ELISA实验标本的采集、处理和保存.doc

ELISA实验标本的采集、处理和保存发布时间:2009-10-19ELISA实验标本的采集、处理和保存能够应用ELISA 实验的样本种类很多，有血清，血浆，细胞上清，细胞裂解液，尿液，关节滑液，脑脊液，肺泡灌洗液，各种组织的组织匀浆；采集和处理的方式都不相同。下面就列出了biotnt 收集的给类样本的采集、处理和保存方式。方法大多出自文献和试剂盒说明书，部分方法经Biotnt 验证过，但有的方法并没有实际操作过，所以，以下方法仅供参考。 一、ELISA实验中血清的采集、处理和保存；1、 真空采血针采集2ml新鲜血液，加入无菌试管中；2、 采血后室温静置1小时；3、 将采集血液用离心机4，2500rpm离心10min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。4、 取上清。 分装冻存备用，2-8下，可放置保存24-48小时；-20下，可放置保存1个月；-70下，可放置保存6个月； 5、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的 ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染，因为菌体中可能含有含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜 时检测。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。二、ELISA实验中血浆的采集、处理和保存；1、 真空采血针采集2ml新鲜血液，加入无菌试管中；2、 按1:9加入抗凝剂（EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠），30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染；（也可以直接用抗凝管采集）；3、 将采集血液用离心机4，2500rpm离心5min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。4、 取上清。 分装冻存备用，2-8下，可放置保存24-48小时；-20下，可放置保存1个月；-70下，可放置保存6个月； 5、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求，建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。注意事项：制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。三、ELISA 实验中尿液的采集、处理和保存；1、 采集尿液样本500ul，加入无菌试管中；2、 将采集血液用离心机4，2500rpm离心10min，将离心好的样本留上清，弃下面沉淀。3、 取上清。 分装冻存备用，2-8下，可放置保存24-48小时；-20下，可放置保存1个月；-70下，可放置保存6个月； 4、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。四、ELISA 实验中脑脊液的采集、处理和保存；1、采集脑脊液样本，加入无菌试管中；2、将采集血液用离心机4，2500rpm离心10min，将离心好的样本留上清，弃下面沉淀。3、取上清。 分装冻存备用，2-8下，可放置保存24-48小时；-20下，可放置保存1个月；-70下，可放置保存6个月； 4、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。五、ELISA 实验中细胞上清液的采集、处理和保存；1、采集细胞培养上清液500ul，加入无菌试管中；2、将采集血液用离心机4，2500rpm离心10min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。3、取上清。 分装冻存备用，2-8下，可放置保存24-48小时；-20下，可放置保存1个月；-70下，可放置保存6个月； 4、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。六、ELISA 实验中细胞裂解液的采集、处理和保存；（需要测蛋白浓度）1、 取细胞培养板或细胞悬液，用PBS（PH7.2-7.4）洗涤细胞培养板1-2次。2、 通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂（裂解液），使细胞破坏并放出细胞内成份。3、 将采集血液用离心机4，2500rpm离心20min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。4、 取上清。 分装冻存备用，2-8下，可放置保存24-48小时；-20下，可放置保存1个月；-70下，可放置保存6个月； 5、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。七、ELISA 实验中肺泡灌洗液的采集、处理和保存；1、 10%水合氯醛溶液，腹腔麻醉。2、 打开腹腔，另取10ml注射器行下腔静脉采血，尽可能将血放尽。3、 在冰面上对左肺进行肺灌洗。取37生理盐水5ml，分三次灌洗：2ml、1.5ml、1.5ml灌洗。回收率在70%以上。4、 将肺泡灌洗液用离心机4，1500rpm离心10min。 5、 取上清。 分装冻存备用，2-8下，可放置保存24-48小时；-20下，可放置保存1个月；-70下，可放置保存6个月；6、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。八、ELISA 实验中关节滑液的采集、处理和保存；1、 口腔关节：患者取坐位，常规消毒后，作皮下及关节后区局部浸润麻醉。然后嘱患者大张口，采用装有2ml生理盐水的注射器（5号针头）作关节上腔 穿刺，髁后进针，针尖方向斜向前、内、上，抵达关节结节后斜面后稍后退，回抽如发现有淡黄色液体，即表明已进入关节上腔，注入2ml生理盐水，反复注入、 回抽五次。 膝骨关节滑液：无菌穿刺取得关节液。2、 将关节液用离心机4，1500rpm离心15min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。3、 取上清。 分装冻存备用，2-8下，可放置保存24-48小时；-20下，可放置保存1个月；-70下，可放置保存6个月；4、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。九、 ELISA实验中各类组织匀浆（容易匀浆的组织）的采集、处理和保存；（需要测蛋白浓度）1、 采集组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，剔除附属的结缔组织，称取组织块。2、 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织 的小烧杯放入冰水中）。3、 匀浆的方式有多种： a) 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下 端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（68分钟），充分研碎，使组织匀浆化。b) 机器匀浆：用组织捣碎机1000015000r/min上下研磨制成10组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续35次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。4、 将制备好的10匀浆用离心机4，3000rpm离心15min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。5、 取上清。 分装冻存备用，2-8下，可放置保存24-48小时；-20下，可放置保存1个月；-70下，可放置保存6个月；6、 根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种ELISA测定。十、ELISA实验中各类组织匀浆（不易匀浆的组织）的采集、处理和保存；（需要测蛋白浓度）7、 采集组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，剔除附属的结缔组织，称取组织块。8、 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织 的小烧杯放入冰水中）。9、 匀浆的方式有多种： a) 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下 端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（68分钟），充分研碎，使组织匀浆化。b) 机器匀浆：用组织捣碎机1000015000r/min上下研磨制成10组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续35次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。c) 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破