 键，也不能水解分支点附近的q l ， 4 键，而是可以越过q l ，6 键而切开内部的q 一1 ，4 键，因此水解产物中除麦芽糖、葡 萄糖外，还含有一系列的q 一极限糊精( 由4 个或更多的葡萄糖残基所构成的带有q 一1 ， 6 键的寡糖) 。不同来源的q 一淀粉酶所产生的q 一极限糊精的结构不同。由于d 一淀粉酶 水解产物的还原性末端葡萄糖第一位碳原子c 。的光学性质呈q 一型，故称q 一淀粉酶；但 现在q 一淀粉酶的涵义已不是指产物的光学性质，而是指能够任意从淀粉分子内部切开 6 东北师范大学硕士学位论文 q 一1 ，4 键而起液化作用的一类酶。 纯化的q 一淀粉酶在5 0 以上容易失活，但是有大量钙离子存在下，酶的热稳定性 增加。许多的菌株可以产生q 一淀粉酶，如芽孢杆菌的q 一淀粉酶耐酸性较强h 踟枯草芽孢 杆菌q 一淀粉酶，在6 5 稳定。嗜热脂肪芽孢杆菌h 们、凝结芽孢杆菌咖1 的热稳定性更强 阻3 ，前者经8 5 处理2 0 分钟，尚残存酶活7 0 ；后者在钙离子存在下，9 0 时的半衰 期长达9 0 分钟。有的嗜热芽孢杆菌的q 一淀粉酶在1 1 0 仍能液化淀粉啪3 。 淀粉葡萄糖苷酶 淀粉葡萄糖苷酶的国际统一分类编号为e c 3 2 1 3 ，也称q 一1 ，4 葡聚糖葡萄糖 水解酶，俗称糖化酶。 葡萄糖苷酶是一种外切型淀粉酶，能从淀粉分子非还原端依次水解q l ，4 键，切 下葡萄糖单位。它也水解麦芽糖和支链淀粉分支点的q l ，6 键，只是水解速度甚慢， 仅及水解q 一1 ，4 键的1 1 0 。糖化酶从理论来讲，可将淀粉1 0 0 9 6 水解为葡萄糖，但事实 上对淀粉的水解能力随不同来源的微生物酶而不同。根霉的糖化酶可将b 一极限糊精完 全水解，而黑曲霉糖化酶只能水解4 0 。不同来源的糖化酶，在糖化时，适宜温度和p h 值有区别。曲霉为5 5 6 0 ，p h 3 5 5 0 ；根霉为5 0 5 5 ，p h 4 5 5 5 。工业生产的糖 化酶多由霉菌产生，如我国生产的糖化酶大多采用黑曲a s 3 3 4 3 0 9 ( u v 1 1 ) 及其诱变所获 突变株n 一8 7 6 7 、a n l 4 9 、b 1 1 、8 沪7 2 等酬。 b 一淀粉酶 9 一淀粉酶( 又称q 一1 ，4 葡聚糖麦芽糖水解酶，e c 3 2 1 2 ) 是一种外切型淀粉 酶，它作用于淀粉时从非还原性末端依次切开q 一1 ，4 键，生成麦芽糖，与此同时将c 。 构型由q 一型转变称b 一型。 b 一淀粉酶不能水解支链淀粉的q l ，6 键，也不能跨过分支点q 一1 ，6 键而切开 内部的q 一1 ，4 键，故水解支链淀粉是不完全的。由于在生成5 0 一6 5 麦芽糖时就不再进 一步水解而残留下大分子的所谓b 极限糊精，故对于分支密集的糖原，麦芽糖的生成量 只有4 0 9 6 5 0 。b 一淀粉酶也不水解q 一1 ，6 键附近2 3 个q 一1 ，4 键，故b 极限糊精的 侧支外常挂有2 3 个葡萄糖残基。b 一淀粉酶即使作用于直链淀粉时，也只能使淀粉的 7 0 一9 0 水解成麦芽糖。 脱支酶 脱支酶( c e b r a c h i n ge n z y m e s ) 是水解支链淀粉或糖原等大分子化合物中的q 一1 ， 6 糖苷键的酶。它切开分支点的q l ，6 键而使整个侧支切下成为短直链糊精，以利于 b 一淀粉酶的作用。根据它的作用方式，可将脱支酶分为直链脱支酶和间接脱支酶两大 类，前者可水解未经改性的支链淀粉或糖原中的a l ，6 键，而间接脱支酶只能作用于 已由其他酶改性的支链淀粉或糖原。根据对底物专一性的不同，直链脱支酶又可分成支 链淀粉酶( 普鲁兰酶) 和异淀粉酶。两者之间区别在于前者可水解普鲁兰糖( 系一种由 微生物合成的多糖，是由麦芽三糖通过q 一1 ，6 键连接成的聚合物) ，而后者则不能水解。 而且两者的作用最小底物也是不同的，支链淀粉酶的最小底物是6 2 一q 一麦芽糖基麦芽 糖。而异淀粉酶的最小底物为6 3 一麦芽三糖基麦芽四糖。 7 东北师范大学硕士学位论文 支链淀粉酶 一些植物和微生物可生产支链淀粉酶( 又称普鲁兰酶，p u l l u l a n a s e ， e c 3 2 1 4 1 ) ，来自植物的酶又叫r 酶。工业上用的支链淀粉酶由微生物制取。生产 支链淀粉酶的微生物有产气气杆菌( a e r o b a c t e ra e r o g e n g e s ) 、蜡状芽孢杆 菌覃状变异株( b a c c e r u sv a r ，m y c o l e s ) 和酸性解普兰芽孢杆菌( b a c a c i d o p u l l u l y t i e n s ) 等，此外，在放线菌、地衣芽孢杆菌、黄杆菌中也存在产酶活力很强 的菌株。 异淀粉酶 由假单胞杆菌、酵母等生成的脱支酶称异淀粉酶( i s o a m y l a s e ，e c 3 2 6 8 ) 。它 与支链淀粉酶的主要区别在于：1 ) 能水解线性多糖普鲁兰糖；2 ) 催化糖原a l ，6 键 的水解，但却不能水解b 一极限糊精分子上由2 3 个葡萄糖残基所构成的侧支，故与p 一 淀粉酶一起作用于淀粉时，不能1 0 0 水解成麦芽糖，只有先用异淀粉酶脱支，使之成为 直链糊精后，再用b 一淀粉酶作用才可定量生成麦芽糖； 3 ) 淀粉酶只水解构成分支的q l ，6 键，而对直链分子的q l ，6 键无作用。 葡萄糖异构酶 根据国际生化协会的酶分类法，此酶属于e c 5 3 1 5 。此酶在1 9 7 2 年修订酶的分 类时，已给了葡萄糖异构酶一个新的酶号，定为e c 5 3 1 1 8 。m a r s h a l l 等将嗜水假 单胞杆菌( 风盯面黼s 咖7 ) j 如) 培养在以d 一木糖为碳源培养基上时，发现菌体内 积累了葡萄糖异构酶。此后经多人研究，知道了很多微生物能产生葡萄糖异构酶。 麦芽低聚糖的生成酶 麦芽低聚糖( m a l t o o l i g o s a c c h a r i d e ) 是由淀粉制成的，由2 一1 0 个葡萄糖分子聚 合而成的糖。淀粉通常是由直链淀粉和支链淀粉以2 ：8 的比例组成的巨大分子糖，直 链淀粉是葡萄糖以数个a 一1 ，4 键结合而成的高分子糖，支链淀粉由2 3 万个葡萄糖结 合而成，其中4 以q 一1 ，6 键结合，其他为q l ，4 键结合，因此，通过分解淀粉而生成 的糖种类很多。以q 一1 ，4 键结合的直链麦芽低聚糖有麦芽糖( g 。) 、麦芽三糖( g 。) 、四 糖( g 。) 、五糖( g 5 ) 、六糖( g 6 ) 、七糖( g ，) 、八糖( g 。) 、九糖( g 9 ) 、十糖( g 。) 由支 链淀粉的分支部分而得到分子内具矿l ，6 键的分支低聚糖则有异麦芽糖、异麦芽三糖 由譬 寸。 工业上生产麦芽糖，常用来源于植物( 大豆或者麸皮) 的b 一淀粉酶，然而生产( g 8 ) 以上的低聚糖，由于没有高效生产用酶，无法工业生产。近来以微生物为来源生成麦芽 低聚糖的特异性酶相继被发现，从而促进了麦芽低聚糖的生产。此种酶水解淀粉的产物 是特定数量聚合的麦芽低聚糖。 2 淀粉酶的性质 微生物产淀粉酶主要是q 一淀粉酶和b 一淀粉酶。 q 一淀粉酶的性质 不同来源的a 一淀粉酶的酶学和理化性质有一定的区别，它们的性质对在其工业应 8 东北师范大学硕士学位论文 用中的应用影响也较大，在工业生产中要根据需要使用合适来源的酶，因此对淀粉酶 性质的研究也显得比较重要。 底物特异性 q 一淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也 各不相同，通常q 一淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生 物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。 最适p h 和最适温度 反应温度和p h 对酶活力影响较大，不同来源的q 一淀粉酶有各自的最适作用p h 和 最适作用温度，通常在最适作用p h 和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件 下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。因此，在工业应用中应了解不 同的酶最适p h 和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很 重要的。通常情况下q 一淀粉酶的最适作用p h 一般在2 到1 2 之间变化。真菌和细菌类 q 一淀粉酶的最适p h 在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌q 一淀粉酶的最适p h 为3 ，碱 性q 一淀粉酶的最适p h 在9 1 2 。另外，温度和钙离子对一些q 一淀粉酶的最适p h 有一 定的影响，会改变其最适作用范围。不同微生物来源的q 一淀粉酶的最适作用温度存在 着较大差异，其中最适作用温度最低的只有2 5 一3 0 ，而最高的能达到l o o 一1 3 0 。 另外，钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响嘲1 。 金属离子对酶稳定性的影响 q 一淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用。另外， 巯基，n 一溴琥珀酸亚胺，p 一羟基汞苯甲酸，碘乙酸，b s a ，e d t a 和e g t a 等对q 一淀粉 酶也有抑制作用。q 一淀粉酶中至少包含一个c a 2 + ，c a 2 + 使酶分子保持适当的构象，从而 维持其最大的活性和稳定性。c a 2 + 对q 一淀粉酶的亲和能力比其它离子强，其结合钙的数 量在1 到l o 之间。结晶高峰淀粉酶a ( t 从) 包含l o 个c a 2 + ，但只有一个结合很牢固。 通常情况下结合一个c a 2 + 就足以使q 一淀粉酶很稳定。用e d t a