顶空气相色谱法和荧光分析.doc

顶空气相色谱法测定血液中乙醇的含量一 目的要求1. 掌握顶空气相色谱法测定血液中乙醇含量的原理2. 熟悉顶空进样法特点及操作条件。二 基本原理判断酒后驾车司机清醒程度的一个重要指标是血液中的乙醇浓度的高低。因为血液含有蛋白质及内源性杂质，如不采用前处理方法就直接进行气相色谱法测定时会污染色谱系统。顶空气相色谱法(Head Space Gas Chromatography HSGC)是顶空进样与GC分析相结合的一种分析方法，其特点是通过测定样品基质上方的气体成分来确定那些在一定温度下可以汽化的组分在样品中含量。顶空进样方法实质上是一种气相萃取方法，它是基于在一定的条件下，某些物质的气相和凝聚相（液相或固相）之间存在着分配平衡，所以测定气相的组成就可知凝聚相的组成。由于仅取了凝聚相上方的气相部分进行分析还可以大大减少样品基质对分析的干扰，因此顶空分析是一种理想的样品净化方法，特别适合高沸点样品中低沸点成分的测定。乙醇是一种低沸点的有机物，采用HSGC法分析血液中乙醇含量时，只要采用适当的顶空平衡温度就可以控制进入气相色谱柱的成分为易挥发性成分，因此可以避免血液中其他杂质的干扰，避免色谱柱的污染。所以这种技术可以方便的用于测定血液中乙醇的含量。三 仪器与试剂SHIMADZU GC14气相色谱仪(FID检测器)、PerkinElmerTurboMatrix40顶空仪，无水乙醇、正丙醇。四 操作步骤1. 色谱条件顶空条件：顶空平衡温度为50，平衡时间30min；进样时间0.04min，加压时间0.5min，拔针时间0.02min，进样针温度：100；传输线温度：105。色谱柱： DM-WAX毛细管柱（30m0.53mm1.5m），进样口温度：200；检测器温度：250；柱温：50。 2对照溶液配制精密量取无水乙醇适量，用水配成10mg/mL的对照储备液。精密吸取该储备液适量，用水稀释制成0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，5.0mg/mL浓度的对照品溶液。3. 内标液的制备精密量取正丙醇适量，用水配制成10mg/mL的内标储备液，再用水稀释成1mg/mL的内标溶液。4. 血样标准曲线 取空白全血1.0mL，精密加入0.5mL系列浓度对照品溶液，并分别加入内标溶液0.5mL,迅速密封。顶空进样测定。以乙醇与正丙醇峰面积比对乙醇浓度计算回归方程.5. 血样测定取血液样品1.0mL，精密加入水0.5mL，内标溶液0.5mL,迅速密封。顶空进样测定。由回归方程计算血样中乙醇浓度。五 思考题1. 如何验证本次实验分析方法的专属性？六 参考文献刘虎威主编.气相色谱方法及应用（第二版）.化学工业出版社，2001.04实验二十一 荧光法测定氧氟沙星含量实验条件的初步选择一 目的要求1. 学习F一2500型荧光分光光度计的使用方 法。2. 观察几种因素对荧光分析准确性的影响。二 基本原理荧光的产生与物质的分子结构有关，但荧光分子所处的外部环境会影响荧光光谱的形状和强度。影响荧光的因素主要有：温度、溶剂、酸度、荧光熄灭剂、浓度及杂散光。在一般情况下随着温度的升高荧光效率和强度会降低，所以在实验中应尽可能避免高温及荧光熄灭剂的引入，而对于酸度和溶剂的影响及待测物的浓度需要通过实验进行考察后确定。在荧光分析法中，散射光对测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光可能与荧光物质发射光的波长接近，从而导致对测定结果产生较大影响大，所以在选择发射波长时应注意避免拉曼光的干扰。建立荧光分析条件时，通常应先根据待测物的溶解度选择适当溶剂，然后考察确定酸碱度对荧光生成的影响。在确定最佳pH值之前，可以先大致确定能产生较大荧光强度的pH范围，然后再仔细确定荧光产生的最佳pH值、缓冲溶液种类及其浓度等因素。氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）属喹诺酮类药物，是临床常用的广谱抗生素。因其具有共轭体系和刚性结构，所以能在一定条件下产生荧光。OFL是两性分子，在甲醇中微溶；在冰醋酸中易溶，在稀酸或0.1ml/L氢氧化钠中略溶。在强酸性溶液中，OFL可以结合两个质子而以H3L2+的形式存在，最大荧光发射波长(max)大概为505 nm。随着pH值升高, H3L2+逐渐失去4位C羰基氧结合的质子。在pH 2.5 4范围内, OFL以H2L+形式存在，当pH4时，随pH值升高C-3位羧基质子的离解，发射光谱向蓝移。在pH 7左右, OFL以HL形式存在，是最强的荧光型体。当pH8时，随pH值升高，荧光强度下降，可能是由于HL失去哌嗪环N-4上结合的质子。当pH10时, OFL以阴离子L形式存在，荧光强度随pH值升高而降低。由于介质环境对OFL的荧光性质有明显影响，所以在建立OFL的荧光分析方法时需确定最佳荧光产生条件。三 仪器与试剂F一2500型荧光分光光度计；氧氟沙星， pH=2.0，4.0，6.0，7.0，8.0，的醋酸盐缓冲液，pH=9.0的硼砂缓冲液四 实验方法取氧氟沙星对照品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加0.5mol/L醋酸10ml溶解后加水稀释至刻度，摇匀，作为储备液。1pH值对氧氟沙星荧光光谱的影响精密量取上述储备液5ml置50 ml量瓶中，分别加各种pH的缓冲液20ml，加水至刻度，摇匀，在荧光分光光度计上扫描其激发光谱和发射光谱，观察pH对氧氟沙星激发光谱和发射光谱及荧光强度的影响，确定本次实验的最佳pH值。2. 发射波长的确定根据上述实验的考察结果将加入适当pH的缓冲液20ml置50 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，在适当激发波长下进行测定，观察拉曼光的波长位置，选择确定激发波长。3. 溶液浓度对荧光测定的影响精密量取上述储备液0.1，0.5，1.0，5.0，10.0ml置50 ml量瓶中，分别加pH=7.0的缓冲液20ml，加水至刻度，摇匀，在已确定的激发波长和发射波长处进行测定，观察浓度对荧光强度的影响。4. 温度对对荧光测定的影响精密量取上述储备液5ml 4份，分别置50 ml量瓶中，加pH=7.0的缓冲液20ml后加水至刻度，摇匀，分别在10，室温，35，40放置恒温后，在已确定的激发波长和发射波长处进行测定，观察温度对荧光强度的影响，确定本次实验应该选择的温度。5. 标准曲线制作精密量取储备液适量（应使浓度跨两个数量级）分别置50mL量瓶中，加pH=7.0的缓冲液20ml后加水至刻度，摇匀，在已确定的激发波长和发射波长处进行测定，建立校正曲线。五 注意事项荧光分析法因灵敏度高，故干扰因素也多。1.溶剂不纯会带入较大误差，应先作空白检查，必要时，应用玻璃磨口蒸馏器蒸馏后再用。2.溶液中的悬浮物对光有散射作用，必要时，应用垂熔玻璃滤器滤过或用离心法除去。3.所用的玻璃仪器与测定池等也必须保持高度洁净。4.温度对荧光强度有较大的影响，测定时应控制温度一致。5.溶液中的溶解氧有降低荧光作用，必要时可在测定前通入惰性气体除氧。6.测定时需注意溶液的pH值和试剂的纯度等对荧光强度的影响。六 思考题1. 干扰荧光分光光度法测定的因素有哪些？2. 应如何确定被测物的激发和发射波长？七 参考资料中华人民共和国药典（201005版,二部）：附录 E，荧光分析法某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以用作该物质的定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。荧光分析法的灵敏度一般较紫外-可见分光光度法为高，但浓度太高的溶液会有“自熄灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分析法应在低浓度溶液中进行。测定法 所用的仪器为荧光计或荧光分光光度计，按各品种项下的规定，选定激发光波长和发射光波长，并制备对照品溶液和供试品溶液。通常荧光分析法都是在一定条件下，用对照品溶液测定荧光强度与浓度的线性关系。当线性关系良好时，可在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液校正仪器的灵敏度；然后在相同的条件下，分别读取对照品溶液及其试剂空白的荧光强度与供试品溶液及其试剂空白的荧光强度，用下式计算供试品浓度：式中 Cx为供试品溶液浓度； Cr为对照品溶液浓度；Rx为供试品溶液的荧光强度；Rxb为供试品溶液试剂空白的荧光强度；Rr为对照品溶液的荧光强度；Rrb为对照品溶液试剂空白的荧光强度；应荧光分析法中浓度与荧光强度的线性较窄，故(RxRxb)(Rr Rrb)应为0. 52；如有超过，应在调节溶液浓度后