高中生物 第四章 生物化学与分子生物学技术实践 第9课时 生物成分的分离与测定技术同步备课课件 苏教版选修1.ppt

第9课时生物成分的分离与测定技术 第四章生物化学与分子生物学技术实践 学习导航1 掌握电泳法分离大分子的原理 2 运用常用的方法提取和分离蛋白质 3 尝试从血清中提取和分离血红蛋白 4 了解芳香油的特点 知道提取芳香油的原理及会设计简单的实验装置进行提取 重难点击1 电泳法分离大分子的原理 2 运用常用的方法提取和分离蛋白质 一 蛋白质的分离与纯化 二 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 内容索引 当堂检测 三 凝胶色谱法分离血红蛋白 四 从生物材料中提取某些特定成分 一 蛋白质的分离与纯化 1 分离与测定生物成分中蛋白质的技术包括 和等 采用的方法可以将所带电荷的数量和性质不同的蛋白质从混合样品中分离并纯化出来 采用 和脂溶性有机溶剂提取法可以分离生物组织中的脂肪 基础梳理 离心沉降法 薄膜透析法 凝胶色谱法 电泳法 醋酸纤维薄膜电泳 水蒸气 蒸馏法 2 蛋白质分离的抽提方法 偏碱性 偏酸性 有机溶剂 3 蛋白质的分离方法 1 离心沉降法 通过控制 使分子大小 不同的蛋白质发生沉降分层 2 薄膜透析法 利用蛋白质分子不能透过的特性 使与其他小分子化合物分离的方法 离心速度 密度 半透膜 蛋白质 3 凝胶色谱法 概念 根据的大小差异对其进行有效分离的方法 原理 a 凝胶 形态 微小的多孔球体组成 大多由构成结构 内部具有很细微的 蛋白质分子量 多糖类化合物 多孔网状结构 b 分离的过程 容易 较慢 较短 4 蒸馏 概念 将液体加热至沸腾 使液体变为 然后使蒸气冷却再凝结为 这两个过程的联合操作称为蒸馏 是分离和提纯液态混合物常用的方法之一 分离物质的种类a 易挥发和不易挥发的物质 b 液体混合物中不同的物质 5 电泳法 将所带电荷的数量和性质不同的蛋白质从混合样品中分离并纯化出来 蒸气 液体 沸点 问题探究 欲研究某种蛋白质的结构 性质和功能 需将这种蛋白质从组织细胞中分离 纯化出来 结合教材 完成下列内容 1 怎样释放细胞中的蛋白质 答案在提取蛋白质时 可以采用研磨和超声波结合的方法将生物组织或细胞完全破碎 使蛋白质从细胞中释放出来 并使其溶解在适当的抽提液中 答案 2 离心沉降法分离蛋白质 1 完善右面离心沉降法分离蛋白质的示意图 2 观察并总结离心沉降法分离的原理及其目的 通过控制 使 的蛋白质发生沉降分层 从而达到分离出不同种类蛋白质的目的 蛋白质 离心速度 分子大小 密度不同 利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性 从而使蛋白质与其他 分离开 达到纯化蛋白质的目的 3 薄膜透析法分离蛋白质仔细观察下面薄膜透析法分离蛋白质的示意图 完成下列问题 小分子 化合物 4 凝胶色谱法 1 结合上图 根据凝胶色谱法的分离原理 填表分析不同大小的分子洗脱后的次序 较大 较小 垂直向下运动 较快 较长 2 结合上图 分析为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来 答案相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部 而被滞留 相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面 在颗粒之间迅速通过 3 凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离 答案不能 相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部 移动距离较近 移动速度较快 先洗脱出来 但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部 也可能不进入 导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来 答案 解析凝胶色谱法分离蛋白质的原理是依据蛋白质分子相对分子质量的大小 相对分子质量大的蛋白质分子不能进入凝胶内部的通道 路程较短 移动速度快 先洗脱出来 相对分子质量小的蛋白质分子能够进入凝胶内部的通道 路程较长 移动速度慢 后洗脱出来 因此最先流出的应是相对分子质量较大的蛋白质 而凝胶颗粒是不能流出的 拓展应用 1 凝胶色谱法分离蛋白质时由色谱柱下端最先流出的是a 相对分子质量较小的蛋白质b 相对分子质量较大的蛋白质c 凝胶颗粒d 葡萄糖或琼脂糖分子 答案 解析 2 蛋白质的分离与纯化是蛋白质研究的重要技术 下列有关叙述不正确的是a 根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性 可将样品中各种不同的蛋白质分离b 根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等 可通过电泳法分离蛋白质c 根据蛋白质相对分子质量的大小 可通过凝胶色谱法分离蛋白质d 根据蛋白质的分子大小 密度不同 可通过离心沉降法分离蛋白质 答案 解析 问题导析 问题导析 1 薄膜透析法是利用了蛋白质分子不能透过的特性 将蛋白质与其他小分子物质 如无机盐 单糖 二糖以及氨基酸 分离开来的提纯方法 2 蛋白质所带的性质能决定其在电泳槽中的移动方向 分子的大小能影响其移动速度 3 凝胶色谱法是根据蛋白质分子量的对其进行有效分离的方法 4 离心沉降法是通过控制离心 使分子 不同的蛋白质发生沉降分层 从而达到分离出不同种类蛋白质的目的 答案 返回上页 半透膜 电荷 大小差异 速度 大小 密度 解析蛋白质分子是生物大分子 都不能通过半透膜 因此不能利用半透膜分离蛋白质 返回上页 1 本题四个选项涉及的提纯方法中 哪种不适合将不同种类的蛋白质分离 为什么 答案薄膜透析法 因为薄膜透析法的原理是根据蛋白质不能通过半透膜的特性 该方法仅可将蛋白质与其他一些小分子物质分离 而不适合将不同种类的蛋白质分离 2 电泳法中影响蛋白质移动速度的因素除了分子大小外 还有哪些因素 答案颗粒的大小 形状和所带净电荷的多少 此外还有电场强度 溶液的ph等因素 答案 蛋白质分离技术的原理 1 薄膜透析法 蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质 不能透过半透膜 2 离心沉降法 在离心力的作用下 分子大小 密度不同的蛋白质分子沉降速度不同 从而被分离 3 凝胶色谱法 凝胶小球体内部有许多贯穿的通道 相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部 只能分布在颗粒之间 通过的路程较短 移动速度较快 相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道 通过的路程较长 移动速度较慢 因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离 4 电泳法 不同的物质所带电荷不同 颗粒的大小 形状不同 因此 在电场中的泳动速度不同 二 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 基础梳理 1 结合教材 完善下表 巴比妥缓冲 透明 支架前沿 气泡 记号 巴比妥缓冲液 记号 2cm 记号 正极 60 90 染色液 蛋白质区底色脱净 透明液 透明薄膜 2 实验结果 问题探究 1 本实验的关键步骤是点样 点样的技术要求有哪些 答案点样前 应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去 以免引起样品扩散 但不宜太干 否则样品不易进入膜内 造成点样起始参差不齐 影响分离效果 答案 2 实验结果分析 1 血清蛋白主要包括几种蛋白质 含量大小如何 答案从电泳图谱示意图中可以看出 血清蛋白主要包括五种蛋白质 且含量最多的是清蛋白 其他依次是 球蛋白 1 球蛋白 2 球蛋白 球蛋白 2 这些蛋白质带什么电荷 四种球蛋白的泳动速度如何 答案由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带有负电荷 四种球蛋白在电场中的泳动速度由快到慢依次为 1 球蛋白 2 球蛋白 球蛋白 球蛋白 答案 关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的几点说明 1 薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一 2 点样时 应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去 吸水量以不干不湿为宜 3 点样时 动作要轻 稳 用力不能太大 以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 4 点样应点在薄膜的毛面上 点样量要适中 不宜过多或过少 5 电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端 且点样面向下 6 应控制染色时间 时间过长 薄膜底色不易脱去 时间太短 着色不易区分 或造成条带染色不均匀 必要时可进行复染 解析对于几种球蛋白来说直径相差不大 引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少 由图可知球蛋白由右向左泳动 因右侧为负极 且 球蛋白距点样处最近 所以 球蛋白所带负电荷最少 拓展应用 3 仔细观察右图 所带负电荷最少的球蛋白是a 1 球蛋白b 2 球蛋白c 球蛋白d 球蛋白 答案 解析 电泳的泳动规律带电颗粒直径越小 越接近于球形 所带净电荷越多 则在电场中的泳动速度越快 反之 则越慢 4 下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的说法中 不正确的是a 架滤纸桥时 待滤纸条湿润后 要驱除气泡 以便使滤纸紧贴于支架上b 浸泡薄膜时要识别出光泽面 并做记号c 平悬薄膜时 有记号的一面朝上d 从染色液中取出薄膜后 用滤纸条压平并吸干 再浸入透明液中脱色 解析薄膜染色后要先放入漂洗液中漂洗直至蛋白质区底色脱净为止 然后才用透明液脱色 答案 解析 三 凝胶色谱法分离血红蛋白 1 研究目标 1 红细胞中含有大量的血红蛋白 一分子由四条肽链构成 两条 肽链和两条 肽链 由于其肽链中结合了血红素而呈现出色 2 可利用血液分离血红蛋白 2 实验器材猪 羊等血液 交联葡聚糖凝胶 20mmol l磷酸缓冲液等 3 实验目的利用分离血红蛋白 基础梳理 血红蛋白 红 哺乳动物 色谱柱 凝胶色谱法 4 实验步骤 1 样品处理 离心分离红细胞 用滴管吸出上层血浆后 将下层红细胞倒入盛有约5倍体积的质量分数为0 9 的nacl溶液 生理盐水 的烧杯中搅拌后再低速离心 重复3次 直到红细胞被洗净 上清液不再呈现黄色为止 低速短时间 2 血红蛋白的释放 分离和透析 在蒸馏水和甲苯的作用下 红细胞破裂而释放出血红蛋白 将混合液以2000r min的速度离心10min 试管中形成层 自上而下分别为甲苯层 脂溶性物质层 血红蛋白层 杂质层 用滤纸过滤其中的液体 除去 用分液漏斗分离出下层的 血红蛋白溶液 在透析袋中加入1ml红色透明液体 放入物质的量浓度为20mmol l的中 ph为7 0 透析 4 脂溶性沉淀层 红色透明液体 磷酸缓冲液 12h 3 凝胶的制备将用蒸馏水充分溶胀后 制成凝胶悬浮液 凝胶的溶胀一定要完全 否则会导致 并产生气泡 4 色谱柱的装填 将层析柱洗净 垂直固定在支架上 选择 100目尼龙纱 端作为层析柱下口 打开色谱柱下端的乳胶管开口 将充分溶胀的凝胶悬浮液轻轻搅动均匀 沿内壁缓缓一次性倒入色谱柱内 立即连接 在约50cm高的操作压下 用 ph为7 0 物质的量浓度为20mmol l的磷酸缓冲液 充分洗涤平衡凝胶12h 使凝胶装填紧密 交联葡聚糖凝胶 色谱柱装填不均匀 有薄膜 层析柱 洗脱瓶 洗脱液 5 样品的加入 打开下端的流出口 让凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与刚好平行 关闭出口 用滴管小心吸取1ml样品溶液沿轻轻地加入到色谱柱顶端 不能破坏凝胶面 然后 打开流出口 使样品液逐渐渗入凝胶 当样品恰好完全渗入凝胶床时 再加入少量的 ph为7 0 物质的量浓度为20mmol l的磷酸缓冲液 冲洗管壁 重复数次 每次既要使样品恰好全部渗入凝胶床 又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝 随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱 直至洗脱液到适当高度 注意 整个过程一定要仔细 避免破坏凝胶柱的床层 色谱柱 凝胶面 柱壁 洗脱液 6 洗脱与收集连接好凝胶柱层析系统 调节洗脱液流速为每分钟1ml 进行洗脱 仔细观察样品在层析柱内的分离现象 当红色的蛋白质接近 时 收集洗脱液 每收集5ml即换一支收集管 要预先编号 连续收集 样品即可完全被洗脱下来 色谱柱的 出口 1 对色谱柱填料处理时 因凝胶是干燥的 须将其置于洗脱液中使其充分膨胀 在此期间 可以通过加热等方法使其膨胀速度加快 这也有利于排除胶粒内的空气 避免凝胶凝固后出现气泡而影响分离效果 2 色谱柱的装填时 装柱过程中严禁产生气泡 一旦发现气泡 必须重装 3 洗脱过程中 注意不能让洗脱液流干而露出凝胶颗粒 否则需重新装填色谱粒 小贴士 5 结论与反思观察红色区带在洗脱过程中的移动状况 如果红色区带地移动 并且凝胶色谱柱中没有气泡产生 说明色谱柱的装填是成功的 6 深入研究若需对蛋白质纯度进行鉴定 一般采用 1 该方法以 为网状结构 具有分子筛效应 作为支持介质 2 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的 一般只需要微克量级的蛋白质即可完成鉴定 均匀一致 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶 灵敏度 3 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时 它的迁移率取决于它所带的 分子的和形状等因素 向蛋白质溶液中加入足够量的 十二烷基磺酸钠 等 可使蛋白质分子中的 十二烷基硫酸根所带的负电荷使各种蛋白质 sds复合物都带上大大超过了蛋白质分子原有的负电荷量 sds与蛋白质的结合还可引起蛋白质构象改变 使不同蛋白质的sds复合物的短轴长度都一样 这样 蛋白质 sds复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响 而仅仅取决于 4 由于聚丙烯酰胺的作用 小分子蛋白质可以很容易地通过凝胶孔 阻力小 迁移速度快 大分子蛋白质则因受到较大的阻力而被滞后 这样蛋白质在电泳过程中就会因其分子量的不同而被分离 净电荷 大小 sds 二硫键还原 分子量的大小 分子筛 1 实验操作过程 1 材料的选择 与其他真核细胞相比 哺乳动物成熟红细胞有什么特点 这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义 答案 哺乳动物成熟红细胞内没有细胞核和各种复杂细胞器 排除了其他物质对实验结果的干扰 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 这使血红蛋白的分离过程非常直观 大大简化了实验操作 问题探究 答案 2 洗涤红细胞的目的是什么 你如何知道红细胞已洗涤干净 答案洗涤的目的是去除血浆蛋白 离心后的上清液不再呈现黄色 证明红细胞已洗涤干净 3 在血红蛋白释放过程中 蒸馏水和甲苯的作用分别是什么 答案 蒸馏水可以使红细胞吸水涨破 释放细胞内的血红蛋白 甲苯是有机溶剂 可以溶解细胞膜 有助于血红蛋白的释放 答案 4 血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层 如何获得血红蛋白溶液 答案 分为4层 从上往下数 第1层为无色透明的有机溶剂 甲苯 第2层为白色的脂类物质 第3层为红色透明的血红蛋白溶液 第4层为暗红色的红细胞破碎物沉淀 分层的液体 过滤除去脂溶性沉淀层 分液得下层的血红蛋白溶液 5 将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析 透析的目的是什么 答案血红蛋白是大分子物质 不能透过透析袋 这样可以去除相对分子质量较小的杂质 答案 2 凝胶色谱操作 1 在制作凝胶色谱柱时 凝胶色谱柱的高度不足或直径过大对洗脱效果分别有何影响 答案 凝胶色谱柱的高度是样品随缓冲溶液流过的距离 凝胶色谱柱的高度不足会导致达不到分离效果 凝胶色谱柱的直径大小并不影响分离效果 但直径过大会导致洗脱液体积大 样品稀释度大 使实验现象不明显 答案 2 试从凝胶色谱的分离原理分析 凝胶的装填为什么要紧密 均匀 答案如果凝胶装填得不够紧密 均匀 就会在色谱柱内形成无效的空隙 使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过 搅乱洗脱液的洗脱次序 影响分离的效果 3 在装填凝胶柱时 如果有气泡存在 会对蛋白质的分离有何影响 答案气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 答案 血红蛋白的提取和分离各操作的主要目的 5 下列关于凝胶色谱法分离血红蛋白实验中样品的加入和洗脱的叙述中 不正确的是a 加样前 打开色谱柱下端的流出口 使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面b 用吸管小心地将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端 不要破坏凝胶面c 加样后 打开下端出口 使样品渗入凝胶床内d 等样品完全进入凝胶层后 关闭下端出口 拓展应用 答案 解析 解析加样前 应打开色谱柱下端的流出口 使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐 关闭出口 而不应使缓冲液下降到凝胶面的下面 a项不正确 加样时不要破坏凝胶面 b项正确 加样后 打开下端出口 使样品渗入凝胶床内 c项正确 等样品完全进入凝胶层后 关闭下端出口 再加缓冲液 d项正确 6 下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置 请据图分析回答下列问题 1 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分 其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有功能 解析血红蛋白能携带氧气 体现了蛋白质具有运输功能 运输 答案 解析 2 甲装置用于 目的是去除样品中的杂质 图中a是 b是溶液 解析甲装置为透析装置 目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 其中a是磷酸缓冲液 b是血红蛋白溶液 3 用乙装置分离蛋白质的方法叫 是根据分离蛋白质的有效方法 解析乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法 是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法 透析 粗分离 相对分子质量较小 磷酸缓冲液 血红蛋白 答案 解析 凝胶色 谱法 相对分子质量的大小 4 乙装置中 c是 其作用是 解析乙装置中 c溶液为磷酸缓冲液 作用是洗脱血红蛋白 磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白 答案 解析 5 用乙装置分离血红蛋白时 待 时 用试管收集流出液 每5ml收集一管 连续收集6管 图中试管序号表示收集的先后 经检测发现 试管 和试管 中蛋白质含量最高 则试管 中的蛋白质相对分子质量比血红蛋白 填 大 或 小 红色的蛋白质接近 小 答案 解析 色谱柱的出口 解析待红色的蛋白质接近色谱柱出口时 用试管收集流出液 每5ml收集一管 连续收集 最先收集到的蛋白质是血红蛋白分子 则试管 内的大量蛋白质为血红蛋白 由于试管 晚于试管 收集得到 因此其内收集到的蛋白质比血红蛋白分子移动速度慢 其相对分子质量比血红蛋白小 凝胶色谱法分离蛋白质中确定收集蛋白质时间的方法 1 血红蛋白的收集 利用血红蛋白的颜色 当红色的蛋白质接近色谱柱出口时 就要收集流出液 2 其他无色蛋白质的收集 可以在实验时加入指示剂以掌握样品的移动位置 确定最佳的收集时机 四 从生物材料中提取某些特定成分 基础梳理 1 植物芳香油的特点 1 具有 故可用水蒸气蒸馏法提取 2 易溶于 故可采用萃取法提取芳香油 2 提取橘皮中的芳香油 1 橘皮芳香油的成分及用途 成分 橘皮芳香油的主要成分是 用途 橘皮芳香油是生产香精 香精和香精的优质原料 挥发性 有机溶剂 柠檬烯 食用 化妆品 医药 2 提取方法 橘皮芳香油存在于果皮的中 具有一定的挥发性 其沸点水的沸点 在蒸馏时 随着温度的升高和水分的侵入 果皮油细胞 芳香油流出并随水一起形成蒸气 蒸气再通过 经接液管流入收集瓶 由于油轻水重 静置后分离 油细胞 低于 涨破 冷凝管 1 适合用水蒸气蒸馏法提取的成分应具有怎样的特性 答案适用于具有挥发性的 能随水蒸气蒸发而不被破坏 与水不发生反应 且难溶或不溶于水的成分的提取 2 在水中蒸馏的操作中 如何避免加热时发生暴沸 答案蒸馏烧瓶下垫石棉网 并向液体中加入几片碎石或瓷片 3 为什么冷凝管中水流应从下方进水 上方出水 答案与蒸气流向相反 冷却效果好 4 为什么液体混合物中各组分的沸点如果相差不大就不适合采用蒸馏的方法提取 答案若各组分的沸点相差不大 在蒸馏时会同时蒸发出 达不到分离的效果 所以不适合采用蒸馏的方法进行分离 问题探究 答案 植物芳香油的提取方法 解析植物芳香油是植物有效成分的提取液 其特点是具有特殊的植物香味和较强的挥发性 且难溶于水 易溶于有机溶剂 7 下列属于植物芳香油理化性质的是 具有较强的挥发性 易溶于水 易溶于有机溶剂 具有特殊的植物香味a b c d 拓展应用 答案 解析 8 蒸馏装置安装完毕后 可以在蒸馏瓶中加几