外文翻译 黄芪提取物的抗凋亡法抑制破坏胃癌细胞和皮细胞.doc

吉林化工学院学士学位论文外文翻译黄芪提取物的抗凋亡法抑制破坏胃癌细胞和皮细胞狄娜，刘福楠，苗志峰，杜宗敏，徐惠敏人体腹膜间皮细胞线HMrSV5是胃癌细胞上清液(MKN45)和黄芪共同发出的。在显微镜下观察胃癌细胞的形态学变化，由MTT法决定了细胞破坏的数量。细胞凋亡取决于利用透射电子显微镜对吖啶橙或染色溴化乙锭 (AO/EB)量化检测。用显微镜观察凝聚核，以表达Bcl-2和Bax的多少来评价染色效果形态改变、发生剥离和用胃癌、肝癌细胞上清液培养HMrSV5细胞24小时后，出现明白区域。自胃癌细胞MKN45产生的细胞上清液以时间的方式诱导HMrSV5细胞的凋亡。在凋亡细胞中能观察到明显的形态改变，如染色质浓缩，核碎裂和凋亡小体。黄芪可以部分抑制这些变化和规范Bcl-2和Bax在HMrSV5细胞中的表达。胃癌细胞通过对上清液诱导可产生HPMCs凋亡。黄芪可抑制这种现象，peutic剂可用于辅助化疗治疗胃癌。1. 导言腹膜是人类胃癌和其手术治疗成功的一个最重要的因素1，它出现在胃癌意义上的恶化后期和终末期。然而，对该倾向转移的机制基本尚未明确理解。腹膜癌病可以被视为一系列喷口，形成了一个腹膜转移级联。腹膜间组织似乎是一个友好的东道主，它为肿瘤的扩散提供了丰富的生长因子和趋化因子，而参与了肿瘤转移。目前，我们对分子调解的理解还很少2据报道，皮细胞阻止癌症的入侵和接受变化的表达以呼应癌症细胞释放的因素3。肿瘤细胞入侵后会形成坚硬的皮单层，皮细胞必须透过皮单层4。巴克等人都证明了皮大鼠的保护作用模型。当沃克将256肿瘤细胞快速植入注入大鼠腹腔后，腹膜顶叶已被剥落, 在裸露部分其皮衬里已完整离开基底膜4。然而，在联合国大鼠腹腔的皮被完整的剥离是一件罕见的事。调查结果显示，胃癌细胞粘附于腹膜和间皮细胞前形成半球形，脱落，且裸露区域从结缔组一直织暴露到腹腔5,6。入侵皮单层似乎出现了肿瘤诱导的皮细胞凋亡7,8。在这项研究中，我们审查胃癌细胞释放的因素对腹膜皮细胞凋亡的影响。 黄芪是一个传统的中药,用于治疗普通感冒,腹泻，疲劳，食欲不振和心脏疾病9-11。它已被用作治疗免疫缺陷性疾病的一种免疫治疗调节剂12-14，以减轻化疗药物的不利影响，如抑制减少骨髓癌症患者15,16。黄芪活性成分包括各种多糖，皂甙以及L-精氨酸或L-刀豆17。此外，研究还表明，黄芪多糖对大肠癌，乳腺癌肿瘤，泌尿系统肿瘤，胃癌等有影响。近年来，有人建议，黄芪可能有腹膜间皮细胞的抗凋亡作用。尽管这样，黄芪皂甙提取物对人腹膜间皮细胞腹膜在抗凋亡方面尚未广泛的研究。本研究旨在观察黄芪皂甙提取物对人类腹膜中间上皮细胞在腹膜胃癌肿瘤转移的反细胞凋亡的影响。2. 实验2.1 仪器相差显微镜(日本，尼康)，荧光显微镜(日本，奥林巴斯)，透射电子显微镜(日本，日立氢6001)，低术仪(流式细胞仪，美国)2.2 试剂 黄芪注射液选用于青春宝制药有限公司(北京)，3-(4,5dimethylthiazol -2-基)-2, 5-二苯基tetrazoliumbromide(MTT法)和吖啶橙/溴化(敖/电子束)获得了由蓝(美国)。碘化(PI)的，获得Bioshar(美国)。Bcl- 2和Bax和肌动蛋白抗体小学，以及第二抗体羊抗鼠IgG ，获得来自Santa Cruz生物技术公司(CA，美国)。杜尔贝科的修改鹰的介质(液)和小牛血清(FCS)的 获得了由法转化细胞(格兰德艾兰，纽约， 美国)。其他实验室试剂获得了六西格玛(美国)。2.3 细胞系和细胞培养人腹膜间皮细胞系HMrSV5是彭佑铭教授热心提供，中南大学第二医院(长沙，中国)，皮埃尔龙科教授，榫医院(巴黎，法国)。人胃癌细胞转移肝脏细胞线， MKN-45和正常胃粘膜上皮细胞系,后GES-1，获得了由中国北京癌症研究二所的研究。细胞置于75厘米组织培养瓶中和在37增长，根据加湿大气中含有50毫升/ L的CO2和950毫升/升的空气，在培养液辅以10 的胎牛血(FCS)，100U/ml的青霉素和100g/ml的链霉素2mmol/L的L-谷氨酰胺，20mmol/L的羟乙基乙哌嗪酸(复)。细胞脱落改为每两天或三天使用0.25胰蛋白酶和0.02 mol/L的乙二胺四乙酸代替中等磷酸缓冲液。2.4 无血清培养基的制备由胃癌细胞或正常胃粘膜上皮细胞如前所述制备无血清培养基SFCM1。首先将5.0 10细胞加入至用10毫升培养液培养的100毫米组织中，加入10 FCS，并于37 条件下培养3天。如果要取得蛋白液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，然后在3毫升无血清DMEM培养液中培养2天。无血清培养基在1000 克条件下离心洗脱5分钟，经微孔滤膜过滤后(孔径，0.45微米)存放于-20，直到使用。人腹膜间皮细胞系HMrSV5是在50厘米含有10FCS的DMEM培养液中培养的。改变介质测定方案：(1)无血清培养液，(2)胃癌细胞系MKN45无血清培养基，(3)胃癌癌细胞MKN45无血清培养基+200g/ml的黄芪注射液，(4)培养液+200g/ml的黄芪注射液。2.5 相位对比显微镜形态学评价皮细胞在测定方案的测定液的24孔板中培养24小时，以PBS轻轻洗涤，然后用显微镜观察大小，形状，和完整的细胞膜，细胞质，和细胞核。3 结果与讨论3.1 相位对比显微镜形态学评价在未经处理的间皮细胞的蛋白液(图1A)中发现一个多边形鹅卵石，但当皮细胞蛋白以无血清培养基治疗时形态学发生变化。在去角质和曝光区域(图1B)皮细胞的形态变化最为明显。黄芪注射液可部分制止这种形态学改变(图1C)。MKN45治疗二十四小时后，通过电子显微镜观察凋亡功能(如凝结核染色，起皱的核膜，扩张内质网，和相对正常的结构线粒体)是veriied(图2)。透射电镜下，细胞核膜完整，染色质集中到边界膜或形成拱(图2C)。也能观察到萌芽的形成和凋亡产生的现象(图2D)。3.2 MTT法在凋亡的胃癌细胞内观察到无血清培养基和黄芪注射液抗凋亡的共同信号通道。为了考察无血清培养基和黄芪注射液相结合对皮细胞潜在的抗凋亡作用，我们检测了无血清培养基和黄芪注射液对人皮细胞系HMrSV5的细胞毒理作用，无血清培养基能有效地诱导皮细胞的细胞凋亡(图3)。黄芪注射液能有效地抑制皮细胞蛋白液分别0，12，24和48h的细胞凋亡。评价黄芪注射液对MKN45细胞的潜在影响，我们对黄芪注射液对MKN45细胞的毒性进行了考察。观察到黄芪注射液对MKN45细胞作用无意义(P=0.995表1)。培养12小时后，低流式细胞仪显示当MKN45在皮细胞与无血清培养基 (9.510. 71)中培养时,凋亡高峰出现在二倍体峰之前.与此相反，在无血清培养液组(0.700. 16)中凋亡峰不升高。在无血清培养液组中加入黄芪注射液后,凋亡峰值是1.650.09。单纯血清培养液组中+200g/ml的黄芪注射液培养，细胞凋亡的百分比小于0.5(0.30.07)。这些数据表明，黄芪注射液可增强对MKN45细胞的抗凋亡(图4)，可以作为检测用MTT有效地抑制皮细胞诱导MKN45凋亡(图5)。3.3 原位细胞凋亡检测皮细胞经胃癌细胞线MKN45无血清培养基治疗48小时，细胞凋亡形态发生明显改变，例如凝聚的染色质，核碎裂和凋亡小体(图6)。与其他三组相比，加入胃癌细胞线MKN45无血清培养基后细胞凋亡数目有所增加。而当绿色的细胞数量增加时，细胞凋亡的数量减少（图6B和C）。黄芪注射液抑制胃癌细胞诱导皮细胞的凋亡，同时正常胃粘膜上皮细胞系GES-1不能诱导皮细胞的细胞凋亡(图6E)。在加入黄芪注射液后细胞凋亡数目减少(图6B和C)。3.4 西方论点我们划定了黄芪注射液诱导皮细胞凋亡的基本机制。我们研究黄芪注射液对Bcl-2和Bax表达的影响。皮细胞以黄芪注射液治疗24h后，Bcl-2表达增加，Bax蛋白表达减少(图7)。4 结论据报道， mseothelial细胞能够预防癌症的入侵和表达癌细胞释放因素而进行形态变化22。这种现象可以解释为“种子和土壤”理论：只有一些活的和在适宜环境中成长的肿瘤细胞转移时发生。腹膜对胃癌细胞来说可能是一个和谐的环境，皮细胞可以防止癌细胞渗入分皮结缔组织。据报道，腹腔肿瘤细胞能释放早期炎症因子和诱导腹膜间皮细胞23,24。分皮结缔组织的裸露部分会暴露于腹腔，腹膜会受到损伤，而皮细胞成为半球形会发生脱落，适宜腹膜的转移25。在本研究中，胃癌细胞上清液可能会严重影响皮细胞的活力，而正常胃粘膜系GES-1对上皮细胞则不能。在显微镜下对比，皮细胞成为半球形和发生剥离时无血清培养基中加入了皮细胞培养。此外，在透射电子显微镜下观察胞浆萎缩， 核收缩，并形成外和/或内细胞凋亡小体。黄芪注射液可以部分抑制这些形态的变化。 此外，还可以利用荧光显微镜和流式细胞仪观测细胞凋亡的数量，表明胃癌细胞释放的因素在腹部腔诱导间皮细胞，导致剥离并最终转移。其机制可能是由于癌细胞进入分皮结缔组织。更多的试验将继续进行，以便更好地表征胃癌细胞诱导的凋亡信号。我们的研究表明，黄芪注射液能抑制胃癌细胞上清液诱导人腹膜间皮细胞的凋亡，表明当人腹膜间皮细胞暴露于黄芪注射和胃癌细胞上清液时，该形态变化会有所减少。此外，黄芪注射液能制约Bcl-2和Bax的表达。Bcl-2抑制细胞线粒体的凋亡的途径，通过阻止凋亡途径发挥其活性，而这反过来又阻碍细胞色素C和活化半胱氨酸蛋白酶的释放26,27。本研究结果表明，黄芪注射液治疗皮细胞大大增加Bcl-2在皮细胞中的表达，表明黄芪注射液通过保持Bcl-2的表达发挥其抗凋亡的影响(图6)。Bax基因是一个死亡的增速剂，它位于heterodimerization与Bcl-2之间。当Bax进入线粒体膜外，泄漏的细胞色素C就会从线粒体进入细胞质28。半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3按顺序被激活导致DNA染色体出现故障。在本研究中，MKN45大大增加了Bax在间皮细胞中的表达，而黄芪注射液部分抑制了Bax的表达，这表明黄芪注射液介质对皮