DNA分子标记在林木遗传育种中的应用及进展.doc

DNA分子标记在林木遗传育种中的应用及进展第二十一卷第九期2006年9月楚雄师范学院学报JOURNALOFCHUXIONGNORMALUNIVERSnIYVo1.21NO.9Sep.2006DNA:fry子标记在林木遗传育种中的应用及进展吕志华(大理学院,云南大理671000)摘要:DNA分子标记是目前林木遗传育种研究中使用最为广泛的一种分子标记技术,本文综述了分子标记的发展过程,介绍了DNA分子标记在林木育种上应用情况,认为RAPD分子标记技术更适用于林木辅助选择育种.关键词:DNA分子标记;林木育种;RAPD中图分类号:Q946.33文章标识码:A文章编号:16717406(2006)09006809随着人口的迅速增长和人类活动的加剧,人们在改变自然界的同时有意无意地破坏了环境,生物多样性受到了空前严重的威胁,”无法再现基因,物种和生态系统正以人类历史上前所未有的速度消失”,所以当今社会人类正面临着能源,资源,人口,粮食和环境五大危机,而生物多样性的保护和利用是解决这些危机的关键所在.从基因,细胞,物种到种群乃至整个生态系统,每一级生命实体都具有多样性,它包括地球上所有动物,植物,微生物和它们拥有的全部基因以及它们与生态环境形成的复杂的生态系统2j,生物多样性(biodiversity)就是生物及其环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态过程的总和,它包括了3个层次,即生态系统多样性,物种多样性和遗传多样性.1遗传多样性的研究进展1859年达尔文在物种起源中揭示了生物界普遍存在着的,由于生物体内遗传物质发生变化而导致的可遗传的变异现象,这种可遗传的变异即遗传多样性.遗传多样性在居群水平,个体水平,组织和细胞水平以及分子水平上均有体现j,所以对它的研究是随着生物学研究层次的深入和实验手段的改进逐步发展的.所谓标记(markers),即代表一个位于染色体上已知位点的基因或一种清晰的表现性状_6j,在遗传学中将基因型的特殊易于识别的表现形式称为遗传标记(geneticmarkers)J,遗传标记就是检测遗传多样性的基本手段,它经历了由形态标记,细胞标记,同工酶标记到分子标记的发展过程,其中分子标记直接检测DNA,其它三种方法是检测DNA的表达产物.但是任何一种标记都存在优点和缺点,迄今为止,还没有能完全取代其他方法的标记技术.1.1形态标记(morphologicalmarkers)形态标记是检测遗传多样性最直接最简便易行的方法,是检测生物体表型性状变异的收稿日期:20060428作者简介:吕志华(1978一),女,硕士研究生,助教,现在大理学院生命科学与化学学院任教.?68?楚雄师范学院学报2006年第9期吕志华:DNA分子标记在林木遗传育种中的应用及进展最初的遗传标记.由于基因的表达,调控,个体发育等使得基因型上的差异能通过表型来反映,所以可通过对亲本和子代的形态特征的比较和有效的采样方案,运用数学统计方法,对其质量性状和数量性状进行研究,揭示这些性状的遗传规律,变异大小及种群的遗传结构(毕玉芬等,1999)j.通常所用的表型性状有两类,一是符合孟德尔遗传规律的单基因性状,二是由多基因所决定的数量性状,但是形态特征是遗传和环境,结构基因,调控基因综合作用的结果l9j,表型的遗传多样性并不能完全或真实地反映生物的遗传多样性,因为在不同的生境下,同一种基因型可以发育成不同的形态而相同的形态又可能涉及不同的基因型【1o,所以形态标记虽然可以通过结合野外调查,子代测定等手段在短期内对所研究物种的遗传变异水平有一个基本认识,但易受环境条件及基因显隐性影响且遗传表达不稳定,还必须进行更深层次的研究.1.2细胞学标记(cytologicalmarkers)染色体是遗传物质的载体,是基因携带者,染色体的变异必然发生遗传变异.细胞学标记通过研究染色体的核型(染色体数目,形态和结构)和带型(C带,N带,G带)的变异进行研究遗传多样性,它能够从染色体数目即整倍体和非整倍体的变异,形态即染色体着丝点的位置,缢痕和随体等的变异,结构即倒位,缺失,重复等变化反映动植物种,品种和品系间的亲缘关系.但是对于染色体数目相同,形态相似的种或种群的个体,单纯用染色体多样性来研究遗传多样性就失去了分辨能力(王中仁,1994),而且需要花费大量的时间和精力来培育染色体分析的材料.1.3同工酶标记(biochemicalmarkers)20世纪50年代以后出现的蛋白质电泳技术,使根据具有的相同生物功能但蛋白质组成不同的酶来反映个体或群体之间差异的同工酶标记发展起来了.酶是基因表达后的产物,其多肽链中的氨基酸序列由结构基因的核苷酸序列决定,由于构成酶蛋白亚基的氨基酶组成和顺序不同而产生了同工酶.同工酶以共显性方式表达,通过对各种电泳谱带的分析,对其遗传基础做出解释,将同工酶谱带的变异与等位基因变异等同起来,识别出控制这些酶的基因位点和等位基因,从而达到在基因水平上研究生物体的目的.同工酶具有明显的种属特异性和组织特异性,遗传性稳定,被广泛应用于品种(或类群)间亲缘关系的比较,品种起源的研究,种群遗传结构的分析,品种类型的化分,杂种优势的预测等方面.同工酶也有其局限性.首先,它只是基因的表达产物,所以易受环境因素和发育状态的影响.其次,同工酶只能分析那些编码酶的基因,对于整个基因组来讲,它研究的位点数及每个位点能检测的等位基因数是非常有限的,蛋白质中仅约30%是可溶的,而且在编码这些蛋白的结构基因中只有25%的变异会导致电荷的变化l】,有些隐蔽突变可能无法通过电泳检测到,可能会低估遗传变异的量,所以等位酶位点的变异并不能代表整个基因组实际变异情况.此外,同工酶标记对取材要求严格,酶活性易受环境和生理的影响,这给野外取材带来很大困难.1.4分子标记(molecularmarkers)20世纪70年代以来,随着DNA重组,分子杂交,PCR等分子生物学技术的快速发展,诞生了一种重要的遗传标记一DNA分子标记.DNA分子标记本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段l】,它直接检测DNA本身的序列变化,以蛋白质,核酸分子突变为基础,反映了包括DNA的编码区和非编码区,保守区和高变区,核.69?楚雄师范学院学报2006年第9期楚雄师范学院学报2006年第9期DNA和细胞器DNA的遗传变异,避免了根据表型性状来推断基因型以及同工酶检测遗传变异时可能发生的各种问题,成为目前最有效的遗传多样性分析方法.DNA分子标记与其它遗传标记相比有以下优越性:(1)DNA标记直接以DNA的形式表现,不受环境和季节的限制,取材范围广泛,在发育的不同阶段,不同组织的DNA均可进行检验,不影响目的基因的表达,与不良性状无必然联系,使得对植株基因型的早期选择成为可能183;(2)DNA分子标记直接分析的是基因型而不是表现型,不受环境等因素的影响;(3)标记数量几乎是无限的,遍及整个基因组;(4)DNA标记多态性和灵敏度高,检测速度快;(5)大多数分子标记表现为共显性,能为纯合基因型和杂合基因型的鉴别,提供完整的遗传信息1.因此DNA分子标记一经问世就以其独特的优越性广泛地应用于生物遗传变异研究的各个方面,受到了遗传育种学家的高度重视.2DNA分子标记技术在林木育种上的应用分子标记按照其采用的基本方法的不同,大致可分为三类:(1)以Southern杂交技术为基础的分子标记,如限制性酶切片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymor-phism,RFLP),DNA指纹(DNAfingerprinting,DAF);(2)以PCR(PopymeraseChainRe-action)为基础的DNA扩增方法,主要有随机扩增多态性DNA(RandmAmplifiedPolymor-phicDNA,RAPD),序列标记位点(Sequencetaggedsite,STS),任意引物PCR(Arbitrari-ly-primedPCR,APPcR),序列特异性扩增(Sequencecharacterizedamplifiedregion,SCAR),小卫星DNA(MinisatelliteDNA),简单序列重复长度多态性(Simplesequencere-peat,SSR),简单重复序列间扩增(Intersimplesequencerepeat,ISSR)等;(3)是PCR与酶切相结合的方法,主要指扩增片段长度多态性(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP),割裂扩增多态性(CleavedAmplifiedPolymorphicSequence,CAPS)等标记.2.1限制性酶切片段长度多态性标记RFLP标记是由于不同个体的等位基因之间碱基的替换,重排,缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异.该技术由美国学者Bostein等于1980年提出,开创了直接应用DNA多态性遗传标记的先河,其基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况引,凝胶电泳后,将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,然后与克隆DNA探针进行Southern杂交,通过放射自显影或其它显色技术显示杂交结果2,即获得反映个体特异性的RFLP图谱.RFLP最根本的依据是一个生物体基因组结构的独特特征即能被某些限制性内切酶识别的特殊碱基序列特有的分布方式2.RFLP是一种共显性标记,可区分纯合基因型和杂合基因型,能提供单个位点上较完整的遗传信息;此外,RFLP标记可提供大量位点,通常检测到的基因座位数为1个口,且不受环境条件,显隐性关系,组织特异性的影响,为建立高密度遗传图谱,研究遗传多样性等提供稳定的标记.但RFLP标记需要大量的DNA,检测步骤较多,技术复杂,有效探针有限而且成本较高,尤其需要使用放射性同位素,影响了该技术的广泛应用.2.2简单序列重复长度多态性标记SSR又称微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)是以PCR为基础的分子标记.1982年Hamada等人在人心肌动蛋白的内含子中发现一个25次重复的dTdG序列,研究表明,类?70?楚雄师范学院学报2006年第9期吕志华:DNA分子标记在林木遗传育种中的应用及进展似的简单重复序列在真核生物中普遍存在,大约每隔1015kb就存在1个微卫星.SSR标记的基本原理是每个SSR的重复序列和重复单位数在不同基因型间差异很大,因而形成了每个座位上的多态性.SSR标记的优点在于:大多数SSR标记无功能作用,增加或减少几个重复序列的数量不影响生物的正常发育,在品种间具广泛位点变异,在基因组中分布较均匀,比RFLP和RAPD标记所检测的多态性频率高;SSR为共显性标记,重复性好,对DNA质量要求不高,仅需微量即使是降解的DNA也能进行有效的分析.但是SSR标记与RFLP技术类似,操作复杂,筛选重复序列和引物设计过程需要投人大量的精力和时间,因而限制了该技术的应用.2.3扩增片段长度多态性标记AFLP是由Zabean和Ros于1992年发明的一项利用PCR技术检测DNA多态性的技术,已获欧洲专利局的发明专利.其基本原理是将DNA用限制性内切酶酶切,然后连上一个接头(Adaptor),根据接头的核苷酸和酶切位点序列设计引物,即引物=接头+酶切位点+23个随机核苷酸,利用两个选择性引物进行特异性PCR扩增,扩增结果通过变性凝胶电泳显示.为了使酶切浓度分布均匀,该实验采用两个限制性内切酶,一个酶切的位点多,另一个酶切的位点少.AFLP标记独特之处在于专用引物可以在不知道DNA序列的前提下就可对许多酶切片段进行PCR扩增,从而检测DNA的多态性.AFLP分析是将RFLP的高稳定性和RAPD的高效性和灵敏性巧妙结合,它避免了RAPD标记重复性差,假带比例较高,同时,免去了RFLP标记的探针制备,Southern杂交等繁难的实验过程,又通过选用具有特异识别位点的限制性内切酶以达到选择的目的,是多态性最丰富的一项技术.但是AFLP标记不足之处在于:得到的主要是显性(约占多态位点数的85%_96%)而非共显性标记;此外,扩增产物需要同位素检测,实验所用试剂盒为专利产品,成本较高;操作过程繁琐,实验周期较长,这都限制了该技术的使用.2.4随机引物扩增DNA多态性标记RAPD是以PCR为基础的分子标记技术,以基因组DNA为模板,以随机排列碱基顺序的寡核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物,通过PCR扩增反应,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳,经EB染色,于紫外灯下摄影来检测DNA序列的多态性.RAPD技术由Williams和Welson两个研究小组于1990年分别独自建立,其基本原理是模板DNA在94qC变性解链后,模板DNA与引物在约37C退火温度下互补形成双链结构,如果基因组DNA两个位点间的距离在可扩增范围(约200-4000bp)内,与引物的3端相对且分别位于两条互补的单链上,通过延伸和循环就可得到一个扩增产物即基因组的一个位点.由于RAPD所用的引物序列各不相同,但对于任一特定的引物,它与基因组DNA序列结合有其特定的位点且分布在基因组一定的区域中,如果在这些区域发生了DNA片段的插人,缺失或碱基突变,就会导致这些结合位点发生增加,减少或分子量的变化,这些DNA片段的多态性反映了基因组相应区域DNA的多态性.RAPD技术具有独特的优越性:第一,所用的引物的碱基序列是随机排列的,无需专门设计,虽然每个引物可检测的DNA多态性是有限的,但是可用的引物数量众多,理论上能覆盖整个基因组;第二,对DNA质量和数量的要求低,无需事先分析基因组DNA序列,也不需要克隆DNA探针,可以在没有任何分子生物学研究背景下就可分析DNA多态性.?71.楚雄师范学院学报2006年第9期楚雄师范学院学报2006年第9期但RAPD易受各种实验因素,如模板DNA,引物,Tag酶,dNTP,Mg”浓度,反应温度等影响,实验过程是超微量操作,导致了它稳定性和重复性差,这就要求必须通过严格控制反应条件,规范操作,使反应标准化;此外RAPD技术是显性标记,不能区分纯合子和杂合子,而且错配机率较大,导致假带比例增加影响扩增结果.尽管如此,RAPD技术仍以其简单的操作,较低的实验成本成为目前应用最为广泛的检测遗传多样性的分子标记方法.每种分子标记具有其独特的特点,所以具体使用那一种分子标记既取决于该技术被利用的范围和效率,又要考虑研究对象的遗传背景,研究目的及实验条件.表1列举了常用的几种分子标记的一些特点,综合比较后,本研究选用简便有效的RAPD技术,对油松种子园的遗传结构和多样性进行分析.表1RFLPAFLPSSRRAPD分子标记的比较TablelComparisonofseveralmainmolecularmarkers类型RFISSRAFIRAPD遗传特性共显性共显性显性/共显性显性多态性中等较高高较高检测部位低拷贝序列整个基因组整个基因组整个基因组技术难度难易较难易信息量低较高高较高检测基因位点数l一3l-520一l00ll0一DNA质量要求向低低低DNA用量5一l0ng50ng<50ng<50ng放射性是否否否探针DNA短片段专一性引物专一性引物随机引物一费用中等向高低实验周期长较短较短短3RAPD分子标记技术在在林木辅助选择育种中的应用林木具有树体高大,世代周期长,杂合度高等特点,受其生物学特性的制约,林木育种一直相对滞后于农作物,而分子标记技术的迅猛发展给传统的林木遗传改良带来了深刻的变化,RAPD技术更以其快捷,高效,分析成本低等优点广泛于林木遗传育种的各个方面.3.1遗传结构及多样性研究林木是以异交为主的育种材料,高水平的遗传多样性是林木育种的基础,RAPD技术能够提供大量的遗传变异信息,可以有效地检测因遗传漂变,迁移,突变和选择等因素造成的遗传变异,而且是研究树种群体遗传结构,估计从自然林分取样策略的效率,了解基因?72?楚雄师范学院学报2006年第9期吕志华:DNA-y子标记在林木遗传育种中的应用及进展渗入及流动作用,相关类别间的杂交和它们在产生和维持遗传多样性中的作用,从而鉴定具有遗传多样性和生产力最佳搭配的群体的有力工具.一些国家利用RAPD技术先后开展了对红松(PinuskoraiensisSieb),辐射松(Pinusradiata)351,日本落叶松(Larixlaricina)及欧洲山杨(Populustremula)等树种的遗传结构进行研究.陈由强等利用2O个随机引物对12个杉木种源多态性分析表明,149个RAPD被测位点中,多态位点占77.2%,种源间遗传多态性较高,并将12个种源划分为三类,这与尤勇等对7个杉木种源的RAPD分析结果基本一致.苏晓华等利用RAPD检测出大青杨(PopulusussuriensisKom.)天然群体在多态位点百分率和多样度上差异较高,表明大青杨是变异丰富的树种.李建民等用RAPD标记方法对马褂木15个种群的遗传多态性进行了分析,发现马褂木具有丰富的遗传多态性,根据遗传距离将马褂木分为东,西部两个种源区,西部区又细分为西南亚区和华中亚区,这样利用RAPD技术分析遗传结构时,能够克服在聚类分析时依据单个地点的种源材料难以正确归类的不足.RAPD标记既能揭示遗传背景差异很大的物种之间的遗传多样性,也能准确估测遗传背景差异很小的种内遗传变异,是探测遗传多样性最大范围的有效工具.3.2构建遗传连锁图谱遗传图谱(geneticmap)又称连锁图(1inkagemap),是以具有多态性的遗传标记为路标,以两个位点的交换率为图距的图谱,它包括将基因定位于某一特定染色体上,以及测定基因在染色体上线性排列的顺序和距离.遗传图谱的构建是对林木基因组系统研究的基础,是林木遗传育种和转基因的有力工具.RAPD标记能够直接检测基因组的遗传多态性的同时完成对这些多态位点的遗传作图,为抗虫,抗病和其他性状基因定位提供了框架结构.自1992年TulsieramL.K.等第一次以RAPD标记构建白云杉遗传图谱以来,已在2O多个树种开展了遗传图谱的构建工作,其中对针叶树松属(Pinus)及阔叶树的桉属(Eucalyptus)和杨属(Populus)树种研究较迅速,目前已构建图谱的树种有湿地松(P.elliottii),火炬松(P.taeda),马尾松(P.massoniana),巨桉(E.grandis),欧洲山杨(P.tremula)等.但从报道的情况看,遗传图谱的标记大部分小于300个,密度较低,有必要进行深入分析,构建高密度的遗传图谱.3.3数量性状基因定位数量性状位点(QuantitativeTraitLoci,即QTL)是指与一定标记连锁或相关,且影响某一数量性状的染色体区域.QTLs定位,阐明了控制有关数量性状的主要基因数目,这些基因在染色体上的位置及其自效应和联合效应的遗传图.过去对数量性状基因位点的研究主要采用数量遗传学方法来研究遗传结构,但不能说明控制数量性状的基因数目,位点的位置,各点贡献率的大小及基因问的相互关系.而RAPD标记可以从DNA水平上的多态性差异得到与此连锁的DNA标记,从而实现了表型选择到基因型选择的过渡,进而在分子水平上对数量性状进行研究.目前用QTLs定位研究的树种有火炬松,桉树,杨树,糖松,辐射松等,主要集中于经济性状,如生长,抗性,木材密度等.李金花等用RAPD检测了美洲黑杨(母本)与青杨(父本)杂交所得的F,群体中与苗高,地径,封顶期有关的QTLs,检测出与这三个数量性状关联的7,6和3个标记座位.Grattapaglia用5个QTLs位点解释了巨桉木材密度变异的37.2%.进一步利用QTLs定位成果进行标记辅助选择可大大加快育种进程.3.4分子标记辅助选择育种.73.楚雄师范学院学报2006年第9期楚雄师范学院学报2006年第9期常规育种主要依赖于表型选择,往往要几年甚至几十年,分子标记辅助选择育种(Marker-assidtedselection,MAS),是指通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记判断目标基因是否存在,这种间接选择的方法不受其他基因效应和环境因素的影响,因而结果可靠,还可以在早期进行选择,大大缩短了育种周期,尤其对于林木这种长世代的物种来说具有重大意义.利用与目标质量性状基因紧密连锁的分子标记,是进行质量性状选择的有效途径,如Gianftanceschi(1996)等将与苹果树(MaluspumilaMil1.)抗疮痂病性状紧密连锁的标记应用于育种,加快了其育种进程,而南抗杨(P.deltoids)新品种中抑制害虫的物质和与抗虫相连锁标记的发现,为杨树抗虫育种提供了依据.此外,一些重要的数量性状基因被绘制到连锁图上,并找到了与其紧密连锁的分子标记用于育种实践,如Claire等利用火炬松遗传图谱确定了与木材密度QTLs两侧紧密连锁的分子标记,从而对火炬松木材密度进行早期测定.RAPD标记技术以其独特的优点,成功地应用于林木遗传育种,尤其是在遗传多样性研究和植物群体遗传分析方面已经发展成为一种常规的技术手段.虽然RAPD技术存在重复性和稳定性欠佳等缺点,但仍是林木辅助选育工作中其他分子标记难以替代的技术手段.参考文献:1Wrieta1.全球生物多样性策略M.马克平等译.北京:中国标准出版社,1993.110.2McneelyJA.保护世界的生物多样性M.李文军等译.生物多样性译丛(一).北京:中国科学技术出版社,1992,1.94.3陈灵芝.中国的生物多样性一现状及其保护对策M.北京:科技出版社,1993.1_9.4董玉琛.生物多样性及作物遗传多样性,作物品系资源,1995,3:1.5.5MoritzC,HillisDM.Molecularsystematicsz:ContextandcongtroversiesM.InHillisDMandMoritzCeds.MolecularSystematics.Sunderland:Sinauer.1990.1-11.6KingRC,StansfieldWD.ADictionaryofGeneticsM.NewYorkOxford:OxfordUnivPress.1983.7贾继增.分子标记种质资源鉴定和分子标记育种J.中国农业科学,1996,29(4):110.8毕玉芬,卢欣石.植物遗传多样性及种群生态学研究进展J.甘肃农业大学学报,1999,34(1):1.5.9BrochmannC,SoltisPS.RecurrentformationandpolyphylyofNordicPolyploidsinDraba(Brassicaceae)J.Amer.Bot.1992,79(6):673688.10严华军,吴乃虎.DNA分子标记技术及其在植物遗传多样性研究中的应用J.生命科学,1996,8(3):3236.11王中仁.植物遗传多样性和系统学研究中等位酶分析J.应用生态学报,1994,2(2):3843.12周奕华,陈正华.分子标记在植物学中的应用及前景J.武汉植物学研究,1999,17(1):7586.?74?楚雄币范学院学报2006年第9期吕志华:DNA分子标记在林木遗传育种中的应用及进展13胡守荣,夏铭等.林木遗传多样性研究方法概况J.东北林业大学学报,2001,29(3):7275.14李齐发,谢庄.中国地方品种牛血液同工酶遗传多样性研究进展J,黄牛杂志,2001,27(4):3539.15WeirBS.Geneticdataanalysis:methodsfordiscretepopulationgeneticdataM.s./laurAssociatesIne,1990,7.16陈家宽,杨继主编.植物进化生物学M,武汉大学出版社,1994,153194.17傅荣昭.生物工程进展J.1998,18(4):1416.18毛健民,李俐俐.DNA分子标记及其在作物遗传育种中的应用J.周口师范高等专科学校学报,2001,18(5):495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