（微生物学专业论文）副干酪乳杆菌素高产菌株的诱变选育.pdf

中文摘要 中文摘要 目前延长食品保存期的主要方法是添加化学防腐剂 而化学防腐剂对人体健 康都有或多或少的副作用 因此研究和开发各种天然 安全的防腐剂是人类健康 和社会发展的需要 而取自于动植物的天然防腐剂 由于受到原料的生产周期及 成本的制约 很难规模化生产 采用微生物发酵法是生产天然防腐剂的晟佳选择 多种微生物均可产生抑菌物质 但作为人类益生菌的乳酸菌产生的抑菌物质 多 为安全的肽类 是目前研究的热点 本课题研究的即是由副干酪乳杆菌 三日c f d 6 口c f 船p 口朋c 口s p jh d l 7 产生的抑菌谱广 适用p h 广的副干酪乳杆菌素 但由于副干酪乳杆菌h d l 7 菌株为野生菌株 产量较低 为提高该菌株产抑菌物 质产量 本课题对此野生菌株进行诱变选育 本课题采用物理和化学多种诱变育种技术对副干酪乳杆菌进行选育 利用紫 外线诱变 n t g 诱变以及微波诱变进行复合诱变处理 获得一株高产突变株副干 酪乳杆菌素高产突变株w 6 效价从出发菌株的1 5 5 a u m l 提高到了6 1 4 a u m l 连续传五代后仍具有良好的传代稳定性 试验对高产突变株w 6 的发酵培养基及培养条件进行了优化 首先以m r s 培 养基为基础培养基 通过正交设计对碳源 氮源以及无机盐浓度进行优化 选择 出各组分最适合的浓度 找出最佳发酵培养基 优化后的发酵培养基组成为 葡 萄糖1 5 果糖1 乳糖1 蛋白胨2 牛肉膏o 5 酵母粉o 1 乙酸钠 o 0 2 5 k 2 h p 0 40 0 2 m g s 0 4 7 h 2 00 0 1 m n s 0 4 h 2 0o 0 0 2 5 吐温8 0l m l l 最佳培养条件为3 7 初始p h 6 0 接种量4 在此条件下 副干酪乳杆菌素的 产量有较大的提高 比原产量提高1 9 关键词 副干酪乳杆菌 诱变育种 培养基优化 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t s y n t h e s i z e dp r e s e r v a t i v e sa r ei n t e n s i v e l ya p p l i e di nf o o di n d u s t d s i i l c et h e yc a n p r o l o n gf o o ds h e l fl i f e t h e yh a v e h o w e v e r s i d e e 能c t so rp o t e n t i a l t h r e a tt oh u m a n h e a l t h t h e r e f o r e t h ep r o d u c t i o no fn a t u r ep r e s e r v a t i v e sf r o ma n i m a l sa n dp l a n t sa s w e l la sm i c r o o r g a n i s m si san e c e s s i t yr e q u i r e db yd e v e l o p m e n to ft h es o c i e t y d u et o t h ep r o d u c t i o nc y c i ea n dh i g hc o s t n a t u r ep r e s e r v a t i v e sa r ed i 衔c u i tt op r o d u c eo nl a r g e s c a l e t h ep r o d u c t i o no fb i o p r e s e r v a t i v e sf r o mm i c r o o 唱a n i s m sh a sp o t e n t i a la n d b e c o m e sah o tr e s e a r c hs u b j e c t m a n ym i c r o o 唱a m s m sc o u l dp r o d u c ea j l t i m i c r o b i a l s u b s t a n c e s o fw h i c hl a c t i ca c i db a c t e r i a l a b i st h em o s tp o p u i a u ro n ei nr e s e 2 l r c h i n t h i ss t u d y b a c t e r i o c i nw h i c hh a l sh i 曲e ra n t i m i c r o b i a la c t i v i t ya n daw i d ep h 啪g e p r o d u c e db y 口c f d 6 口c f f sp 口 口c a s e fh d 1 7w a sr e s e a r c h e d b e c a u s et h e 口c f d 6 口c j 朋托s p 口 口c 傩p jh d 1 7i si o wi n p r o d u c t i o n t h es t u d yp u to nm u t a t i o nb r e e d i n go n l n c t o b n c i n u sp q r n c q s et i n ss t u d y ah i g h l yp e p t i d eb i o p r e s e r v a t i v ep r o d u c i n gm u 协ts t r a i nw 一6w a s o b 协i n e d 行o mh d1 7b ym a n ym u t a g e n e t i ct r e a t m e n tw i t hu v n t gm i c r o v a v e t h e p e p t i d eb i o p r e s e a t i v ea c t i v i t yo fw 6w a sf r o m15 5 a u m lt 06l4a u m l a n d s u b c u l t u r et e s ti n d i c t e dt h a tt h eh e r e d i t a d rc h a r a c t e ro fm g hp r o d u c t i v i t ro fw 6w a s s t a b l e t h e nt h ef e r m e n t a t i o nm e d i 岫o ft h em u t a n ts t r a i nw 6w a so p t i m i z e da r e rt h e s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sb a s e do nm r sf e 肿e n t a t i o nm e d i u m i no r d e rt os c r e e na n o p t i m u mm e d i u mw h i c hw a sf i tf o rt h ef e r m e n t a t i o no fh i 曲 y i e l ds t r a i nw 一6 t h eb e s t c o n c e n t r a t i o no fi n o r g a n i cc h e m i c a l s c a r b o nr e s o u r c ea n dn i t r o g e nr e s o u r c ew a s s e i e c t e db yt h eo n h o g o n a ld e s i g nm e t h o d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a l f e h n e n t a t i o nm e d i u mf o rb a c t e r i o c i np r o d u c t i o nw a sa sf o l l o w s g i u c o s e1 5 f m c t o s e l l a c t o s e l p e p t o n e 2 e x t r a c t u mc a m i s 0 5 y e a s tp o w e r 0 1 n a a c a b s t r a c t 0 0 2 5 k 2 h p 0 4o 0 2 m g s 0 4 7 h 2 00 o1 m n s 0 4 h 2 0o 0 0 2 5 t w e e n8 0 1m l l t h eb e s t t e m p e r a t u r ew a s3 7 t h eo p t i m u mi n i t i a lp hf o rp r o d u c i n g b a c t e r i o c i nw a s6 0 t h eo p t i m u mi n o c u i a t i n ga m o u n ta n ds e e da g ew a s4 u n d e rt h i s f e 肿e n t a t i o nm e d i u mc o n d i t i o n t h eb a c t e r i o c i na c t i v i t yo fw 6w a si n c r e a s i n gb y19 k e y w o r d s 口c f 0 6 口c j s p 口阳c 口s p i h d 1 7 m u t a t i o n b r e e d i n g o p t i m i z a t i o n o f f e n n e n t a t i o nm e d i u m 黑龙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论史是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得墨蕉逵太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料 学位论文作者签名 虫氟 签字n 期 j 幻矿年r 月 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨廛堑丕堂有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本 人授权墨焦江盔堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或其他复制手段保存 汇编本学位论文 学位论文作者签名 导师签名 奄丧诛 签字日期 j 了年f 月 p 日 签字日期 争甜年多月 f 争日 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 第1 章绪论 1 1 乳酸菌素研究进展 第1 章绪论 细菌素 b a c t e r i o c i n 是由细菌代谢产生 对同种或近源种有特异性抑制杀菌作 用的蛋白或多肽物质i 它最早是在2 0 世纪中期g r a t i a 对大肠杆菌v 菌株抑制 菌株现象进行研究时发现的 g r a t i a 和f r e d e r i c q 对大肠丰 菌v 菌株产生的这种抑 制物质进行了分离 并称为大肠杆菌素 以后的研究发现很多细菌都可以产生类 似物 j a c o b 将这类物质称为细菌素 2 1 1 9 8 2 年 k o n i s l y l 3 1 将细菌素定义为 某些 细菌通过核糖体机制产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质 细菌素能抑制或杀死腐败菌及病原菌 这在食品加工 贮藏和肠道生态中具 有重要意义 尤其是作为人类益生菌的乳酸菌产生的细菌素倍受青睐 乳酸菌素 能抑制包括金黄色葡萄球菌 李斯特菌1 4 一j 等引起食物腐败及中毒的主要病原菌在 内的革兰氏阳性菌 与鳌合剂结合后 还可以将其抑制活性拓宽到革兰氏阴性菌 g 因此关于乳酸茵及其细菌素的功能及应用研究己引起广大食品和医药领域 研究人员的极大关注1 8 1 2 1 1 1 1 乳酸菌细菌素的分类 乳酸菌是一大类发酵糖产生大量乳酸的兼性厌氧菌 广泛应用于医药 食品 发酵等工业 主要包括乳杆菌 口c d 6 口c f 螂 乳球菌 口c f d c d f c 甜s 明串珠 菌 上p 甜c d d s f d c 片球菌 p p 讲d c d c f 甜s 链球菌 研厂印 d c f 淞 肠球菌 砌 p 厂0 c d c c 甜s 双歧杆菌 b 圻如6 口c p 厂砌脚 和肉食杆菌 c 口 门d 6 口c p 砌坍 等 属 1 9 9 2 年 k l a e n h a m m e r 等将乳酸菌产生的细菌素分为三类1 1 3 羊毛硫细菌 素 小分子疏水性热稳定肽 相对分子量 3 0 0 0 0 一年后这个标准即被修正 增加了一类新的细菌素 第 类细菌素 见表1 1 包括一些复合型细菌素 即分子中除蛋白质组分外还 黑龙江大学硕士学位论文 含有糖类或脂类基团1 1 圳 表l l 乳酸菌产生的细菌素分类 1 a b i el lt h ec l a s so fb a c i e r i o c i n sp r o d u c e db ys o m el a c t i ca c i db a c t e r i a 1 1 2 乳酸茵细菌素的检测方法 乳酸链球菌素 也称作乳酸链球菌肽或乳链菌肽 n i s i n 是由某些乳酸乳球 菌 上口c f d c c 甜s 三臼c 括s 印 l a c t i s 产生的具有较强抑菌作用的小分子肽 是目前研 究最多 应j j 较广的由乳酸菌产生的能应用于生产的细菌素之一 由于本试验的 研究对象肽类防腐剂与目前研究最多 研究最为深入 并己广泛应用的细菌素乳 酸链球菌肽n i s i n 有很多耳h 似之处 故对n i s i n 的研究状况进行详细论述 1 1 2 1 乳酸链球菌肽的活性单位 n i s i n 的活性单位定义为在l m l 肉汁中抑制一个 r e p f d c c s 口朋肠c f 缸p 细胞 所需的n i s i n 的量 称为一个r e a d i n g 单位 后来称为国际单位 1 u 称为一个 r e a d i n g 单位的主要原冈为n i s i n 的早期研究主要是在英国r e a d i n g 的乳品工艺研 究所进行f 1 5 16 1 自那时起牛物标准化世界卫生组织专家委员会 1 1 h ew o r l dh e a l t h o r g a n i z a t i o ne x p e r tc o m m i n e ei nb i o l o g i c a ls t a n 1 a r d i z a t i o n 指出了n i s i n 的国际参 第l 章绪论 考制备物 这种参考制备物 即n i s i n 产品 是n i s i n 与氯化钠等成分的复配品 含n i s i n 2 5 m g 儋 其活性为1 1 0 6 1 u g 纯n i s i n 的活性约为4 1 0 7 i u g l l 6 1 8 j 1 1 2 2n i s i n 的抑菌性 n i s i n 主要抑制产芽孢杆菌 如肉毒卡t 菌 耐热腐败菌 如嗜热脂肪芽孢杆菌 等大部分g 菌的生长 它在食品防腐中的重要价值在于能抑制芽孢细菌 包括嗜热 产气芽孢菌 由于多数g 菌能引起食品腐败 并能导致食物中毒等危害人的健康 因此n i s i n 作为食品防腐剂是重要的 有效的 早期的研究认为 n i s i n 一般对霉 菌 酵母菌和g 一菌无效1 1 9 但近期的研究表明1 2 0 在一定条件下 如冷冻 加热 降低p h 和e d t a 处理 一些g 一 如沙门氏菌 s a l m o n e l i as p p 大肠杆菌 e s c h e r i c h i ac o l i 假单胞菌 p s e u d o m o n s as p p 拟杆菌 b o c t e r o i d e ss p p 放线 杆菌 a c t i n o b o c i l l u ss p p 克雷伯氏菌 k 1 e b s i e l l as p p 对n i s i n 敏感1 2 l 1 1 2 3n i s i n 的检测方法 最初测定n i s i n 的方法为1 9 3 4 年c o xg a 等人建议采用的甲基兰还原法 后 来又开发了许多n i s i n 定量的生物分析方法 2 2 2 4 1 如生长延迟法 浊度分析法 t u r b i d i t y 试管稀释法 t u b ed i l u t i o n 琼脂扩散法 a g a rd i f h s i o nt e s t a t p 生物发光测定法 a t pb i o l 啪i n o m e t d 绿色荧光蛋白测定法 g f p b i o a s s a y 和微量滴定法 m i c r o t i t r a t i o n 还有基于使用阳离子交换色谱 1 e c 反相高效液 相色谱 i 冲 h p l c 和毛细管区带电泳 c a p i l l a dz o n a le l e c t r o p h o r e s i s 的分析方 法 此外 e l i s a 法即酶联免疫分析法能够检测出样品中极其微量的n i s i n 2 6 n i s i n 定量的生物分析法中最普遍使用的是琼脂扩散法 a d t 它是t r a m e r 等 1 2 7 1 人1 9 6 4 年建立起来的 尤其适用于高度不透明 不能用浊度分析法分析的样品 常用的杯碟法 w e l lt e s t 滤纸片法 d i s cd i f f u s s i o n 和点种法 s p o ti n o c u l a t i o n 均属此类 w 0 1 f 和g i b b o n s l 2 8 改进了琼脂扩散法 使其精确度提高了5 7 准确 性提高了1 2 琼脂扩散法的原理是在琼脂表面利用检测菌的生长显示抑菌效果 为消除干扰因素的影响 常使n i s i n 标准液和未知液在同一平板扩散 根据它们的 抑茵圈直径及标准效价换算出效价 在培养基中加入吐温2 0 或吐温8 0 可促进 n i s i n 在琼脂中的扩散 黑龙江大学硕士学位论文 生物分析的重要性不可否认 但低灵敏度 费时 受低特效性和源于食品提 取液和发酵液相互干扰等冈素的制约 在2 0 世纪7 0 年代 以免疫学为基础的高 特异性检测方法作为分析手段广泛应用 j 各种研究领域 现已有迅速 直接和灵 敏的免疫技术用于n i s i n 的定晕柃验 如央心酶联免疫吸附法 2 9 j s a n d w i c h t y p e e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y s e l i s a 竞争酶联免疫吸附法 c o m p e t i t i v e d i r e c ta n di n d i r e c te l l s a l 3 0 一3 1 斑点免疫印迹法1 3 2 d o ti m m u n o b l o ta s s a y 这些 方法只是抗体应用的不同形式 其本质均依赖f 抗体技术的发展 各种免疫学方法都表现出了很高的灵敏度 如f a l a h e e 3 3 的酶联免疫吸附法对 纯n i s i n 和奶酪中的n i s i n 的最低检测浓度分别是o 5 n m l 2 0 0n m l s u a r e z 的最低检测浓度分别是5 0n g m l l 3 0 等 但是应用免疫学方法所测定的结果并不 完全可靠 因为所用的抗体会与n i s i n 相关组分发生交叉反应 c h a nw c 等 3 4 1 研 究表明 制备的抗体并不识别n i s i n 发生降解的区域 特别是一些与n i s i n 活性有 关的区域 现在琼脂扩散法仍然足检测n i s i n 等细菌素广泛使用的方法 虽然操作繁琐 准确性 重复性不十分理想 但直到现在仍然没有一个理想的方法替代琼脂扩散 法 1 2 副干酪乳杆菌三却口朋伽西h d l 7 本课题所用的上6 p 口厂口c 乜s p jh d l 7 菌株分离自本项目的合作单位齐齐哈尔市 丰源食品有限公司提供的l 乳酸酸菜发酵液 肋 p a 阳c 伽p fh d l 7 具有很强的生存 竞争能力和对其他菌株的强烈的抑制作用 所以本项同能够在未经灭菌的存放1 5 年之久的酸菜发酵液中分离到该种菌株 这与日本后藤奈美1 4 1 于艮道的在未灭菌而 又未腐败的清酒中分离出许多株 6 p 臼r 订f 傩p i 及a l a ng w i i l i a m s 报道的从成熟 的自然发酵的干酪中分离到了多株l b p a r a c a s e i 优势菌种 等报道是一致的 4 2 4 4 1 到目前为止 国内对 6 p 口 口伽p i 菌研究报道的较少 国外关于该菌具有抑菌 作用的性质也只在近年才有报道 4 5 邯l 但真正进行深入研究的文献很少 目前仅 发现了a t a n a s s o v am l o z oj 和h m i n o 卜p e r e z 的报道 4 第1 章绪论 l o z oj 研究了三日c d 6 口c f z 俗p 日r 口f 娜p is 6 妒 p 口 订c 口5 p 旭g b u k 2 16 产生的细菌 素b a c2 1 7 的特征和抗菌活性 该菌是从的采用传统方法家庭自制的干酪中分离出 来的 而a t a n a s s o v am 研究的上口c d 6 口c i s 珊彻c 册p i 删6 印 p 臼 口c 口s p i5 臼仂m 3 是 保加利亚黄色奶酪的发酵剂 与本实验获得的 6 p 口 订c 臼s p h d l 7 的来源均不同 据资料报道 三6 p 口阳c 口s p ih d l 7 不仅可产生肽类防腐剂 而且还可产生具有 应用价值和市场前景l 乳酸 上6 册阳伽p h d l 7 还具有调节肠道功能 改善免疫 力等保健功能 因此今后还可以对三6 p 口 口c 口s p ih d l 7 进行综合丌发 1 3 乳酸菌素产生茵的菌种选育 乳酸菌素出现在保藏食品以及工业等方面发挥着越来越重要的作用 同时 乳酸菌素的发展对基础科学如生物化学和微生物学等提供了新的技术和内容 但 是野生菌株的缺点是目的产物产量较低 生产水平低 无法进行大批量工业化生 产 因此如何提高目的产物的产量便成为一个很重要的问题 因此本课题通过诱 变育种的手段改变出发菌株的性能 通过对发酵培养基和培养条件的优化提高副 干酩乳杆菌素的发酵水平 从源头上提高菌株的产细菌素能力 现代基因突变的研究开始于1 9 0 9 年 那时从红色复眼的果蝇中间发现了一只 白色复眼的果蝇 这一突变是自然发生的 称之为自发突变 1 9 2 7 年 美国昆虫 学家m u l l e r 发现x 射线能诱发果蝇突变 是人为控制突变的开始 1 9 4 2 年 a u b e r b a c h 等1 4 9 发现氮芥也能诱发果蝇突变 从此开创了人们利用理化因子来进行 工业微生物菌种选育的主动地位 微生物的诱变育种约始于1 9 3 9 年2 0 世纪4 0 年 代初 遗传学从细胞水平发展到分子水平 促进了工业微生物育种技术的发展 随后b a c k u s 等 系统地总结了在青霉素产生菌中的w i s c o n s i n 育种系谱 为世界 许多国家提供了青霉素高产变种 6 0 年代末 国际粮农组织和国际原子能机构组 织了利用各种理化因子来改善农作物品系的培训班 并发表了 突变育种手册 为诱变育种奠定了理论基础 从而完成了从初期基础研究向实际应用的转折 同 时分子遗传学和分子生物学技术的广泛应用也为诱变育种注入了新的活力 特别 是9 0 年代分子标记方法的运用以及人们对诱变规律和微生物遗传学知识的进一步 5 黑龙江大学硕士学位论文 了解 使得定向诱变有了可能 在我国 乳酸菌素研究起步于8 0 年代 乳酸荫素产生菌的诱变育种也起始于 那个时间 近年以来爿填正进入加速发展阶段 特别是在新诱变因予的开发上 我国的科研工作者作出了巨大贡献 随着诱变机 甲研究进一步深入 育成菌种的 数量及质量也大大提高 但和世界发达国家水平l h 比 我国的乳酸菌素产生菌的 诱变育种无论是在基础理论研究上还是在生产实践上都还有较大差距 尽管随着现代生物技术的发展 将目的基冈导入宿主菌 进行克隆和表达 从而构建基因工程菌的报道已有不少 但基凶工 f 罕用于大规模工业生产的还为数 不多 经典的诱变育种仍是目前最重要的遗传育种手段 特别是对遗传背景不很 清楚的对象 诱变育种吏是必不呵少 目前 国内微生物育种界主要采用的仍是 常规的理化因子等诱变方法 1 3 1n i s i n 合成的遗传学研究 关于编码n i s i n 的遗传密码的确切位置有两种理论 一种认为它与质粒连锁 另一种则认为是在染色体上 支持前一观点的主要i i f 据有 k o z a l 1 3 5 研究产n i s i n 菌株的突变现象时发现 若先以原黄素或溴乙锭诱变并进行高温处理 再以n t g 进行诱变 未检测到回复突变株 并据此推测n i s i n 基因可能位于质粒上 进一步 研究发现 n i s i n 的产生与一个相对分子量为1 7 5 m 的质粒有关 k a le t t a 和e n t i a n 3 6 从乳酸链球菌6 f 3 的质粒中成功克隆到了编码n i s i n 的结构基因 近十几年来 通 过对质粒消除和接合转移实验的研究也证实n i s i n 基因位于质粒上 并认为n i s i n 产生基因 n i p 蔗糖发酵基因 s u c 和n i s i n 抗性基因 n i s 是紧密连锁 的 但是 另一些研究者认为n i s i n 基因位于染色体上 并有一些实验证明一些产 n i s i n 的菌株中并不存在质粒 在接合转移试验中 虽然供体菌的n i p n i s s u c 的性状可以向受体菌转移 但在接合中并未分离到质粒 分离供体茵 受体菌和 转移接合子染色体d n a 和质粒d n a 分别与和n i s i n 基因互补的1 4 寡核苷酸探 针杂交 结果显示该探针与供体菌和转移接合子染色体d n a 片段有杂交带 而与 质粒d n a 没有杂交带 从以上实验可以看出n i s i n 的产生与菌株是否带有质粒无 第1 章绪论 必然联系1 3 7 1 对n i s i n 基因定位的研究最近取得了一些突破性进展 一些研究者根据对染色 体的缺失与杂交试验提出n i s i n 的结构基因与染色体上的一个可接合转移的转座子 有关 n i s i n 基因存在于一个7 0 k b 大小的转座子t n 5 3 0 1 中 同时另一些研究者的 工作也证实了这个转座子的存在 且发现n i s i n 基因座是不稳定的 这些发现可能 提示我们n i s i n 基因位于一个可转座于质粒和染色体上的转座子中 在不同的菌株 中 n i s i n 基因的位置不一定相同 这样 由于位于质粒和染色体上的基因的表达 效率的差异 使得菌种选育工作显得十分重要1 3 8 1 9 8 8 年 f u k a s e 等 3 9 1 人完成了乳酸链球菌肽的人工化学合成 n i s i n 基因首次 被克隆出来 不同于大部分的多肽类抗生素 n i s i n 前体蛋白是由核糖体合成 经 过一系列包括脱水 硫环形成等一系列复杂的翻译后加工过程 最终形成有活性 的成熟n i s i n 分子 e n g e l k e 等则进一步研究了关于翻译后修饰和加工的基因 提 出这些基因与n i s i n 结构基因是紧密连锁的 对n i s i n 遗传学研究的深入 将有可 能定向改变n i s i n 的溶解度 稳定性 抑菌范围等 对于n i s i n 的应用前景有着重 大而深远的意义m 1 3 2 菌种选育的方法 传统的菌种选育方法主包括自发突变和诱变育种 近年来随着生物技术的发 展 细胞技术和基因工程育种发展迅速 成为菌种选育的重要方法 1 3 2 1 自然选育 自然选育是一种纯种选育的方法 它利用微生物在一定条件下产生自发变异 的原理 通过分离 筛选排除衰变型菌落 从中选择维持原有水平的变株 因此 它能达到纯化 复壮菌种 稳定生产的目的 自然选育有时也可以来选育高产菌 株 不过突变几率很低 进展很慢 应用较少 而高产菌株育种工作常采用诱变 育种 基因重组 1 3 2 2 诱变育种 诱变育种足指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群 促进其 黑龙江大学硕士学位论文 突变率提高 然后采川简便 快速和高效的筛选方法 从中挑选少数符合育种目 的的突变株 以供生产实践或科学实验之用 诱变育种具有极其重要的实践意义 当f j 仃发酵i 业和其他微生物部门所使用 的高产菌株 几乎毫无例外地都是通过诱变育种向明显提高其生产性能的 诱变 育种除能提高代谢产物的产量外 还可达到改进产品质量 扩大品种和简化工艺 等目的 从方法上来说 它具有简便易行 工作进度快和收效显著等优点 故仍 是目前广泛使用的一种育种手段 当前 在生产上常用的诱变剂主要包括以紫外线 u v x 射线 x r a y y 射线 y r a y 快中子 f n c 0 6 0 等物理诱变剂和以碱基类似物 5 b u 2 a p 等 烷化 剂 e m s n t g 等 和吖啶类移码突变剂为辛的化学诱变剂 在实际生产中 无论 化学诱变剂还是物理诱变剂 单独使用很少能收到预期的效果 所以生产中多采 用几种诱变剂复合处理 交叉使用的方法 另外在操作过程中 不同的菌株对诱 变剂的种类 剂量乃至处理的先后顺序要求足不尽相同的 另外随着现代科学技 术的蓬勃发展 学科之问相互渗透相瓦作用为抗生素产生菌诱变育种增添了活力 在传统的育种技术基础上 激光辐照 离子束注入 微波诱变育种等新技术发展 迅速 成为极为活跃的研究领域 呈现出良好的开发应用前景 1 3 3 诱变育种主要方法 1 3 3 1 紫外线诱变育种 紫外线是目前诱变机制了解得较清楚 应用较广泛的一种非电离辐射型物理 诱变剂 u v 的波长范围为1 3 3 9 0 肿 其中2 0 0 3 0 0 n m 波长范围对诱变有效 波长2 5 4 n r n 的u v 最易被嘌呤和嘧啶碱基所吸收 冈而诱变效果最强 实验中常 采用波长集中在2 5 4 n m 的1 5 w 紫外灯管 距离选择在2 8 3 0 c m 照射时间因生物 种类而异 一般地说 多数微生物细胞在紫外线下暴露3 5 m i n 即可死亡 但灭活 芽孢则需要1 0 m i n 左右或更长时问 目前用紫外线对微生物诱变主要是采用对微 生物细胞直接诱变或对其原生质体诱变两种方法1 5 1 1 1 紫外线对微生物菌液直接诱变 第1 章绪论 对微乍物菌液直接诱变是微生物诱变育种中最常用的方法之一 该方法就是 将微生物悬浮在一定的缓冲液中 用紫外线照射一定时i 日j 然后避光培养一定时 间后 涂板并筛选突变因子 据报邋邑过紫外线诱变乳酸菌得到一株产酸高的菌 株 比原菌株产酸力提高了2 9 5 纠5 2 1 还连栋等1 5 3 1 人利用u v 6 0 c o 等单因子处理 乳酸链球菌 使乳链菌肽的产量从1 0 0 0 i u m l 左右提高到2 5 0 0 i u m l 2 紫外线对微生物原生质体进行诱变 原生质体融合可跨越种间 属间的界限 但在原生质体融合之前 首先对亲 体加上遗传标记 此项工作既费时费力 还会影响菌体活力和一些有用的性状 而对原生质体直接进行诱变 方法简单效果好 能在较短的时间内提高菌株的生 产性能 这种方法与原生质体融合方法类似 需要首先制备原生质体 对原生质 体进行紫外线诱变后 还需要对原生质体进行再生使之恢复细胞壁的形成 现在 用紫外线直接对原生质体诱变被广泛地应用到微生物诱变育种中 朱昌雄1 5 4 1 等曾 对抗生素高产菌株选育条件进行研究 选出了原生质体加紫外线处理的最佳方法 并通过此种处理方法获得了四株较原株效价高5 0 9 0 的高产菌株 1 3 3 2 激光诱变 激光是一种新型的物理诱变剂 对微生物产生不同的诱变效应 激光技术问 世于二十世纪6 0 年代 人们在微生物遗传育种的研究中 逐渐认识到激光作为一 种物理诱变剂具有显著的成效 现在己经形成一门独立的技术一激光诱变微生物 技术 与其他诱变方式相比 激光诱变具有操作简单 安全 变异率高 辐射损 伤轻等优点 而激光与其它诱变剂的复合处理 也具有潜在的诱变效果 到目前 为止 国内外关于激光诱变微生物已做了大量的研究工作 概括起来 激光诱变 微生物技术在两方面取得了卓有成效的发展 一方面是基础性的规律和机理的研 究 为激光生物技术的应用作理论探讨 另一方面是应用性研究 归结为微生物 的激光诱变育种 即激光辐照代替常规实验试剂或手段培育既高产又能稳定遗传 的优良菌株 对于激光诱变微生物技术的机理 国内外普遍比较认同的一种解释是光照活 化效应 在激光辐照机体时产生光照活化效应1 5 5 j 使d n a r n a 一蛋白质系统活性 9一 黑龙江大学硕士学位论文 提高 核糖体上蛋白质合成作用的活性增强 使机体内的生物合成增强 特别是 二羧酸酶和细胞色素氧化酶活性提高 从而提高细胞利川氧的能力并增强细胞合 成a t p 的能力 此外 d n a r n a 一蛋白质系统活性的提高还可增强细胞有丝分 裂 刺激细胞内外的生理再生过程和修复再生过程 一般认为光被呼吸链 或称电 子传递链 的光受体吸收是光的生物反应的第一步 呼吸链中光受体的名称 构成 特性等也逐渐被人们所认识 而光在细胞内引起的一系列反应的结果 可能是对 d n a r n a 一蛋白质或酶系统的某种修饰 从而刺激微生物新陈代谢加速和生成 繁殖速度加快 这中间的一系列反应和反应的中问产物及作用尚待深入研究 1 3 3 3 亚硝基胍 n t g 诱变 亚硝基胍是一种烷化剂 其诱变作用特别强 号称 超诱变剂 在适宜的 条件下 能在较小的死亡率下得到较高的突变率 烷化剂通常带有1 个或多个活性烷基 此基川能够转移到其它电子密度高的 分予上去 使碱基许多位置上增加了烷基 从而在多方面改变氢键的能力 n t g 也是最有效 用得最广泛的化学诱变剂之一 依靠n t g 诱发的突变主要是g c a t 转换 另外还有小范围切除 移码突变及g c 对的缺失 在自然条件下n t g 容易分解 而在酸性0 h 5 5 条件下会产生h n 0 2 虽然l n 0 2 本身就是诱变剂 但 在n t g 有活性时 p h 6 9 它却无诱变效果 在碱性条件下 n t g 会形成重氮甲 烷 c h 2 n 2 它是引起致死和突变的主要原因 它的效应很可能是c h 2 n 2 对d n a 的烷化作用引起的 5 6 1 据报道通过n t g 诱变以乳酸乳球菌乳酸业种丁二酮变种为出发菌株 采用亚 硝基胍进行诱变选育 得到高产丁二酮菌株 其产量比出发菌株提高1 2 9 倍 且 遗传性质稳定吲 1 3 3 4 离子束诱变 离子束诱变是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一种新型诱变源 其特别点是损伤 轻 突变率高 突变谱广 宋道军等1 5 8 认为 微牛物的存活率随着注入剂量的增 大而降低 其主要原因是能量沉积效应和动量传递效应综合作用的结果 因为小 剂量下低能离子的直接作用可导致d n a 的损伤 能量沉积所产生的大量自由基亦 1 0 第1 章绪论 会导致d n a 和乍物膜等其它生物大分子的损伤 从而造成存活率下降 在中高剂 量下微生物的存活率随着注入剂量的增大而上升 但仍远低于对照 这一方面说 明能量沉积和动量传递效应历造成的损伤仍起主要作用 另 方面则说明注入离 子的电荷积累可能发挥了作用 据报道通过n t g 诱变王晓青1 5 9 低能碳离子注入农用抗生素2 1 6 菌株 诱变 突变率在其所用方法中最高达5 3 2 9 实验结果表明 离子注入处理是一种有潜 力的微生物诱变育种新方向 离子注入育种技术作为一种新兴的交叉学科 显现了巨大的优势 离子注入 集化学诱变和物理诱变于一身 突变率高 操作简单 加之离子束介导转基因的 可能性 使其在微生物育种中更具有目的性和针对性 随着研究程度的深入 研 究范围的拓宽 相信离子注入法在微生物育种中能发挥巨大的作用 1 3 3 5 微波诱变 微波诱变在微生物育种方面的研究及其应用开始于1 9 7 6 年 1 9 7 8 年 东京大 学学者在同步发射的装置上进行了噬菌体 病毒孢子和低等真核生物 酵母 的突变 效应的研究 此后 有关微波诱变微生物的报道不断出现 包括处理曲霉 沙门 氏菌 酵母等 微波是一种电磁波 在生物学上 微波主要用于杀菌 刺激植物 种子发芽生长 而用于微生物诱变育种只是近几年来才有文献报道 微波的生物 效应分为热效应和非热效应 人们感兴趣的是它的非热效应 这也是研究的重点 在研究微波的非热效应时 为了消除微波的热效应 必须采取一定的措施 常用 的方法有 分散低温干燥法 分散低温热分散法等 微波对生物的非热效应可能 源于以下几个方面 1 微波是一种电磁波 其交变电场对微生物细胞内d n a 等 极性分子的洛仑兹力作用 强迫其按照电磁场作用的方式运动 从而引起d n a 分 子点突变 产生遗传变异 这可能是最主要的 2 微波极强的穿透效应使胞内外 水分子同时产生剧烈转动 从而引起细胞壁通透性发生变化 更易使胞内代谢物 分泌出来 3 2 4 5 0 m h z 微波能使水分子以1 8 0 州s 的速度来回转动2 4 5 亿余次 强烈的转动摩擦使得胞内d n a 分子氢键和碱基堆积力受损 最终引起d n a 分子 结构变化导致遗传变异 1 1 黑龙江大学硕士学位论文 李永泉等1 6 0 j 采用激光和微波两种物理 大l 子 对玄 基会霉素 扛产菌金霉素链 霉菌进行诱变处理 米比较两者的诱变效应 结果发现 微波比激光效果更佳 激光选育性状回复突变较大 而微波选育的菌种相对稳定一些 另外 微波诱变所需的设备简单 方法易行 操作安全 诱变效果远较传统 的理化凶子好 因而在工j i 上微生物菌种选育中 特别是在抗生素产生菌的诱变中 具有较大的推广价值 1 3 4 诱变剂的选择及影响诱变效果的因素 1 3 4 1 诱变剂的选择 诱变剂的作用有 提高突变频率 扩大目的产物产量变异的幅度及使产量变 异向正突变或负突变的方向移动 在诱变育种时 一般首先考虑诱变频率比较高 的常用诱变剂 如u v n t g 硫酸二乙酯等 u v 和亚硝酸复合使用诱变谱宽 突变率比较高 电离辐射也有不少应用 如近年来国内已广泛应用快中子 此外如 激光 微波处理也己见报道 对诱变剂最适剂量的选择至今仍有不同的看法 凡 是既能增加变异幅度 又能促使变异向正突变范围移动的剂量就是合适的剂量 一般诱变效应随剂量的增大而提高 但达到一定剂量后 再增大剂量突变率反而 会下降 诱变剂的选择和不同诱变剂所采用的最适剂量还常随不同菌种而异 有 人认为高剂量 致死率在9 0 以上 引起的变异范围大 突变株比较多 适用于单位 产量较低的菌株 而长期用于工业生产经过多次诱变选育的菌株 则宜用中等剂 量 致死率为7 0 8 0 甚至更低 普遍认为低剂量处理能提高正突变率 有些诱变剂在基凶组上诱发的突变并不均匀分布 而是在某些区段的突变率 比较高即所谓突变热点 不同的诱变剂所形成的突变热点不同 所导致的遗传性 状的改变仍是随机的 为了改良某一菌株的某种性状 选用什么诱变剂最好 目 前尚无规律可循 须在工作中不断摸索 积累经验 根据高产突变株出现的频率 来选择诱变剂及其最适剂量 1 3 4 2 影响诱变效果的因素 1 选择合适的出发菌株 第1 章绪论 合适的出发菌株就是通过选育能有效地提高目标产物产量的菌株 出发菌株 选择是否合适对诱变效果影响很大 有些菌株比较稳定 其遗传物质耐诱变剂的 一能力强 这些菌株用于生产是很有益的 而用作出发菌株则不适宜f 用作诱变的 出发菌株必须产量高 对诱变剂的敏感性大 变异幅度大 一般选用经历过生产 条件考验 正突变可能性较大的菌株 2 采用分散状态的孢子j 悬浮液处理 诱变剂所处理的微生物一般要求呈悬浮液状态 并使细胞尽量处于分散状态 这样有利于细胞均匀地接触诱变剂 也可以部分地避免出现不纯的菌落 因为如 果突变发生在两个连在一起的细胞中的一个上 那么这两个细胞在培养皿上就会 形成一个不纯的菌落 3 采用单核细胞 或核质体 处理 诱变剂所处理的细胞中的细胞核 或核质体 愈少愈好 最好是处理单核细胞 假如所处理的是霉菌和放线菌等丝状菌 则应尽量采用芽孢进行处理 而且在处 理前应用灭菌的玻璃珠把结成团的孢子打散 如果所处理的是芽孢杆菌 则应处 理芽孢而不是营养体 因为一般芽孢杆菌细胞中右两个核质体而芽孢中只有一个 而且芽孢悬液比较稳定 所以采用单核细胞处理可以避免出现不纯菌落 并且实 验数据重复率较高 4 注意微生物的生理状态 微生物的生理状态对于诱变的效果也有影响 一般对数期的细菌对诱变剂的 反应最为灵敏 霉菌和放线菌成熟的分生孢子都处于休眠状态 但是如果使孢子 稍稍萌发 则可以提高诱变效果 5 适宜的诱变剂量 诱变剂的剂量对于诱变效果有较大影响已如前述 在接触低剂量诱变剂的细 胞群体中 突变必定发生在d n a 受到较多损伤 也就是造成较多前突变 的细胞中 可是在接触高剂量诱变剂的细胞群体中 突变必定发生在d n a 受到较少损伤的细 胞中 因为这时受到过多损伤的细胞不能生存 本试验所要选育的由副干酪乳杆菌株产生的副干酪乳杆菌素 具有广谱 高 1 3 黑龙江大学硕士学位论文 效 安全的特性 它在食品防腐保鲜方面起草要作用 预计会在不久的将来作为 种重要的食品防腐剂而产生巨大的经济效益 本试验对副干酩乳杆菌h d l 7 进 行诱变 筛选出副干酪乳丰 菌素高产菌株 从而为今后副干酪乳杆菌素的应用和 工业化 主产奠定基础 1 3 5 培养基的优化 利用微生物乍产有用代谢产物是一个复杂的发酵过程 即涉及到生物细胞的 生长 生理和繁殖等生命活动的反应过程 又涉及生物细胞分泌的各种酶所催化 的生化反应过程 微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌株本身的性能 还取 决于发酵过程是否具有合适的坏境条件 只有在最适合的条件下 菌种的生产能 力才能得到充分表达 影响发酵的环境因素包括培养基成分 如碳源 氮源 无机 盐 生长因子等 培养温度 p h 值 转速等 可变因子较多 不易控制 当今社 会由于计算机的帮助 利用各种软件以及数学方法进行实验设计和结果分析 可 以大大简化这一过程 1 3 5 1 培养基成分对细菌素产量的影响 细菌素的产量受到培养基成分的影响 培养基只有在满足