（临床兽医学专业论文）cjun对基础状态下仔猪睾丸间质细胞增殖的影响.pdf

e f f e 目录 摘要 i a b s t r a c t i i 第一章文献综述 o q o o ooboooeoog gq l 1 1 细胞增殖研究进展 1 1 1 1 细胞周期的控制机制 1 1 1 2 细胞增殖调控 3 1 2c j u n 与细胞增殖 4 1 2 1 原癌基因概述 4 1 2 2c j u n 及表达产物的结构特征与功能 6 1 2 3c j u n 在各组织中的表达 7 1 2 4c j u n 对细胞增殖的调控 8 1 3 睾丸间质细胞与c j u n 9 1 3 1 睾丸间质细胞的生物功能及其调控 9 1 3 2c j u n 对睾丸间质细胞及其功能的影响 9 第二章引言 l 1 第三章实验材料与方法 1 2 3 1 实验材料 1 2 3 1 1 实验动物 1 2 3 1 2 主要试剂及耗材 1 2 3 1 3 试剂配制 13 3 1 4 主要仪器 1 4 3 2 实验方法 15 3 2 1 细胞培养及实验分组 1 5 3 2 2 检测睾丸间质细胞中c j u nm r n a 的表达 1 6 3 2 3m t t 法检测间质细胞生长抑制率 一1 7 3 2 4 流式细胞术检测细胞周期 1 7 3 2 5 统计学分析 18 第四章实验结果 1 9 4 1 体外培养仔猪睾丸间质细胞的鉴定 o g wooo o 1 9 4 1 1 活力测定 1 9 4 1 2 纯度鉴定 1 9 4 1 3 睾酮分泌功能鉴定 1 9 4 2 总r n a 的浓度测定以及纯度和完整性鉴定 2 0 4 3 目的基因和参照基因的扩增效率比较 2 1 4 4 不同浓度c j u na s o d n s 处理后睾丸间质细胞中c j u nm r n a 的表达 2 2 4 5 不同浓度c j u na s o d n s 对睾丸闾质细胞增殖的影响 2 2 4 6 不同浓度c j u n a s o d n s 对睾丸间质细胞周期的影响 2 3 第五章讨论 2 5 第六章结论 2 7 参考文献 2 8 致谢 3 4 在校期间发表的论文 3 5 西南大学硕十学位论文 捅要 i i c j u n 对基础状态下仔猪睾丸间质细胞增殖的 影响 临床兽医学硕士研究生姚银竹 指导老师郑小波副教授 摘要 睾丸间质细胞是产生睾酮的主要分泌细胞 它利用多种酶将胆固醇逐步合成睾酮 其睾 酮分泌作用受促性腺激素 生长因子等多种因素的调控 大量研究表明 这些因素实际上是 通过调控与之有关的原癌基因表达来实现的 但无论如何 最终都要通过影响睾丸间质细胞 生成睾酮的能力起作用 而这种能力包括睾丸间质细胞的数量以及单个睾丸间质细胞的睾酮 合成能力 细胞的数量与睾丸间质细胞的增殖 凋亡有关 单个睾丸间质细胞的睾酮合成就 取决于其细胞内睾酮合成相关酶的活性 c j u n 作为睾丸间质细胞睾酮分泌过程的原癌基因之 一 具有促进睾酮分泌的作用 但究竟c j u n 是影响睾丸间质细胞数量或者影响单个睾丸间质 睾酮合成相关酶 目前还不清楚 有研究表明 c j u n 对细胞增殖有正性调控作用 因此 本 实验通过研究c j u n 对基础状态下睾丸间质细胞增殖的影响 从而为进一步探索c j u n 在睾酮 分泌中的作用机制提供参考 本实验以3 周龄仔猪为研究对象 采取其睾丸分离获得睾丸间质细胞 经活力 纯度和功 能评价后在体外进行培养 分别以0 1 2 5 0 2 5 o 5 1 2r t m o l l c j u na s o d n s 处理 利用实 时荧光定量p c r 检测c j u i la s o d n s 对睾丸间质细胞c j u nm r n a 的阻断作用 m t t 法检钡t c j u n a s o d n s 对睾丸间质细胞生长的抑制作用 流式细胞术检n c j u na s o d n s 对睾丸间质细胞周期 的影响 以研究c j u n 对基础状态下睾丸间质细胞增殖的影响 经活力 纯度和功能评价后 选择细胞活力在9 5 以上 睾丸间质细胞纯度在9 0 以上且 睾酮分泌功能良好的细胞进行体外培养 经不同浓度c j u na s o d n s 处理后 实时荧光定量p c r 结果显示0 1 2 5l a r n o l lc j u na s o d n s 就能显著下调c j u nm r n a 的表达 p 0 0 1 c j u nm r n a 表达量随着浓度增加而降低 但到1g r n o l l 后c j u nm r n a 表达不再减少 m t t 法检测结果表 明c j u na s o d n s 能明显抑制睾丸间质细胞的生长 芦o 0 1 且浓度与生长抑制率间正相关 r 0 8 9 6 6 通过流式细胞仪检测睾丸间质细胞周期 发现0 1 2 5l a m o l le j u na s o d n s 能显 著减少进入s 期的睾丸间质细胞数量 p o 0 1 而相应被阻滞在g o g 1 期的细胞数量显著增加 鲴o 0 1 与对照组相比 g o g i 期细胞数量百分比分别增加5 7 8 1 1 3 6 1 6 7 3 2 2 2 5 2 3 3 6 通过实验得出以下结论 1 c j u na s o d n s 能有效阻断c j u nm r n a 的表达 2 c j u n a s o d n s 呈剂量依赖性抑制睾丸间质细胞的生长 3 c j u na s o d n s 能将睾丸间质细胞阻滞在g d g l 期 关键词 c j t l r l 仔猪 睾丸间质细胞 增殖 两南大学硕 学位论文a b s t r a c t e f f e c to fc j u no nb a s i cp r o l i f e r a t i o no f p i g l e t sl e y d i g c e l l si nv i t r o c l i n i c a lv e t e r i n a r yp o s t g r a d u a t e y a oy i n z h u s u p e r v i s o r a s s o c i a t ep r o f z h e n gx i a o b o a bs t r a c t l e y d i gc e l l sa r et h e m a i ne x c r e t i n gc e l l sw h i c h a p p l ym u l t i p l ee n z y m e st op r o d u c et e s t o s t e r o n e f r o mc h o l e s t e r 0 1 t h et e s t o s t e r o n es e c r e t i o ni sr e g u l a t e db ym a n yf a c t o r s s u c ha sg o n a d o t r o p h i n s g r o w t hf a c t o r s i nf a c t s e v e r a ls t u d i e si n d i c a t e dt h a tt h e s ef a c t o r sr e g u l a t et e s t o s t e r o n es e c r e t i o n t h r o u g ha d j u s t i n gt h er e l a t e dp r o t o o n c o g e n e s a n y w a y i t su l t i m a t e l yd e c i d e db yt h ec a p a c i t yo f l e y d i gc e l l s t e s t o s t e r o n es y n t h e s i s i n c l u d i n gt h en u m b e ro fl e y d i gc e l l sa n dc a p a c i t yo fs i n g l e c e l l t h ef o r m e rh a sr e l a t i o nt op r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i s t h el a t t e ri sd e t e r m i n e db yt h ea c t i v i t yo f t e s t o s t e r o n es y n t h e s i sr e l a t e de n z y m e s a so n eo fp r o t o o n c o g e n e si np r o c e s so ft e s t o s t e r o n e s y n t h e s i s c j u nc a l lp r o m o t et h et e s t o s t e r o n es e r e c t i o n i t su n k n o w nw h e t h e rc j u nc a na f f e c tt h e n u m b e ro fl e y d i gc e l l so ri tc a ni n f l u e n c et h ea c t i v i t yo fr e l a t e de n z y m e s a l s o i t sr e p o r t e dt h a t c j u nh a sp o s i t i v ec o n t r i b u t i o nt op r o l i f e r a t i o n t h e r e f o r e t h i ss t u d yw a sa i m e dt or e s e a r c ht h ee f f e c t o fc j u no nb a s i cp r o l i f e r a t i o no fp i g l e t sl e y d i gc e l l si nv i t r o t oa p p r o a c ht h em e c h a n i s mo fc j u ni n t e s t o s t e r o n es y n t h e s i s l e y d i gc e l l sw e r ei s o l a t e df r o m3 w e e k s o l dp i g l e t s t e s t i s i t sa c t i v i t y p u r i t ya n df u n c t i o n w e r eq u a l i f i e db e f o r eb e i n gc u l t u r e di nv i t r o t h e nt h e yw e r er e s p e c t i v e l yt r e a t e dw i t h0 12 5 o 2 5 0 5 1a n d2p m o l lc j u n a s o d n s a n dt h ee x p r e s s i o no fc j u nm r n aw e r ed e t e c t e db yf q p c r t os t u d yt h ee f f e c to fc j u no nb a s i cp r o l i f e r a t i o no f p i g l e t sl e y d i gc e l l s g r o w t hi n h i b i t i o nr a t i oo f l e y d i gc e l l sw e r ed e t e c t e db ym t tm e t h o da n dc e l lc y c l ep h a s ed i s t r i b u t i o nw e r ee x a m i n e db y f l o wc y t o m e t e ra n a l y s i s a f t e rh a v i n gb e e nt r e a t e dw i t hc j u n a s o d n s t h r o u g ha c t i v i t y p u r i t ya n df u n c t i o ne v a l u a t i o n e e u sw h o s ea c t i v i t yw a so v e r9 5 p u r i t yw a s o v e r9 0 a n df u n c t i o nw a sv e r yw e l lw e r ec h o s e dt ob ec u l t u r e di nv i t r o t h er e s u l to ff q p c r a s s e ss h o w e d t h a t c j u nm r n ae x p r e s s i o n d e c r e a s e dw i t ht h er a s i n go fc j u n a s o d n s c o n c e n t r a t i o n o n l yo 12 5l a r n o l lc j u na s o d n sc o u l dd e c r e a s et h ee x p r e s s i o no fc j u ng e n e p r e d o m i n a n c e l y p 0 0 1 a n dt h ee x p r e s s i o nn ol o n g e rw e n td o w nw h e nt h ec o n c e n t r a t i o nu pt o1 p m o l l t h r o u g h t ta n a l y s i s i t sf o u n dt h a tc j u na s o d n sc o u l ds i g n i f i c a n t l yi n h i b i tt h eg r o w t h o fl e y d i gc e l l s p o o1 t h e r eh a sp o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nc j u na s o d n sc o n c e n t r a t i o na n d g r o w t hi n h i b i t i o nr a t i oo fl e y d i gc e l l s r 0 8 9 6 6 a f t e rb e i n gd e t e c t e db yf l o wc y t o m e t e r w e f o u n dt h a tt h en u m b e ro fl e y d i gc e l l si nsp h a s ed e p r e s s e ds i g n i f i c a n t l ya n dt h a to fg o g lp h a s e i n c r e a s e da o b v i o u s l y p 如 01 a f t e rt r e a t e dw i t ho 12 5l u n o l lc j u na s o d n s c o m p a r e dw i t ht h e c o n t r o lg r o u p t h ep e r c e n t a g eo fg d g lp h a s ec e l ln u m b e r sr e s p e c t i v e l yr a i s e d5 7 8 11 3 6 16 7 3 2 2 2 5 a n d2 3 3 6 西南大学硕 学位论文 a b s t r a c t i ns u m m a r y c o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s 1 c j u na s o d n s c o u l di n h i b i tt h ee x p r e s s i o no fc j u nm r n ae f f e c t i v e l y 2 c j u na s o d n s c o u l dl o wd o w nt h eg r o w t ho fl e y d i gc e l l sd o s e i n d e p e n d e n t l y 3 c j u na s o d n s c o u l db l o c kc e l l sc y c l eo fl e y d i gc e l l so ng o g 1p h a s e k e yw o r d s c j u n p i g l e t l e y d i gc e l l s p r o l i f e r a t i o n i 两南大学硕十学位论文 文献综述 m l i 一 曼皇曼曼舅舅舅曼量曼曼曼舅舅 第一章文献综述 1 1 细胞增殖研究进展 细胞增殖 c e l lp r o l i f e r a t i o n 是指通过细胞分裂增加细胞数量的过程 是维持细胞数量平 衡和机体正常功能所必需的 细胞增殖的循环过程就构成了细胞周期 c e l lc y c l e 一个细胞 周期是一个细胞的整个生命过程 即一个细胞经过物质准备并最终分裂为两个全新的细胞 因此对细胞增殖的研究可以通过细胞生长 细胞周期 的研究来实现 1 9 5 3 年 h o w a r d 和 p e l c 提出细胞周期的概念 并将其划分为4 阶段 s 期 d n a 合成期 d 期 有丝分裂期 现称m 期 g l 期 d 期结束至s 期的间隙 g 2 期 s 期结束至d 期的间隙 细胞在细胞 周期中按 g o g l s g 2 一m 顺序完成其增殖1 1 1 1 1 细胞周期的控制机制 细胞周期过程涉及许多重要事件 其中最主要的是一种不可逆的形式 即启动细胞的生 物化学活性 从一种状态进入另一种状态 这些事件称为细胞周期转换 一个完整的细胞周 期通常包括三个重要的转换 依次为 g 1 s 的转换 g 2 m 期的转换以及m 期中期和后期的 转换 经过这些有序的过程后 最终细胞才能自身复制得以增殖 然而各种事件的发生都需 要有序 准时 精确 高度协调的调控机制来实现 在细胞周期过程中有几种监控机制控制 全部的重要事件 从而保证各时期正确 顺利的转换 其中有的是一种稳定的 内在 的控制机 制 这种控制系统能确保细胞周期准确无误地完成 即两个子代细胞的遗传信息完全相同 例如 有丝分裂和s 期的调控 一种控制机制必须确保先在s 期完成d n a 的复制后才进入m 期有丝分裂 另外一种控制机制必须确保m 期完成了有丝分裂才进入新的s 期 这样才能保 证遗传信息的完整且不会产生多倍体 g 期细胞大小的调控 控制机制会检查此期细胞大小 是否符合要求以满足接下来的细胞分裂 d n a 完整性调控 细胞遗传物质通常会受到损伤 监控系统先会对其进行修复 若无法修复就记录损伤并暂停细胞周期使其进入静止状态或者 启动细胞凋亡程序 以避免损伤的d n a 在复制过程中引起错误编码而导致突变1 2 4 1 另外一 种是 外部 的社会学控制 是通过细胞周期信号分子或细胞之间的交流来调节细胞周期的过 程 它能保持组织发育和细胞分裂的平衡 例如 外界生长条件严格控制着细胞分裂活性 细胞在生理条件不适宜时停止分裂 细胞 细胞问作用包括有丝分裂信号分子 如生长因子 和抗有丝分裂信号 如转移生长因子p 细胞损伤 对细胞周期的调控 有丝分裂信号分子与 靶细胞上的特异性受体结合后可启动细胞周期进程信号链 抗有丝分裂信号可阻止细胞周期 进程 实际上 细胞周期监控机制是通过检验点 c h e c k p o i n t 来控制细胞周期的进程 如图1 1 5 6 1 检验点是作用于细胞周期转换时序的调控通路 保证细胞周期中的关键事件高度准确地 完成 它们受细胞自身或其他细胞及细胞环境的影响 并调节一些与细胞分裂有关的基因或 称为c d c c e l ld i v i s i o nc y c l e 基因及其产物对各种信号的反应 因此 是否能够进入下一个新 时期 关键看其能否通过检验点 在细胞周期进程中主要存在三个检验点 它们与细胞周期 转换是一致的 分别在g l s 期 g 2 m 期和m 期 西南大学硕 学位论文 文献综述 i i g 1 s 期检验点 有丝 分裂是否完成 细胞 是否足够大 细胞生 长环境是否合适 图1 1 细胞周期的检验点 引自d a r n e l l 等 1 9 9 5 f i g1 1c h e c k p o i n to f c e l lc y c l e f r o md a m e l le la l 1 9 9 5 g 期是启动d n a 合成的关键时期 否则细胞进入静止期 而g 1 期的进程有赖于周期蛋 白 c y c l i n d e 和周期蛋白依赖性激酶 c y c l i n d e p e n d e n t k i n a s e c d k 抑制因子 如p r b 的调制7 1 细胞要进入新一轮的分裂需要得到有丝分裂信号 c y c l i n d c d k 4 6 复合物就可将这 些外部信号整合进入细胞周期 同时 它还激活细胞的新陈代谢以增大细胞体积 从而协助 细胞通过g l s 期检验点 而c y c l i n e c d k 2 复合物在通过检验点时被活化 直接作用于p r b 蛋 白使其磷酸化 p r b 蛋白磷酸化后失去活性并将e 2 f 从抑制状态释放 e 2 f 具有调控多种细 胞周期所必须蛋白质表达的功能 8 因此它是g i s 期转换的关键蛋白质 当抗有丝分裂信号 作用于g 期时 c d k 抑制因子水平会升高 通常它们通过阻止周期蛋白与c d k 形成复合物而 阻碍g 1 期进程 例如 p 1 6 嗽4 8 使c d k 4 6 复合物分开 抑制因子p 2 l 1 p 2 7 脚1 p 5 7 k 观直 接对抗c d k 2 二聚体复合物 阻止g l s 期转换h s 期的主要事件是复制遗传物质 此阶段的调控主要在复制的启动 目前已鉴别出控制复 制启动的是一种特殊的蛋白复合物 由复制起始复合物 o r i g i nr e c o g n i t i o nc o m p l e x o r c m c m 蛋白 c d c 6 蛋白等组成 它有两种状态 一种是复制前复合物 p r e r e p t i c a t i o nc o m p l e x p r e r c 一种是复制后复合物 p r e r c 在g l 期时结合在复制起点上使染色体处于允许 1 i c e n s i n g 状态 在s 期 要启动复制必需破坏p r e r c 变成复制后状态从而停止重复启动f l u j p r e r c 的破坏就由s 期促进因子 s p h a s ep r o m o t i n gf a c t o r s p f 调控 研究表明 在低等 真核生物s p f 是由c d c 2 8 和g 1 期周期蛋白组成 在哺乳动物中c d k 2 一g l 期周期蛋白复合物如 c y c l i n e c d k 2 具有s p f 的功能1 5 1 正如前述 e 2 f 被激活 使d n a 合成中所需的多种酶蛋白 的基因转录 以导致启动s 期并合成d n a g 2 期为细胞进入m 期进行多种结构和功能的准备 并在g 2 m 期转换时决定是否进入有 丝分裂阶剧1 1 l 其中有丝分裂启动因子 m i t o s i s p r o m o t i n gf a c t o r m p f 是重要的调控因子 它是由c d c 2 和c y c l i n b 组成的复合物 因此c y c l i n b c d c 2 复合物的活性决定能否进入m 期 c d c 2 活性由c y c l i n b 的浓度和磷酸化 去磷酸化决定 在哺乳动物细胞中 c y c l i n b 于s 期开始 2 西南大学硕士学位论文 文献综述 皇曼曼量蔓曼曼曼曼m m m iii l m 合成 g 2 期继续积累至闽值后与c d c 2 结合 然而 此时还不能开始有丝分裂 因为c y c l i n b c d c 2 复合物需要有关的蛋白激酶 c d ka c t i v a t i n g 虹n 舔e c a k 的靶向激活以及c d c 2 5 磷酸酶的去 磷酸化作用 c y c l i n b c d c 2 的磷酸化调节位点在t h r l 6 1 t h r l 4 t y r l 5 当三个位点同时磷 酸化时 复合物无活性 这一状态一直持续到g 2 期的末期 然后在g 2 m 期转换时 其因t h r l 4 t y r l5 被c d c 2 5 磷酸酶去磷酸化而形成活化m p f 通过g 2 m 期检验点进入有丝分裂期 m 期要做出有丝分裂的决定 m 期检验点在有丝分裂的中期和后期 主要检查纺锤体的 形成和姐妹染色体的排列是否正确 纺锤体与着丝粒相连对于有丝分裂极为重要 因为它们 的正常连接能使a p c a n a p h a s ep r o m o t i n gc o m p l e x 与c d c 2 0 结合并被c y c l i n b c d c 2 磷酸化 激活 而活化的a p c c d c 2 0 可使有丝分裂蛋白酶s e p a r i n 上的s e c u r i n 降解 这样 s e p a r i n 就 可裂解与姐妹染色体聚集的相关蛋白 从而使它们分离 m a d l 和m a d 2 可通过与c d c 2 0 结合 阻止a p c c d c 2 0 复合物形成而抑制s e c u r i n 的降解 1 2 1 正常情况下 随着最后着丝粒的相连 m a d 2 与c d c 2 0 的结合作用削弱 姐妹染色体就开始分离 1 3 另外 姐妹染色体的正常排列能 保证分裂后子代细胞染色体数目相同 否则出现染色体数目异常 例如 在癌细胞中就可观 察到 1 1 2 细胞增殖调控 细胞增殖是细胞在细胞周期中循环运转的结果 由于在前述的各种细胞周期控制机制作 用下 细胞内不同基因严格按时问顺序活化和表达 从而维持细胞增殖 但是 一些与增殖 有关的基因及其表达产物会受外界因素变化的影响 其功能调节作用发生改变 导致不同的 细胞增殖调控作用 有时会使细胞进入静止状态而暂停增殖 有时会通过调节基因的转录而 使细胞不可逆地脱离细胞周期分化为有功能的终细胞 有时会使细胞增殖丧失正常控制而恶 性增殖为肿瘤 当然 许多增殖调控是生命过程所必需的 例如胚胎发育 造血及上皮组织 的更新需要细胞的不断增殖 免疫反应需要免疫淋巴细胞在免疫原刺激前暂停增殖 神经 肌肉组织不需要分裂 只需要保持生理机能活动 而肿瘤细胞是逃脱正常细胞增殖控制的异 常增殖 最后会导致机体死亡 因此 对于细胞增殖调控的研究既有利于阐明生物学基础理 论 还利于了解肿瘤 关于细胞增殖调控的研究有以下几大主流方向 一是寻找环境中控制细胞增殖的因素 如细胞生长因子及其受体 二是研究增殖信号的转导调节机制 如生长因子刺激的细胞增殖 信号如何传递引起细胞增殖 再就是探索基因及其表达产物与细胞增殖的关系 如癌基因 含 原癌基因 抑癌基因等 但随着肿瘤的深入研究 人们更加关注有关癌基因及其表达产物对 细胞增殖的影响 通过研究发现 癌基因 含原癌基因 可通过多种方式影响细胞增殖 下 面列举几个典型的例子 d o o l i t t l e 和w a t e r f i e l d 同时发现猿猴肉瘤病毒 s s v v s i s 癌基因产 物p 2 8 v 五3 与血小板衍生因子 p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r p d g f 的结构相似 1 4 1 5 l 这说明 某些癌基因可能通过编码生长因子来调节细胞增殖 生长因子需要与相应的受体结合后才有 机会发挥调节增殖的效应 有研究表明 一些癌基因参与编码具有酪氨酸激酶活性的细胞表 面受体蛋白或者编码细胞内激素受体 另据报道癌基因v e r bb 编码的蛋白g p 6 5 硎o s 与表皮生 长因子 e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r e g f 受体的氨基酸序列相似性达9 0 且其结构只比e g f 受体缺少e g f 结合部位 1 6 1 7 这表明癌基因通过编码生长因子受体参与细胞增殖调控 此外 3 两南大学硕士学位论文文献综述 i ii 有些原癌基因编码的的产物可作为信号转导子接受来自受体的信号并传至细胞内 其中c s r c c a b l 编码的非受体s r c 酪氨酸激酶 p p 6 0 骶 和a b l 酪氨酸激酶最突出 p p 6 0 辩是一种多功能 蛋白质 位于质膜的内表面 可使有关的细胞骨架蛋白磷酸化以引起细胞转化表型的变化 还可通过磷酸肌醇启动第二信使各传递支路对增殖刺激信号的响应 m a r u 等研究a b l 酪氨酸 激酶与费城染色体易位间关系时发现 易位产生的杂合基因表达两个选择性融合蛋白p 2 1 0 b a b l 和p 1 8 0b 瓣a b l 而这是各种白血病的特性f 1 8 还有一类原癌基因 如c m y c e j u n c f o s 等 通过编码转录因子促使增殖相关基因的表达和d n a 的合成 其中c m y c 被公认为是 真正肿瘤的主要致癌基因之一 因其编码产物m y c 控制着大批对细胞周期起调节作用的重要 基因 如c y c l i n d l c y c l i n b l c d k 4 a r f 等 1 9 1 0c j u n 编码蛋白c j u n 可形成同源或与 c f o s 编码的c f o s 形成异源二聚体结合d n a 参与增殖调控 2 0 翔 由此可见 原癌基因在细 胞增殖过程中的作用不容忽视 可作为研究细胞生长 分化 发育方向 1 2c j u n 与细胞增殖 1 2 1 原癌基因概述 原癌基因 p r o t o o n c o g e n e 又称细胞癌基因 是广泛存在于细胞基因组的正常成分 常与 正常细胞的生长调控直接相关 它因可被反转录病毒通过转导作用变成有致癌活性的病毒癌 基因而得名 通常在反转录病毒的致癌基因前加个v v o l l c 如v s r c v s i s 而在相应的原癌基 因前则加个c 0 o n c 如c s r c c s i s 口2 其蛋白表达产物以第一个字母大写来表示 如v s r c c s r c 在正常情况下 它们不表达或有限表达 且其表达具有时间 细胞周期 发育阶段 空间 细胞 组织和器官类型 和程序 先后顺序 特异性 表达产物对细胞生长 增殖 分化和功能调控具有极重要的作用 目前已发现的原癌基因近百种 当原癌基因结构或表达 上发生改变时 通过各种机制改变相关蛋白质的功能 原癌基因就被激活为致癌基因 主要 通过两个激活通路 一方面影响编码蛋白的结构 另一方面激活可致使该蛋白浓度增加 如 图1 2 2 2 在结构改变的情况下 致癌蛋白增殖促进活性归因于杂合蛋白活性 调节作用及 结构的改变 在浓度增加的情况下 原癌基因编码的信号蛋白具有额外 非程序性的功能 4 两南大学硕十学位论文文献综述 mm iii i l lm l lm 量曼量曼曼曼曼曼曼皇曼量曼曼曼曼曼璺曼量置曼曼曼曼曼皇曼曼 p r o t o o n c o g e np r o d u c t s t r u c t u r a 1 c h a n a e s 一a c t i v i t y t r e g u l a t i o n j h y b r i dp r o t e i n sw l t h a l t e r e da c t i v i t y p m l i f e r a t i o np r o m o t i o n 图1 2 原癌基因激活为致癌基因的机制 引自k r a u s s 2 0 0 3 f i g1 2m e c h a n i s mo f a c t i v a t i o no f p r o t o o n c o g e n e s t oo n c o g e n e s f r o mk r a u s s 2 0 0 3 大量研究表明 癌基因 含v o n c 和c o n c 在细胞的增殖和转化中具有重要的调节作用 尤其是存在于细胞中的原癌基因 在正常细胞的生长发育 分化中起着无可替代的作用 从 而为阐明细胞生长 分化和发育开辟了一条新的途径 目前 已知的与增殖有关的原癌基因 和致癌基因有4 类 分别为编码生长因子 生长因子受体 信号转导子以及转录因子的基因 这些蛋白在细胞生长调节的不同时间 空间发挥相应的作用 如图1 3 5 l 其中生长因子通 过与细胞膜表面生长因子受体识别并结合 从而激活细胞内信号转导子活性 最终通过多种 信号途径发挥其调节增殖的功能 细胞内信号转导子能将从受体接受的信号传递至细胞内靶 产物 根据其性质与功能主要包括 酪氨酸激酶类 如s r c a b l 等原癌基因编码产物 丝氨酸 苏氨酸激酶类 如m f m o s 等原癌基因编码产物 r a s 基因家族 已知有k i r a s h a r a s 和 n r a s 等 当外来生长调控信号通过细胞内信号转导系统到达核内 可刺激与增殖有关的基因 表达和合成d n a 这一途径被认为与编码转录因子的原癌基因有关 5 生长西于 生长西子覆体 辑 图1 3 细胞生长调节中与癌基因 抑癌基因有关的5 类蛋白 引自d a m e l l 等 1 9 9 5 i 生长因子 i i 生长因子受体 信号转导子 核转录i t t t v 细胞周期调节蛋白 f i g1 3f i v eg r o u p so f p r o t o o n c o g e n e sa n do n c o g e n e s r e l a t e dp r o t e i n si nc e l l sg r o w t hr e g u l a t i o n f r o md a m e l le t 口f 19 9 5 i g r o w t hf a c t o r s i i g r o w t hf a c t o rr e c e p t o r s i i i s i g n a lt r a n s d u c e r s i v n u c l e a rf a c t o r s v c y c l i n s 编码转录因子的原癌基因主要有c j u n c l o s c m y c c m y b c e t s c s k i 等 它们编码 的蛋白产物在细胞核内 故可称作核内癌蛋白 它们具有以下共同特点 2 3 搿 1 当静止细胞 受到有丝分裂原刺激时 c j a n c 1 0 s 等会快速被激活并转录 因此又被称为快速早期基因 i m m e d i a t e e a r l yg e l l e s i e g s l e g s 能够对神经递质 激素 神经冲动等外界刺激在几分钟 内产生迅速反映 极为敏感 而且它们的激活并不依赖于新蛋白的合成 而是受一些转录因 子的调控 由于这些原癌基因的3 端非翻译区含丰富的不稳定的a t 序列 因此l e g s 自身半 衰期较短且其编码的蛋白通常半衰期亦较短 2 0 一9 0 m i n 2 它们均为翻译后修饰 3 这些核 内癌蛋白都具有亮氨酸拉链 1 e u c i n ez i p p e r l z 可形成同源或异源二聚体 同时还具有锌指 f z i n ef i n g e r z f 同源区 h o m e od o m a i n i i d 或螺旋一环 螺旋 h e l i x l o o p h e l i x h l h 结构 可与d n a 特异序列结合 由此这些编码核内癌蛋白的原癌基因被称为转录因子或反式因子 t r a n s a c t i v a t o n 对细胞具有正性调控 2 5 1 而这种正性调控作用取决于转录因子的d n a 结合位 点 活化位点 细胞核固定位点 配体结合位点等多种主体结构的变化1 2 6 这些主体结构可 在一定条件下互相转化 如d n a 结合位点就可在一定条件下转换为活化位点 其中锌指结构 和亮氨酸拉链结构是转录因子的重要结构 锌指结构作为一种能与特异d n a 序列结合的结构 存在于多种调节蛋白中 而亮氨酸拉链可使原癌基因的表达产物形成同源和异源二聚体 是 转录因子中蛋白和蛋白相互作用的结构主体 例如 c j u n 的锌指结构可与c f o s 经亮氨酸拉 链结构形成二聚体 形成的异源二聚体比与c 4 u n 形成的同源二聚体更稳定 转录功能更强 但c f o s 只能形成异源二聚体 而不能形成同源二聚体 1 2 2c j a n 及表达产物的结构特征与功能 6 秀穰磊疆场鸳礓 j 西南大学硕十学位论文文献综述 曼 一一i i 曼曼蔓皇曼曼曼曼曼鼍皇曼皇曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼蔓舅量曼曼量曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼皇曼曼曼曼曼曼曼皇曼笪曼量曼曼曼曼曼 曼曼曼曼曼 曼曼 b o h m a n n 等1 9 8 7 年发现 人类原癌基因c j i m 与禽肉瘤逆转录病毒基因a s v l 7 v q u n 在细胞内属同源基因 其相关基因有j u n b 和 i u p d 1 2 位于人类染色体i y 3 1 3 2 上 基因长 3 5 k b 无内含子 c j u n 的基因序列在不同物种间的差异较小 因此高度保守 它的启动子复 合体的变化不大 主要由n f j u n 1 4 2 s p l 1 1 8 c t f 9 4 j i m l 7 5 t a t a 6 0 和t a t a 4 6 等组 成 c j u nm r n a 全长3 2kn t 编码j i m 蛋白 4 0 k d 其亚类有 c j i m j u n b j u n d 等 2 引 实际上 j u n 蛋白是属于激活蛋白 1 a c t i v a t o rp r o t e i n 1 a p 1 家族的一种转录活性因子1 2 9 a p 1 是指含有j t m 或f o s c f o s f o s b f r a 1 f r a 2 3 0 1 亚基的二聚体转录激活子的总称 3 1 3 2 1 与转录激活因子 c a m p 应答元件结合因子 a t f c r e b 家族和c c a a t 增强子结合蛋白 c e b p 家族等组成碱性亮氨酸拉链 b a s i cl e u c i n ez i p p e r b z i p 家族 a p 1 的各亚基能够结合到具有相 似识别序列的d n a 元件上 a p 1 发挥转录激活作用的关键是形成碱性亮氨酸拉链结构域 因此 单独的c j i m 是没有功能的 只有形成同源二聚体或者与f o s 蛋自家族成员和或b z i p 家族其它成员形成异源二聚体才具有转录调控功能 所以 j u n 蛋白家族是通过与a p 1 家族 其它成员以及b z i p 家族其它成员相互作用 彼此协调 发挥着转录因子调节功能 3 3 3 4 l 例如 它们能以亮氨酸拉链结构形成二聚体复活物 如j u n j u n 同源二聚体 j u n f o s 和j u n a t f 2 异 源二聚体等 然后与a p 1 位点结合 参与基因转录的调控 激活晚期基因的表达 从而介 导一系列生理和病理的变化1 3 5 3 8 1 a p l 结合位点属于1 1 p a 应答元件 t p ar e s p o n s ee l e m e n t t r e 其d n a 特异性识别序列为回文结构 5 t g a g c t c a 3 或5 t g a c g t c a 3 j u n j i m 和j u n f o s 二聚体主要与含前者的d n a 元件结合 而j u n a t f 二聚体主要与含有后者的d n a 元件结合 c j u n 蛋白的c 端有d n a 结合和二聚化结构域 该结构域是形成j u n j u n 或j u n f o s 的专 有结构域 而n 端有两个t r y 和两个s e r 磷酸化位点 如果其被磷酸化后能够稳定c j u n 蛋白 结构并且快速诱导c j i m 表达 另外 其间还有两个主要的功能结构域 d e l t a 结构域和反式激 活结构域 j u n b 和j i m d 与c j u n 不同 均定位于染色体1 9 p 1 3 2 m r n a 分别是1 7 9 7n t 和 1 8 9 1n t 仅有一个外显子 j u n 家族成员的转录激活潜能是不相同的 c j t m 较强而j u n b j u n d 较弱 且有时后者竞争结合于a p 1 位点 抑制c j u n 的转录活性 这可能与其结构的差异有 关 因此 c j u n 与j u n b 具有相互拮抗的作用 1 2 3c j u n 在各组织中的表达 c j u n 作为一种快速早期基因 它能在一些外界刺激下快速表达 这些刺激包括激应信号 如生长激素 生长因子 紫外线 氧化应激 肿瘤坏死因子 t n f a 白介素1 等 以及一些应 激反应如热休克 缺氧 缺血再灌注等 由于c j i m 对多种刺激的反应性 c j i m 具有多组织器 官表达的特性 首先 在中枢神经系统中c j u n 基因表达与神经细胞再生 痛觉调节 脑损伤等有关 a n d e r s o n 等1 3 9 观察移植后中枢神经轴索再生情况时发现 再生良好的神经元中c j u n 表达上调 而再生不良的神经元中无此现象 冯雪等研究表明在伤害性刺激下 中枢神经系统中有c j u n 与c f o s 的表达 且吗啡通过可拮抗其表达而缓解痛觉 4 0 同年 王文雅等的研究证实了这个 结论 吗啡通过抑制c j u n 的磷酸化而发挥拮抗作用 4 在继发性脑损伤过程中 c j i m 和c f o s 7 两南大学硕十学位论文文献综述 的表达增强 诱导晚期基因表达使脑损伤细胞的损害程度加重 4 引 近来发现 原来继发性脑 损伤过程中c j u n c f o s 的表达增强与受伤细胞的缺氧 缺血有关