环境生物技术备考材料00.doc

绪论补充：现代生物技术以DNA 重组技术的建立为标志，包括基因工程、酶工程、细胞工程、发酵工程。其中基因工程是核心。1. 生物技术：以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其它基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。（1986年国家科委中国生物技术政策纲要）2. 现代环境生物技术 ：指直接或间接利用生物或生物体的某些组成部分或某些机能，建立降低或消除污染物产生的生产工艺，或者能够认识环境过程、高效净化环境污染、同时又生产有用物质的工程技术。特点：是生物技术的一个分支学科，除了包括生物技术所有的基础和特色之外，还必须与污染防治工程及其它工程技术相结合。 第一章 酶工程1. 酶：酶是一类特殊的催化剂。补充：酶（传统定义）：酶是生物体产生的具有催化功能的特殊蛋白质。酶（现代定义）：酶是生物体产生的具有催化功能的特殊生物大分子。（酶的本性不局限于蛋白质）这一点毫无疑问。2. 酶工程：利用酶的催化作用进行物质转化(合成有用物、分解有害物)的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术。 酶工程的内容包括：酶的生产、酶的分离纯化、酶分子改造、酶反应器（酶固定化）、酶的应用。3. 酶的催化特性：催化效率高；底物专一性；反应可逆性；反应条件温和，常温、常压、接近中性的酸碱度；酶活力的可调节性。4. 酶具有高催化能力的原因： 酶可以极大地降低反应所需的活化能。酶促反应所需的活化能远低于非酶催化反应，更低于非催化反应。酶催化是多种催化因素的协同作用，形成酶催化高效性的主要因素有：酶与底物的邻近效应和定向效应，酶与底物相互诱导的扭曲变形和构象变化的催化效应，广义的酸碱催化，共价催化及酶活性中心微环境的影响。5. 酶的调控方式: (1)酶浓度的调节酶浓度的调节主要有两种方式：一种是诱导或抑制酶的合成；一种是调节酶的降解。(2)生理调节或激素调节这种调节也和生物合成有关，但调节方式有所不同。(3)共价修饰调节这种调节方式本身又是通过酶催化进行的。在一种酶分子上，共价地引入一个基团，从而改变它的活性。引入的基团又可以通过第三种酶的催化除去。常见的引入的基团是磷酰基。磷酸化酶和使它磷酰化的激酶以及糖原合成酶就是以这种方式调节它们的活性的。(4)酶原的活化一些酶在体内是以一种非活化的前体形式合成出来的，叫做酶原。酶原的活化是指体内合成的非活化的酶的前体，在适当条件下，受到氢离子或特异的蛋白酶限制性水解，切去某段肽或断开酶原分子上某个肽键而转变为活性的酶。(5)抑制剂的调节酶的活力受到大分子抑制剂或小分子物质抑制，从而影响它们的活力。 (6)反馈调节: (终端产物抑制, 反馈抑制)(7)金属离子和其它小分子化合物调节有一些酶需要K+活化，Na+ 往往可以代替K+，但Na+不能活化这些酶，有时还有抑制作用。丙酮酸羧化酶是催化从丙酮酸合成葡萄糖的限速步骤的一种酶，丙酮酸的浓度影响这种酶的活性。6. 影响酶反应的因素1. pH的影响酸或碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶活性丧失，这种失活或者可逆或者不可逆;酸或碱影响酶活性部位催化基团的解离状态，使得底物不能分解成产物;酸或碱影响酶活性部位结合基团的解离状态，使得底物不能和它结合;酸或碱影响了底物的解离状态，或者使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物。2.温度从温血动物组织中提出的酶，最适温度一般在35至40之间，植物酶的最适温度稍高，在40-50之间，从细菌中分离出的某些酶(如Taq DNA聚合酶)的最适温度可达70。3. 酶浓度的影响在酶促反应中，如果底物浓度足够大，足够使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。4. 抑制剂的影响凡是阻遏反应速度的作用，都可称之为抑制作用，引起抑制作用的物质，叫做抑制剂。按抑制作用方式分：(1)不可逆抑制:抑制剂与酶的某些必需基团以共价键的方式作用，引起了酶活性丧失。抑制剂和酶作用后不能用物理的方法，如透析、超滤等除去抑制剂恢复酶活性(2)可逆抑制:抑制剂与酶以非共价键方式可逆结合，阻遏酶活性，而酶的活性在用物理方法除去抑制剂后能完全恢复(1)竞争性抑制作用(competitive inhibition)抑制剂可与酶的活性中心，与底物竞争，阻止底物与酶的结合，降低酶反应速度。可以通过增加底物浓度而解除这种抑制作用。Vmax不变，Km增大。(2)非竞争性抑制作用(noncompetitive inhibition)酶可以同时与底物及抑制剂结合，两者没有竞争作用。但中间产物EIS不能进一步分解成产物，因此酶活性降低。这类抑制剂与酶活性中心以外的基团相结合。Km不变，Vmax变小5. 底物抑制（Substrate Inhibition）底物抑制也是单底物酶促反应中一种重要的抑制作用。该类抑制的速度随底物浓度的变化曲线，不呈双曲线规律，而是速度达最大值后，如果底物浓度再进一步增加，速度就急剧下降。7. 酶的分离纯化的主要方法 物质间性质的差异设计的分离纯化方法 溶解度的差异盐析法, PEG沉淀法, 有机溶剂沉淀法, 等电点沉淀法热稳定性差异热处理法电荷性质的差异离子交换层析法 , 电泳法 分子大小和形状的差异 凝胶过滤法, 超滤法, 透析法, 离心法亲和层析法亲和力的差异疏水层析法疏水作用的差异 双水相系统萃取法 分配系数的差异8. 酶的分离提纯可分为四个要点：酶源选材，匀浆方法，分离步骤，结晶方法。(一) 酶抽提酶抽提是将酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来，并提取收集的过程。由于酶的种类繁多，稳定性不同，且它们所在的组织，细胞结构与强度也各异，因此，依酶在生物体中存在的不同部位及状态，须采用不同的方法，把细胞破碎，再将内溶物提取出来。 （注意低温操作）(二) 酶的分离纯化经过细胞破碎及提取过程，得到了含目的酶的无细胞提取物，称粗提取物（Crude extract）。要从中得到目的酶，尚需经过许多步骤，可先使用一些沉淀技术，将粗提取物初步分离一下。目的：将不同种类的生物质大致区分开,将含目的酶的粗蛋白质混合液浓缩，以减小体积1. 沉淀技术常用的沉淀方法：盐析法，PEG沉淀法，等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法，热处理沉淀法等。(1) 盐析法 - 初提纯步骤 低浓度的中性盐可增加电解质类物质（蛋白质，酶及其复合物）的溶解度，称为盐溶（Salting in）；但当盐浓度继续增加时，蛋白质的溶解度反而降低而使其溶解出来，称为盐析（Salting out）。盐析法就是建立在此原理上的一种简便有效的分离方法。l 基本原理：盐析过程中，盐离子与蛋白质分子争夺水分子，减弱了蛋白质的水合程度，使蛋白质溶解度降低；盐离子所带的电荷部分中和了蛋白质分子上所带的电荷，使其静电荷减少，也易使蛋白质沉淀。由于各种蛋白质有不同的分子量和等电点，所以不同的蛋白质将会在不同的盐浓度下析出。（NH4)2SO4是常用的盐，因其在水中溶解度大，且受温度影响小，对酶无害处，且起稳定作用，分级效果好且价廉易得。l 影响因素： 蛋白质的浓度：一般，蛋白质浓度越低，各组分间的相互作用越小，分离效果越好。 介质的pH： pI处的溶解度最低。 温度：由于中性盐对蛋白质有一定的保护作用，故可以在室温下进行盐析操作。但分离对温度敏感的蛋白质和酶时，最好在4下进行. 盐类型：单价盐对沉淀蛋白质效果很差。(2) PEG沉淀法聚乙二醇（Polyethylene glycol，简称PEG）是水溶性非离子型聚合物，其分子式为：HO-(CH2-CH2-O-)n H,n4。 用PEG分离蛋白质与用(NH4)2SO4一样有效，且PEG对蛋白质的活性构象起保护作用，所以，近年来被广泛用作蛋白质分离的有效沉淀剂。l 基本原理：空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。l 影响沉淀过程的因素： 蛋白质的分子量及蛋白质浓度 pH 值：pH接近蛋白质的pI 离子强度：一般地，低离子强度（0.3mol以下）对沉淀影响不大，而离子强度过高（2.5mol以上）则影响沉淀作用，使分段效果不明显。 温度：因PEG对酶有稳定作用，故在0-30都可以应用PEG沉淀法。一般，以20时分辨力最高，10以下则分辨力下降。 EG聚合度：目前多采用PEG 6000, 浓度10g/l。(3) 有机溶剂沉淀法随有机溶剂的加入，介质的介电常数（Dielectric constant）下降，使蛋白质分子间的静电作用力增强；同时，有机溶剂还可降低蛋白质分子表面的水合程度，从而导致蛋白质溶解度下降，直至最后沉淀下来。常用的有机溶剂有：乙醇，丙酮等。由于有机溶剂能使酶变性，一般应在低温下操作。同时加入适量中性盐，可增加蛋白质溶解度，降低变性作用，并提高分级效果。(4) 等电点沉淀法蛋白质在其等电点（pI）处，其净电荷为零，分子间的排斥力最小，其溶解度最低，易于沉淀。调节介质的pH，把目的酶与杂质蛋白分开。(5) 热变性沉淀法为一种条件剧烈的方法，如目的酶对热敏感，则不可使用。2. 层析技术层析分离是利用混合物中各组份的物理化学性质(分子的大小和形状，分子极性(电荷)、吸附力，分子亲合力和分配系数等)的不同，使各组份在两相中的分布程度不同而达到分离。层析分离中一个相是固定的，称为固定相，另一相是流动的，称为流动相。当流动相流经固定相时，各组份的移动速度不同，从而使不同的组份分离纯化。酶纯化中常用的有：凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、高压液相层析等。(1) 凝胶过滤层析 （Gel Filtration Chromatography）（又称凝胶过滤，分子筛层析，凝胶渗透层析，排阻层析。）它是依据分子筛效应，按分子的大小及形状来分离样品。用途： 分离纯化；蛋白质分子量的测定；脱盐 此法具有条件温和，操作简便，分离范围广，回收率高，层析柱可反复使用，无需再生处理等优点。(2) 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）1956年，Sober和 Peterson首次将离子交换基团结合到纤维素上，并成功地用于蛋白质分离。基本原理：蛋白质是两性电解质，不同蛋白质由于其pI不同，在同一种pH值介质中电离状况会不同，分子所带电荷种类和数量就不同，与离子交换剂的静电吸附能力亦不同。通过先吸附，洗脱时改变洗脱液离子强度或pH值，洗脱，使蛋白质依据其静电吸附能力由弱到强的顺序而分离开来。主要用途：酶的分离与纯化优点：条件比较温和，分辨率比较高补充：1. 对已知等电点的物质，在高于其等电点的pH值，用阴离子交换剂洗脱；低于等电点的pH值时，用阳离子交换剂洗脱。2. 对未知等电点的物质，利用电泳分析，向阳极移动较快的物质，用阴离子交换剂洗脱；反之，向阴极移动较快的物质，用阳离子交换剂洗脱。(3) 亲合层析（Affinity Chromatography）亲合层析是利用被分离物质的生化功能来提纯蛋白质，即所谓“功能性提纯”（Functional Purification）。它是利用生物高分子有和某些分子专一性相结合的特点，如：酶分子能和其专一底物、抑制剂、辅助因子或效应物通过某些次生键相互结合形成中间复合物。这类专一结合的分子称为配基（Ligand）。生物高分子与配基之间形成中间复合物的能力称为亲合力（Affinity）。(4) 高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)2-8mm的分离柱，填充颗粒平均直径50 m。高压（150-300kg/cm2, 10-200atm)，流动相线速度高（0.1-5cm/s)。检测器（UV, 荧光）。高分辨率，高速度，分离与检测同时。高效液相色谱是近年来迅速发展起来的一种新型分析、分离技术、它具有效率高、速度快、灵敏度高、易于自动化等优点。3. 电泳技术电泳(electrophoresis)是带电物质在直流电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。原理：表面电荷的差异,分子的大小用途：酶的纯化；酶纯度鉴定；理化性质测定(如pI，亚基分子量等)区带电泳：样品溶液在一惰性支持物上进行电泳的过程。(1) 聚丙稀酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）1959年，B.J.Davis首先报道了聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是一种多孔凝胶，俗称“电泳分子筛”。优点：具有很高的分辨力；机械强度好；化学稳定性好，透明而有弹性；对pH和温度变化稳定；非特意性吸附和电渗都很小。l 连续凝胶电泳连续凝胶电泳是采用相同的凝胶，即采用相同浓度的单体和交联剂，用相同pH值和相同浓度的缓冲溶液制备成连续均匀的凝胶，然后在同一条件下进行电泳。在电泳过程中，生物大分子按照分子大小和净电荷的不同而具有不同的迁移率，从而被此相互分开。l 不连续凝胶电泳所谓不连续，是指凝胶孔径大小，缓冲液成分及pH不连续的，并在电场中形成不连续的电位梯度，从而使样品浓缩成一个极窄的起始区带。这样可以通过三个物理效应来提高分辩力：浓缩效应；分子筛效应；电荷效应。l 浓度梯度凝胶电泳浓度梯度凝胶电泳使用的凝胶，其丙烯酰胺浓度由上至下形成由低到高的连续梯度。梯度凝胶内部孔经由上而下逐渐减小，电泳后不同分子量的物质停留在与其大小相对应的位置上，因此，浓度梯度凝胶电泳适用于测定蛋白质分子的分子量。(2) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在聚丙烯酰胺凝胶制备时，加入12%的十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)，制成SDS-聚丙烯酰胺凝胶。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质的分子量。SDS是一种阴离子表面活性剂，在还原剂(如疏基乙醇)存在下，SDS能破坏蛋白质亚基间的非共价健，使含有亚基的蛋白质解离成单个的亚基。由于SDS阴离子带负电荷，SDS-蛋白质复合物上结合的大量阴离子，掩盖了蛋白质之间原来的电荷的差异SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的变化，在水溶液中都变成椭圆形，其短轴长度都为18A左右，而其长轴长度则与蛋白质分子量成正比。为此，SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受其原有电荷和分子形状的影响，而只决定于蛋白质的分子量。 (3) 等点聚焦（Isoelectric Focusing，IEF） 等电聚焦是在1966年，Vesterberg等人合成载体两性电解质以后才发展起来的电泳技术。已成功地用于蛋白质的分离纯化及其等电点的测定。原理：带有电荷的蛋白质分子可在电场中泳动，其电泳迁移率随其所带电荷不同而彼此不同。等电聚焦就是在电解槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度。当把两性大分子放入此体系中时，不同的大分子即移动并聚焦于相当其等电点pH的位置。 用途：（1）依等电点的不同将两性大分子彼此分开，分辨率高，可用于分析和制备；（2）测定等电点，以鉴定蛋白质。在等电聚焦后，测定蛋白质最高浓度部位的pH值，即其等电点pI值。其分辨率可高达0.01 pH单位。9. 酶分子的改造酶作为生物催化剂，具有催化效率高、专一性强和作用条件温和等显著的特点，但是在另一方面，酶也具有稳定性差、活力不够高以及具有抗原性等弱点，使酶的应用受到限制。目前进行的主要工作：l 设法使酶的活性结构加固, 增加其稳定性l 通过化学修饰使或酶法修饰改变酶的活性l 消除免疫性或抗原性以利于医用补充：1、 酶分子的主链修饰：切断或链接酶分子的主链，使酶分子的化学结构及空间结构发生某些变化，从而改变酶的性质及功能。2、 酶分子侧链基团修饰：采用一定的方法（一般是化学方法）使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶的特性及功能。3、 生物酶工程：又称高级酶工程，是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。10. 酶的固定化酶使用过程中的一些问题：稳定性较差；酶一般都是在水溶液中与底物反应，具有活性酶难于回收利用。成本较高，而且难于连续化生产；酶反应后杂质与产物混在一起，给进一步的分离纯化带来一定的困难。 将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶的固定化方法归纳起来可分为3类：吸附法；结合法；包埋法。 (1)吸附法利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称为吸附法。物理吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。优点：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。缺点：结合力较弱，容易脱落(2)包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等凝胶包埋法：凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。半透膜包埋法：半透膜包埋法是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。 (3)结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶。共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。酶固定化后性质的变化： 活性降低； 对环境(pH、温度）等的适应能力提高；Km增大； Vmax不变。11. 酶工程的重点研究领域为： 生物传感器的研究：生物传感器为酶工程开拓了新的发展领域。 多酶反应器的研究：多酶反应器是使生物技术工程转化为产业的关键技术。 酶的改造和新酶的开发：基因工程和蛋白质工程为酶的开发和改造提供了新途径 酶的分离提纯技术：是酶的研究和应用的基础。 酶的应用领域的扩展和生产工艺的改进。第一章 基因工程1. 基因工程：将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作。补充：基因工程的步骤为：切、接、转、增、检。2. 基因工程是在分子水平有上对基因进行操作的复杂技术，基因工程的实施至少要四个必要条件：工具酶；基因；载体； 受体细胞。3. DNA重组技术的意义 使得生物技术过程中生物转化环节的优化更为有效 制造一些具有优良性状的生物（高效菌株，不仅仅是分离）原核生物及真核生物细胞都可以作为生物工厂来生产胰岛素、干扰素、生长激素、病毒抗原等大量外源蛋白 简化许多有用化合物和大分子的生产过程 简化新药的开发与检测系统图1基因重组的一般步骤4. 变性(denaturation)或熔解(melting) 在加热或某些试剂的作用下，DNA配对碱基之间的氢键结构受到破坏，双链DNA的多核苷酸链能完全分离，变性的DNA为单链DNA。能使DNA变性的试剂称为变性剂。如尿素、甲酰胺等。影响因素（1）外部条件，温度、变性剂；（2）DNA分子本身的稳定性。如G+C含量高的DNA分子就比较稳定。现象：（1）溶液黏度降低；（2）沉降速率加快；（3）紫外吸收值升高研究DNA变性过程常用的方法是光吸收法(260nm处)。升高温度可使DNA变性，且变性作用在很窄的温度范围内发生，导致紫外吸收作用增强。DNA融点 (melting temperature)。通常以吸光度值达到最大值一半时的温度作为融点温度，以Tm表示 补充：1、 DNA 是分子双螺旋结构，基本单位是脱氧核糖核苷酸，由脱氧核糖、碱基、磷酸基构成的。2、 四种碱基包括：腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胞嘧啶（C），胸腺嘧啶（T）。由碱基携带遗传信息。3、 DNA分子双螺旋结构的理论核心：碱基互补配对原则。5. DNA 的复性变性的DNA在一定条件下能够复性，由单链形成双链。复性的过程为：当两条链互相碰撞，一条链的某个区域遇到了互补的另一条链的配对碱基时，就在这个区段形成双链核心，然后从核心向两侧对应互补链扩大互补配对，最后完成复性过程。显然，复制过程的限制因素是分子间的碰撞过程。 影响DNA复性的因素 DNA分子的大小和顺序复杂性，顺序越复杂，复性的时间越长。样品的浓度：同一种DNA溶液，当浓度高时，互补顺序相碰的机会增加，复性也比较快。 溶液的离子强度：如果两条单链DNA带有很多同性电荷，它们会互相排斥，互补区域碰撞机会少，不易结合。因此在复性溶液中加入一定的盐浓度，以减少斥力，可加快复性速度。 温度：温度低，分子运动的速度减慢，减少了互补链的碰撞机会，同时增加了错配链解链的困难。因此复性一般要求比融点温度(Tm值)低25的条件下进行为宜。6. DNA 杂交当复性的DNA分子由不同来源的两单链分子形成时，称为杂交 (bybridization)。(1) DNA-DNA的同源序列(2) DNA-RNA之间(3) 不同来源的二条DNA单链之间 杂交过程可以在溶液中进行，也可以使一种DNA结合到固相载体上然后进行杂交。 7. 基因工程的工具酶基因工程的关键技术是DNA的连接重组。一般把DNA分子切割、DNA片段修饰和DNA片段连接等所需的酶称为工具酶。基因工程涉及的工具酶种类繁多、功能各异，就其用途可分为三大类：(1)限制性内切酶(restriction endonuclease)；(2)连接酶(ligase)；(3)修饰酶。8. 限制性内切酶 识别和切割dsDNA分子内特殊核苷酸顺序的酶统称为限制性内切酶，简称限制酶（restriction endonedeases）。 dsDNA双链DNA；ssDNA单链DNA从原核生物中已发现了约2300种以上的限制酶，常用的有几十种，可分为三类。型酶，型酶 , 型酶类限制性内切酶是基因工程中使用的主要工具酶。类限制性内切酶的特点：（1）识别特定的核苷酸序列，其长度一般为48个核苷酸且呈二重对称。（2）具有特定的酶切位点，即限制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，由此产生特定的酶切末端。补充：1、 酶切末端：粘性末端、平末端。2、 限制性内切酶对双链DNA分子的作用是切割磷酸二酯键，不管是平末端还是粘性末端，5端一定是磷酸基团，3端一定是羟基集团3、 同裂酶：具有相同识别序列的限制性内切酶。同尾酶：虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生的限制性片段具有相同的粘性末端。4、 限制片段末端连接作用：分子间连接：不同的DNA片段通过互补的粘性末端碱基配对而连接起来。分子内连接：同一DNA片段两个互补末端之间的碱基配对形成环形分子。9. 连接酶用于将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶称为连接酶。它催化DNA 5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。 体外DNA片段的连接方式：（1）用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段（2）用T4DNA连接酶将平端的DNA片段连接起来（3）先在DNA片段的末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化单链的DNA分子，被连接的 DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。10. 修饰酶 DNA聚合酶 (DNA Polymerase) 能够将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端催化核苷酸的聚合作用，而不发生引物从模版上的解离作用。DNA聚合酶在基因工程中的用途：1) DNA分子的体外合成；2) 体外突变；3) DNA片段探针的标记；4) DNA的序列分析；5) DNA分子的修复；6) 聚合酶链式反应(PCR)等。目前常用的DNA聚合酶有：大肠杆菌DNA聚合酶；大肠杆菌DNA聚合酶大片段（Klenow fragment）；T4噬菌体DNA聚合酶；T7噬菌体DNA聚合酶；耐高温DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）等。耐高温的DNA聚合酶(如Taq)由于其最佳作用温度为75-80，目前广泛用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR)及DNA测序。 逆转录酶逆转录酶是一种有效地转录RNA产生cDNA的酶。产物DNA称cDNA，即互补DNA (complementary DNA)，该酶又称为依赖于RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)。逆转录酶在基因工程中的主要用途是以真核mRNA为模板，合成cDNA，用以组建cDNA文库，进而分离为特定蛋白质编码的基因。 T4多核苷酸酶T4 多核苷酸酶催化ATP的 g-磷酸基转移至DNA或RNA片段的5-未端。在基因工程中主要用于：1) 标记DNA片段的5- 端，制备杂交探针；2) 基因化学合成中，寡核苷酸片段5- 磷酸化；3) 用于测序引物的5- 磷酸标记。 碱性磷酸酶碱性磷酸酶的功能是去除DNA或RNA 5- 未端的磷酸基。碱性磷酸酶可用于：1)去除DNA片段5磷酸，以防止在重组中的自身环化，以提高重组效率。2)在用r-32PATP标记DNA或RNA的5-磷酸前，去除DNA或RNA片段的非标记5-磷酸。11. 几种重要的工具酶及其用途12. 基因工程载体（vector）承载体外源DNA片段（基因）,并将其带入受体细胞的传递者。 基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达。目前已构建应用的基因工程载体主要有: 质粒载体；噬菌体载体；病毒载体；人工构建的组合载体。作为DNA重组的载体最基本的两条要求：1、自主复制能力 2、可利用的限制酶切点。载体的必备条件：1、 能够进入宿主细胞；2、 可以在宿主细胞中独立复制，本身就是一个复制子；3、 有筛选标记4、 对于多种限制性内切酶有单一或较少的切点，最好是单一切点。13. 质粒载体 质粒 (plasmid)是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个DNA分子，其大小可从1 kb到200 kb 。 质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。质粒DNA的特点为：双链环状；分子量很小；自主或半自主复制；不同生物质粒中的基因种类不同。每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。质粒的复制和遗传独立于染色体，但其复制和转录依赖于宿主所编码的蛋白质和酶。质粒按其复制方式分为:松驰型质粒: 复制不需要质粒编码的功能蛋白，其复制完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶(如DNA聚合酶、，依赖于DNA和RNA聚合酶等)来进行。严紧型质粒: 复制要求同时表达一个由质粒编码的蛋白质。质粒载体必须具备的基本条件：具有复制起点；具有抗菌素抗性基因；具有若干个限制酶单一识别位点；具有较小的分子量和较高的拷贝数。(1)质粒载体 pBR 322pBR 322大小为4363 bp，由人工改造而来，有一个复制起点、一个抗氨苄青霉素因基、一个抗四环素基因、多种限制酶切点（36个），可容纳5kb左右外源DNA。优点:具有较小的分子量，易于自身DNA的纯化及克隆载体的纯化；具有两种抗菌素抗性基因可作转化子的选择记号；具有较高的拷贝数，且经氯霉素扩增后，每个细胞中可累计10003000个拷贝。（2） 质粒载体pUC 18/19这对载体由2686 bp组成，带有pBR 322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子b-半乳糖苷酶基因(lacZ )的调节片段，一个调节lacZ基因表达的阻遏蛋白(repressor)的基因lac I，还有多个单克隆位点。由于pUC质粒含有Ampr抗性基因和lac Z 基因，可以通过颜色反应和Ampr对转化体进行双重筛选。 pUC优点：具有更小的分子量，更高的拷贝数；适用于用组织化学方法检测重组子；具有多克隆位点MSC区段，与M13mp8噬菌体相同的克隆区段14. 噬菌体(Bacterophage)载体噬菌体DNA特点：噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的DNA，最常见的是双链线形DNA, 且感染率高。（个体 尺寸0.02 - 0.3 m m）构建噬菌体载体的基本途径为： 抹去某种限制性内切酶在DNA分子上的一些识别序列，只在非必需区保留1-2个识别序列。若保留1个识别序列，可供外源DNA插入，若保留2个识别序列，则两个识别序列之间的区域可被外源DNA片段置换。 用合适的限制性内切酶切去部分非必需区，但是由此构建的DNA载体不应小于38 kb。 在DNA分子合适区域插入可供选择的标记基因。15. 柯斯质粒载体柯斯质粒载体（cosmid vector）又称粘质粒载体, 是将质粒 (plasmid) 和噬菌体DNA包装有关的区段(cos序列)相结合构建而成的克隆载体。一般构建的cosmid载体小于20 kb，可承载30 kb左右的外源DNA片段，这种载体常用于构建真核生物基因组文库，它综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点 。 柯斯质粒载体的特点 具有噬菌体的特性：可高效转导入大肠杆菌细胞 具有质粒的特性：有质粒的复制子，在寄主细胞中可以像质粒DNA一样进行复制 具有较高的克隆能力：极限可达45kb 具有与同源序列质粒进行重组的能力：与带有同源序列的质粒共存在同一个寄主细胞中时，它们可以形成共和体。 16. 用于真核生物宿主的载体目前所用的真核载体大多是所谓的穿梭载体(shuttle vector)，这种载体可以在原核细胞中复制扩增，也可以在相应的真核细胞中扩增、表达。由于在原核体系中基因的重复、扩增、测序等易于进行，所以利用穿梭载体，首先将要表达的基因装配好后再转到真核细胞中去表达，这为真核细胞基因工程操作提供了很大的方便。 l 酵母质粒酵母的2质粒来自酿酒酵母，内含复制起始区 (ori) 和能够使质粒在受体中稳定存在的STB序列。此质粒为双链环状，6813 bp，与原核生物的质粒不同，2质粒常被组蛋白包围。l 人工染色体载体（1）YAC人工染色体载体复制型载体YAC (酵母人工染色体，yeast artificial chromosome) 是在酵母细胞中克隆外源DNA大片段克隆体系，由酵母染色体中分离出来的DNA复制起始序列，着丝点，端粒以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体 （2）细菌人工染色体（BAC，bacterial artifical chromosome)：以细菌F因子为基础组建的细菌克隆体系（承载300万bp外源DNA）（3）PACS(p1-derived artificial chromosojes)（4）MAC （mammalian artifical chromosome)17. 用于植物宿主的载体 由于植物细胞的特殊结构，外源基因导入植物细胞的方法目前还很有限。1. Ti 质粒Ti 质粒上土壤农杆菌的质粒。土壤农杆菌通过植物伤口侵入植物后，Ti 质粒的T区整合到植物染色体中。T 区的DNA长约20kb，它携带的基因有两个功能：一是决定植物形成冠瘿瘤；二是控制冠瘿碱的合成。 2.植物DNA病毒已知以DNA为遗传物质的植物病毒有花椰菜花叶病毒、雀麦条纹病毒和双生病毒。至今使用很少。3.植物转座子转座子能在植物基因组中频繁转移，有望成为一种新的植物载体。18. 携带外源DNA的载体进入宿主细胞后的两种存在状态：1)结合态：载体和宿主染色体DNA整合在一起，单拷贝，被整合的可以是载体本身加外源DNA，也可以是一部分，但至少要将外源DNA整合；2)并存：即独立存在于宿主细胞中，多拷贝。也有两种状态兼有的。哪一种状态有利要依DNA重组的目的而定。 19. DNA重组使用的载体可以分为三大类（1）克隆载体：以获得大量DNA片段为目的的载体这类载体较小，复制不受寄主的严格控制，即自身有很强的复制能力，在细胞内可以有很高的拷贝数，寄主的DNA复制停止时，这类载体仍能扩增。pBR322、pUC系列、M13系列载体均属于克隆载体。（2）穿梭载体：即能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖。这类载体有真核细胞和原核细胞两种复制点。穿梭载体常用于真核生物DNA片段在原核生物中的繁殖然后再转入真核细胞宿主。（3）表达载体：通过DNA重组，获得高效表达产物。理想的表达载体应当是：高拷贝数，具有强启动子和稳定的mRNA，具有高的分离稳定性和结构稳定性，转化频率高，宿主范围广，插入外源基因容量大而且可以重新完整地切出，复制与转录应和宿主相匹配，最好是可调控的，而且在宿主不生长或低生长速率时仍能高水平地表达目的基因。 20. 目的基因的获得方法：分离DNA文库，cDNA文库；化学合成。21. 基因的组成及分类 基因是具有遗传功能的DNA分子上的片段。平均约含1000 bp。基因根据其功能差异，可分为结构基因、调节基因和操纵基因。 l 结构基因：决定某一种蛋白质分子结构相应的一段DNA，可将携带的特定遗传信息转录给mRNA，再以mRNA为模板合成特定氨基酸序列的蛋白质。一个能转录和翻译的结构基因必须包括转录启动子，基因编码区和转录终止子。l 调节基因：编码控制其他基因表达的RNA或蛋白产物的基因。调节基因带有阻抑蛋白。l 操纵基因：接受调节基因合成的调节蛋白的作用，使结构基因转录活性得以抑制的特定DNA片段。操纵基因位于结构基因的一端，与一系列结构基因合起来形成一个操纵子。调节基因与操纵基因联合工作，控制、操纵结构基因的表达22. 基因库，也叫基因组文库， DNA文库（ DNA libary)是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。将生物细胞基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段，当需要某一片段时，可以在这样的“图书馆”中查找（没有目录）。 基因组DNA文库的用途：分析、分离特定的基因片段，通过染色体步查(chromosome walking)研究基因的组织结构，用于基因表达调控研究，用于人类及动、植物基因组工程的研究等。鉴定文库中带有目的序列的克隆的方法（3种通用的鉴定方法）：用标记的DNA探针做DNA杂交；用抗体对蛋白质进行免疫杂交；对蛋白质的活性进行鉴定。23. 基因文库，也叫cDNA文库 首先获得mRNA，反转录得cDNA，经克隆后形成文库。cDAN文库和基因文库的不同之处在于，cDNA文库除去了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分，便于DNA重组的使用。其复杂性比基因文库低得多。主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序，可根据克隆的cDNA分子的核酸序列直接推倒出来。组建一个cDNA文库的步骤：1)分离表达目的基因的组织或细胞2)从组织或细胞中制备总体RNA和mRNA3）第一条cDNA链的合成，第一条互补DNA链的合成需要RNA模板，cDNA合成引物，逆转录酶，4种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液(Mg2+)等。4)第二条cDNA链的合成5) cDNA的甲基化和接头的加入6)双链cDNA与载体的连接24. DNA 的化学合成 单链DNA短片段的合成已成为分子生物学和生物技术实验室的常规技术。 化学合成DNA分子是把新的脱氧核糖核苷酸加到DNA双链的5端，而在细胞中DNA分子合成的方向恰恰相反。 整个DNA的化学合成过程可以在一个反应柱上连续进行，并且可以对合成过程进行计算机控制。 目前常用的化学合成DNA的方法是磷酰胺法。合成的DNA片段可用于连接成一个长的完整基因，用于扩增目的基因(PCR)、引入突变、作为测序引物，还可用于杂交。25. 受体细胞选择的一般原则根据所用的载体体系及各种受体细胞的基因型进行选择，要使重组体的转化或转染效率高；能稳定传代，受体细胞基因型与载体所含的选择标记匹配；易于筛选重组体以及外源基因可在其内高效表达和稳定积累等。目前已使用的受体细胞有三大类：（1）微生物表达系统最早使用和至今最广泛使用的是大肠杆菌，其次是酵母和枯草杆菌。 （2）植物细胞表达系统因在植物细胞使用的载体很有限，目前主要是农杆菌介导，双子叶植物表达系统使用较多。（3）动物细胞表达系统昆虫细胞既能表达原核基因，又可表达哺乳动物基因，且有较强的分泌能力和修饰能力。26. 重组体DNA分子导入受体细胞高等动、植物细胞宿主：显微注射；电穿孔；细胞学。原核细胞、低等真核生物宿主：转化；转导。27. 转化把纯化的外源DNA分子导入细菌细胞的过程叫转化。原核细胞的转化过程就是一个导入外源DNA的过程。一般是将作为受体细胞的细菌放在一定浓度的冰冷CaCl2(50-100mmol/l)溶液中处理后，制成感受态细胞，然后至于42高温热激90s的方法帮助其吸收外源DNA。感受态细胞(competent cells)是指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。为制备感受态细胞，应注意以下几点：(1)在最适培养条件下培养受体细胞至对数生长期，培养时一般控制受体细胞密度OD600在0.4左右；(2)制备的整个过程控制在04(3)为提高转化率，可选用复合CaCl2溶液。28. 高压电穿孔法电穿孔(electroporation)法: 把宿主细胞置于一个外加电场中，通过电场脉冲在细胞壁上打孔，DNA分子随即进入细胞。原理：细胞膜(其基本组成为磷脂)，在适当的外加脉冲电场作用下，细胞膜由于电位差太大而呈现不稳定状态，从而产生孔隙使高分子（如ATP）和低分子物质得以进入细胞质内，但还不至于使细胞受到致命伤害，当移动外加电场后，被击穿的膜孔可自行复原。高压电穿孔的操作条件 电压太低，DNA不能进入细胞膜；电压太高，细胞产生不可逆损伤，故应在300-600 V为宜； 时间20-100 ms； 温度00C为宜，使穿孔修复迟缓，DNA进入机会多应用对象：动物细胞，原核细胞。 29. 多聚物介导法原理：多聚物同二价阳离子(如Mg2+,Ca2+,Mn2+等)和DNA混合，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，使DNA进入细胞内。常用试剂：聚乙二醇(PEG)，多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物，尤以PEG应用最广。应用对象：酵母细胞以及其它真菌细胞。操作方法：处于对数生长期的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶处理变成球形体后，在适当浓度的聚乙二醇6000(PEG 6000)的介导下将外源DNA导入受体细胞中。30. 磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染法这是将外源基因导入哺乳类动物细胞进行瞬时表达的常规方法。磷酸钙转染法的基本原理：哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。操作方法：先将重组DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，随后形成DNA-磷酸钙沉淀，粘附在细胞表面，通过内吞作用进入受体细胞。 31. 原生质体融合法将带重组质粒的细菌原生质体同受体细胞进行短暂的共培养，经过细胞膜融合，将重组DNA导入细胞。32. 脂质体介导法脂质体(liposome)是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，把用来转染的DNA分子包在其中，通过脂质体与细胞接触，将外源DNA分子导入受体细胞。原理：细胞膜表面带负电荷，脂质颗粒带正电荷，以电荷间引力将DNA、mRNA及单链RNA导入细胞内。该法的优点是稳定、温和。33. 显微注射法利用哺乳动物细胞便于注射的特性，将外源DNA分子通过显微注射法直接注入细胞。34. 粒子轰击法(particle bombardment)金属微粒在外力作用下达到一定速度后，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，仍能维持正常的生命活动。利用这一特性，先将含目的基因的外源DNA同钨、金等金属微粒混合，使DNA吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，通过氦气冲击波使DNA随高速金属微粒进入植物细胞，此方法可直接处理植物器管或组织，是当今普遍应用的植物转基因方法。35. 激光微束穿孔法利用直径很小、能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理，用激光处理细胞，处于细胞周围的重组DNA随之进入细胞。此方法适用于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。36. 两类表达系统：瞬时表达系统：进入宿主的目的DNA如果没有和宿主DNA整合，随着细胞生长，宿主内目的基因数量递减少直至消失，表达过程因此只能持续数天，这样的表达系统为瞬时表达系统。稳定表达系统：如果目的基因整合到宿主染色体DNA中稳定遗传，则成为稳定表达系统。（以表达产物为DNA重组目的时，需要有稳定表达系统。） 37. 目前重组体筛选的方法很多，概括起来有三类：（1）生物学方法：包括遗传学方法、免疫学方法和噬菌斑的形成等；（2）核酸杂交：通过DNA-DNA、DNA-RNA碱基配对的原理进行筛选，以探针的使用为核心，包括原位杂交、Southen杂交、Northen杂交等；（3）物理方法：如用电泳法等。38. 遗传学方法（1）利用抗生素抗性基因 对于带有两种抗性