第9章 酶促反应动力学.doc

2012年 王镜岩版生物化学考研参考笔记 4安雨（整理）第九章 酶促反应动力学（一） 底物浓度对酶反应速率的影响用反应初速度v对底物浓度S作图得P355 图9-6。曲线分以下几段：（1） OA段：反应底物浓度较低时v与S成正比，表现为一级反应， v = kS。根据酶底物中间络合物学说，酶催化反应时，首先和底物结合生成中间复合物ES，然后再生成产物P，并释放出E。E + S = ES P + E OA段上，底物浓度小，酶未被底物饱和，有剩余酶，反应速率取决于ES浓度，与S呈线性关系，v正比于S。（2） AB段：反应速度不再按正比升高，表现为混合级反应。此时酶渐渐为底物饱和，ES慢慢增加，v也慢慢增加，为分数级反应。（3） BC段：反应速度趋于Vmax，为零级反应，酶促反应表现出饱和现象。此时底物过量SE, E已全部转为ES而恒定，因此反应速率也恒定，为最大反应速率，Vmax为E所决定。非催化反应无此饱和现象。酶与底物形成中间复合物已得到实验证实。（二） 酶促反应力学方程式（1） 米氏方程推导1913年Michaelis和Menten提出并推导出表示S与v之间定量关系的米氏方程VmaxS V = Km + S Km：米氏常数，物理意义为反应速率为最大速率Vmax一半时底物的浓度，单位与底物浓度同。 推导：酶促反应分两步进行。 k1 k3 E + S ES P + E k2 v = k3 ES 一般k3为限速步骤 v = k3 ES 1. ES 生成速率： dES/dt = k1(E - ES) S2. ES分解速率：-dES / dt = k2 ES + k3 ES = (k2 + k3) ES3. 稳态下ES不变，ES生成速率和分解速率相等：k1 (E- ES) S = (k2+k3) ES4. 引入Km： 令Km = k2+k3 / k1代入Km = (E- ES) S / ES , Km ES = E S- S ES, ES (Km + S) = E S, ES = E S / Km+S,5. 代入式：v = k3 ES = k3 E S / Km + S 6. 引入Vmax：为所有酶都被底物饱和时的反应速率，即此时E= ESVmax = k3 ES = k3 E代入式：v = Vmax S / Km + S米氏方程表示Km及Vmax已知时，vS的定量关系。（2） 米氏常数的意义1. Km是酶的一个特性常数，Km大小只与酶性质有关，而与酶浓度无关。当底物确定，反应温度，pH及离子强度一定时，Km值为常数，可用来鉴别酶。P359 表9-1 列出一些酶的Km值。一般Km在110-610-1mol/L之间。不同的酶Km值不同，测定Km要在相同测定条件（pH、温度、离子强度）下进行。2. Km值可用于判断酶的专一性和天然产物，若一个酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然底物。3. 1 / Km可近似表示酶与底物亲和力的大小。真正表示酶与底物亲和力为Ks=k2 / k1 ,(注 Km= k2+k3 / k1)。4. 已知Km可由S计算v，或由v计算S。5. Km可帮助推断某一代谢反应的方向和途径。Km小的为主要催化方向（正、逆两方向反应Km不同）。（3） Vmax和k3(kcat)的意义：酶浓度E一定，则对特定底物Vmax为一常数。催化常数 kcat 又称酶的转化数，数值上与k3同，为酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。大多数酶的kcat 为1104/sec，见P322 表8-2，为每秒钟酶促反应每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。kcat越大，酶催化效率越高。（4） kcat / Km的意义：生理条件下S Km， Vmax = kcat E 代入米氏方程 v = kcat E S / Km + S = kcat E S / Km得出：v = kcat / KmESkcat / Km为E和S反应形成产物的表观二级速度常数，单位：L/mol s。可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率，见P362 表9-4。 kcat / Km大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。（三） 米氏常数求法：（1） 双倒数法：1 / v = Km / Vmax1 /S + 1 / Vmax以1 / v 1 / S作图，见P363 图9-10纵轴截距：1 / Vmax；横轴截距：-1 / Km；斜率：Km / Vmax。（2）v v / S法 （Eadic-Hofstee）： v = -Kmv / S +Vmax 以v v / S作图，见P363 图9-11。 斜率：-Km；纵轴截距：Vmax；横轴截距：Vmax / Km。（3）S / v S法 （Hanes-Woolf）： S / v = Km / Vmax + 1 / VmaxS 以S / v S作图，见P363 图9-12 斜率：1 / Vmax；纵轴截距：Km / Vmax；横轴截距：-Km。2.9 酶的抑制作用失活作用：使酶蛋白变性而引起酶活力丧失。抑制作用：酶的必需基团的化学性质改变而引起酶活力降低或丧失，但不引起酶蛋白变性。引起抑制作用的物质称为抑制剂。研究酶的抑制剂，可以研究酶的结构与功能、酶催化机制，进行药物、农药的设计与筛选。（一） 抑制作用的类型：（1） 不可逆抑制作用： 抑制剂与酶必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，酶被化学修饰。（2） 可逆抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合而使酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活。可逆抑制又分为三种类型，如P369 图9-17所示。1. 竞争性抑制：抑制剂（I）和底物（S）竞争酶的结合部位，从而影响了底物与酶的正常结合。抑制剂结构大多与底物类似，许多底物过渡态类似物为抑制剂。抑制剂与酶活性部位结合形成EI复合物，抑制酶与底物的结合。竞争性抑制可以通过增加底物浓度而解除，如丙二酸或戊二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制。2. 非竞争性抑制：底物和抑制剂同时和酶结合，两者无竞争作用。I与S结构无共同之处，酶活性降低或被抑制，不能用增加底物浓度来解除抑制，如Leu是精氨酸酶非竞争性抑制剂。3. 反竞争性抑制：酶只有与底物结合后才能与抑制剂结合。常见于多底物反应中，如肼类化合物抑制胃蛋白酶。（二） 可逆抑制作用和不可逆抑制作用动力学鉴别加入一定量抑制剂，以v与酶浓度E作图，见P370 图9-8。加不可逆抑制剂使直线原点右移，斜率不变，加入酶使浓度大于不可逆抑制剂，才表现酶活力；加可逆抑制剂，直线原点不动，斜率变小。（三） 可逆抑制作用动力学（1） 竞争性抑制：1 /v 1 /S作图见P371 图9-20，Vmax不变，Km变大。纵轴截距：1 /Vmax不变，Vmax不变，底物浓度足够高，可克服抑制作用；横轴截距：1 /Km变小，Km变大；斜率：Km / Vmax变大。（2） 非竞争性抑制：1 /v 1 /S作图见P372 图9-21，Vmax变小，Km不变。纵轴截距：1 /Vmax变大，Vmax变小；横轴截距：-1 /Km不变，Km不变；斜率：Km / Vmax变大。（3） 反竞争性抑制：1 /v 1 /S作图见P373 图9-22，Km，Vmax都变小。（四） 一些重要的抑制剂：（1） 不可逆抑制剂：1. 有机磷化合物：与脂酶活性部位SerOH共价结合，如抑制胆碱酯酶，使乙酰胆碱不能分解而积累，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过于兴奋状态，引起神经中毒。如神经毒剂和有机磷农药，结构式见P374。可用能与磷酸根有更强结合力的化合物将酶游离出，从而解毒，如用肟类化合物解磷定，结构式见P374。2. 有机砷化合物：与酶中Cys-SH作用使人畜中毒。如有机砷化合物路易斯毒气（结构式见P375），可用含-SH的化合物作解毒剂，使酶恢复活性。3. 氰化物、CO、H2S与含铁卟啉的酶，如细胞色素氧化酶中的Fe2+络合，使酶失活，阻止呼吸。4. 青霉素：与糖肽转肽酶活性部位Ser-OH共价结合，使酶失活，（P375图9-24）抑制细菌细胞壁合成。青霉素与转肽酶的底物之一的酰基-D-Ala-D-Ala结构类似，见P546。5. TLCK：根据底物的化学结构设计的专一性不可逆抑制剂。以胰蛋白酶底物对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酯（TLME）为模板，设计底物结构类似物对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮（TLCK）（结构见P376 图9-25），与胰蛋白酶活性部位His57共价结合，引起不可逆失活。（2） 可逆抑制剂：磺胺药：四氢叶酸（THF）是合成核酸和蛋白质酶的必需物质（辅酶）。根据人和细菌获THF途径不同设计磺胺类杀菌剂。叶酸（FA）结构见P377，DHF（二氢叶酸）、THF见P457 图11-30。 FA还原酶 DHF还原酶 叶酸 DHF THF（人可从食物中获取） DHF合成酶 对氨基苯甲酸（细菌靠此合成THF）人体可直接从食物获取叶酸经DHF还原成THF而细菌只能从对氨基苯甲酸合成DHA。因此若抑制DHF合成酶，即可断绝细菌THF来源，从而抑制核酸和蛋白质的合成，而抗菌。THF中对氨基苯甲酰胺部分的过渡态类似物对氨基苯磺酰胺可抑制DHF合成酶。磺胺药抗菌谱广，性质稳定，对肺炎、痢疾等疗效显著。此外抗癌药阿糖胞苷、氨甲喋呤等均为酶的竞争性抑制剂。2.10 温度、pH等对酶反应影响（一） 酶反应最适温度：使酶促反应速度达最大值的温度，见P3