（植物学专业论文）盐地碱蓬液泡膜hatpase的分离、纯化及亚基分析.pdf

山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬液泡膜h a t p a s e 的分离 纯化及亚基分析 摘要 v a t p a s e 是一种重要的膜结合初级质子转运体 能够利用细胞质中a t p 水 解产生的能量把细胞质中的h 泵入液泡中 建立跨液泡膜的质子驱动力 p r o t o n m o t i v ef o r c e p m f 从而驱动溶质在细胞质和液泡间跨液泡膜转运 维持细胞 质溶质等相对恒定 保证生命活动的正常进行 盐渍环境中 稀盐盐生植物通过 将n a 等有害离子区域化到液泡中以缓解盐害 n a 的区域化主要依赖于液泡膜 n a m 逆向转运蛋白的运转 而液泡膜质子泵 v i i a t p a s e v h p p a s e 为 其提供质子驱动力 v 型时 a t p a s e 不仅是一种重要的持家酶 更是一种重要的 胁迫响应酶 本实验以典型的稀盐盐生植物盐地碱蓬为材料 2 0 0m m o l ln a c l 处理后测定有关生理指标及叶片中v h 一a t p a s e 的活性 通过液泡膜微囊制备 免疫共沉淀 s d s p a g ex x t e s t e m b l l t 等实验方法 旨在探讨盐地碱蓬在正常生 长和n a c i 处理条件下v i r a t p a s e 亚基组成的种类 及盐胁迫条件下活性和某 些亚基表达的变化 主要结果如下 1 n a c i 处理对盐地碱蓬生长的影响 2 0 0m m o l l n a c l 显著促进盐地碱蓬的生长 整株及叶片鲜重较对照均显著 增加 地上部分植株大 分枝增加 叶片长 叶片肉质化程度高 低枯度生长条件下 盐地碱蓬有很强的吸收n r 能力 2 0 0m m o l ln a c l 处 理后 盐地碱蓬叶细胞汁液的n a 浓度较对照有极显著增加 p o 0 1 n a 在液 泡中的积累 能够显著降低细胞水势 增强盐地碱蓬从盐渍环境中吸水的能力 胞质中n r 浓度的降低 能够防止过多的n a 对胞质酶的影响 保证了盐地碱蓬 征常生理生化反应的进行 盐处理导致盐地碱蓬叶细胞汁液的k 浓度较对照显 著降低 但植株的生长却明显好于对照 说明细胞内k 浓度在一定范围内的降 低对盐地碱蓬的生长没有影响 2 n a c i 处理对盐地碱蓬叶v h a t p a s e 活性的影响 2 0 0m m o l ln a c l 处理后 盐地碱蓬叶中v h a t p a s e 水解活性较对照极显 著增加 p 0 0 1 叶片中的液泡膜质子泵活性高 必然会为与离子区域化有关 的次级主动运输提供更多的能量 为液泡膜n a h 逆向转运蛋白提供更多的质 子驱动力 因而更利于n a 的液泡区域化 也必然会导致盐地碱蓬叶片的液泡维 持较低的渗透势 更有利于植物的水分吸收 从而能更好的维持植物的正常生长 山东师范大学硕士学位论文 3 盐地碱蓬v h 一a t p a s e 亚基组成分析 用差速离心和蔗糖不连续梯度离心的方法 分离盐地碱蓬液泡膜微囊 用 2 的t r i t o nx 1 0 0 溶膜后的上清液 经免疫共沉淀后得到较为纯化的v a t p a s e 复合物 用多克隆抗体a t p 8 8 和a t p 9 5 分别进行w e s t e mb l o t 分析 实验结果 显示 在完全h o a g l a n d 营养液培养和2 0 0m m o l ln a c l 处理条件下 盐地碱蓬 叶中v 一一a t p a s e 全酶亚基种数基本一致 均约有1 2 种亚基组成 包括v l a b c d e f g 和h 亚基 v o a d e c c 亚基 其中a g e 为本实验新检测到的盐地碱蓬的亚基 4 n a c i 处理对盐地碱蓬叶v i a t p a s e 亚基表达的影响 盐胁迫不仅显著诱导盐地碱蓬v 矿 a t p a s ea 亚基 a 亚基 b 亚基 c 亚 基等蛋白表达量的增加 而且诱导了b c 亚基基因转录的增强 且这两种亚基 的表达存在协同增加的效应 亚基蛋白表达量的增加 基因转录的增强 进一步 增加了一v h a t p a s e 全酶在液泡膜上的丰度 而这也与盐处理条件下 v h 十一a t p a s e 活性增加是相一致的 总之 与对照相比 在盐渍条件下 盐地碱蓬在生长 离子积累 液泡膜质 子泵活性及其在转录和翻译水平的表达等方面存在明显差异 说明盐胁迫下 盐 地碱蓬的耐盐性受多种因素影响 盐胁迫下盐地碱蓬液泡膜h 一a t p a s e 活性的变 化及其蛋白表达量的变化与细胞汁液中n a 的积累相一致 可见液泡膜质子泵在 n r 区域化中起重要作用 而v 一 a t p a s e 可能是与盐地碱蓬耐盐有关的主要的 质子泵 得到富集的液泡膜微囊后 通过采用修改后的免疫共沉淀和w e s t e mb l o t 方法分析 盐地碱蓬叶液泡膜h a t p a s e 全酶约有1 2 种亚基组成 包括v l a b c d e f g 和h 亚基 v o a d e c c 亚基 其中a g e 为盐地碱蓬新检测到的亚基 并且盐胁迫能够诱导该酶某些亚基蛋白 a a b 和 c 1 表达量的增加 和基因转录的增强 关键词 盐地碱蓬v h a t p a s en a 区域化免疫共沉淀亚基分析 分类号 q 9 4 57 8 i i 山东师范大学硕士学位论文 i s o l a t i o n p u r i f i c a t i o na n ds u b u n i ta n a l y s i so ft o n o p l a s th a t p a s e f r o ms u a e d as a l s al a b s t r a c t v a c u o l a rh a t p a s ei sak i n do fm e m b r a n e b o u n dp r o t o nt r a n s p o r t e r w h i c h u s e st h ee n e r g yr e l e a s e df r o ma t pa n db u i l d su pap r o t o ng r a d i e n ta c r o s st h e t o n o p l a s tt od r i v et r a n s l o c a t i o no fi o n sa n dm e t a b o l i t e s v a c u o l a rh a t p a s ei nt h e t o n o p l a s tp l a y sc r u c i a lr o l e si ni o nb a l a n c e m e t a b o l i t et r a n s l o c a t i o n p l a n tg r o w t ha n d s oo n i nas a l i n ee n v i r o n m e n t s a l t d i l u t i o nh a l o p h y t e sa l l e v i a t es a l tt o x i c i t ym a i n l y t h r o u g ht h ec a p a c i v o fs e q u e s t r a t i n gn a 十i n t ot h ev a c u o l e n et r a n s p o r t a t i o no fn a a g a i n s tt h ec o n c e n t r a t i o ng r a d i e n tf r o mt h ec y t o p l a s mi n t ot h ev a c u o l ev i at h e t o n o p l a s tn a h a n t i p o r t e ri sd e p e n d e n to nt h ea c t i v i t i e so ft o n o p l a s tp r o t o np u m p s v h 一a t p a s ea n dv h p p a s e w h i c he s t a b l i s h a ne l e c t r o c h e m i c a lh 一g r a d i e n t a c r o s st h et o n o p l a s tt h a te n e r g i z e st h et r a n s p o r t e r s v a c u o l a rh 十一a t p a s en o to n l yi s e x t r a o r d i n a r i l yi m p o r t a n ta sah o u s e k e e p i n ge n z y m e b u ta l s of u n c t i o n sa s as t r e s s r e s p o n s ee n z y m et r a d e re n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s i nt h ep r e s e n ts t u d y s a l t d i l u t i o n h a l o p h y t es s a l s ac u l t u r e du n d e rd i f f e r e n ts a l tc o n c e n t r a t i o n sw a su s e dt oi n v e s t i g a t e t h ea c t i v i t i e s s u b u n i tc o m p o s i t i o na n ds u b u n i t se x p r e s s i o no fv h 一a t p a s eb y w e s t e r n n o r t h e r nb l o ta n a l y s i sa n di m m u n o p r e c i p i t a t i o ni na d d i t i o nt ot h e d e t e r m i n a t i o no fs o m ep h y s i o l o g i c a lp a r a m e t e r s t h em a i nr e s u l t sw e r es h o w na s f o l l o w s 1 e f f e c t so fn a c it r e a t m e n to nt h eg r o w t ho f s s a l s a t h eg r o w t ho rss a l s aw a se n h a n c e db yt r e a t m e n to f2 0 0m m o l ln a c l a n dt h e f r e s hw e i g h to fl e a v e sa n dw h o l ep l a n t sw a si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t h t h ec o n t r 0 1 t h en u m b e ro fs h o o tb r a n c h i n gw a si n c r e a s e d f u r t h e r m o r e t h e n a c i t r e a t e ds e e d l i n g sa n dl e a v e sw e r eb i g g e rt h a nt h ec o n t r o l s s js a l s ap l a n t sh a v eh i g hc a p a c i t yo fa c c u m u l a t i n gn i nl o wn a c o n c e n t r a t i o n e n v i r o n m e n t t h en a 十c o n c e n t r a t i o n so fc e l ls a pf r o ml e a v e sw e r eg r e a t l yi n c r e a s e d u n d e r2 0 0m m o l ln a c it r e a t m e n t a sat y p i c a ls a l t a c c u m u l a t i n gh a l o p h y t e n a w a s m a i n l ya c c u m u l a t e di nl e a v e s a n dt h e nt h eo s m o t i cp o t e n t i a lo ft h ec e l ls a pw a sm u c h l o w e ri nl e a v e st h a nt h a ti nt h es o i l s oss a l s ap l a n t sc a l lm o d u l a t et h eo s m o l a r i t yt o m a i n t a i nt h en o r m a l g r o w i n gs t a t e u n d e rs a l ts t r e s s f u r t h e r m o r e l o wn a i i 山东师范大学硕士学位论文 c o n c e n t r a t i o ne n v i r o n m e n ti nc y t o p l a s tc a np r o t e c tm a n ye n z y m e sf r o mn a t o x i c i t y t om a i n t a i nt h en o r m a lg r o w i n gs t a t eu n d e rs a l ts t r e s s i ns a l i n ec o n d i t i o n k c o n c e n t r a t i o n si nt h ec e l ls a pf r o ml e a v e sw e r ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t h t h ec o n t r o l ss i n c et h eg r o w t ho fss a l s as e e d l i n g sw a sp r o m o t e db ys a l ts t r e s s t h e d e c r e a s eo fk c o n c e n t r a t i o ni nt h ec e l ls a pt oac e r t a i ne x t e n tw o u l d n ti n h i b i tt h e p l a n t sg r o w t h 2 e f f e c t so fn a c it r e a t m e n to nt h ea c t i v i t i e so fh 一a t p a s ei nt o n o p l a s tv e s i c l e s p r e p a r e df r o ml e a v e so f s s a l s a t h ev h 一a t p a s ea c t i v i t i e si nl e a v e sw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e db y2 0 0 m m o l ln a c it r e a t m e n t t h ei n c r e a s e dp r o t o nt r a n s p o r ta c t i v i t yo fv a t p a s em a y p r o v i d es t r o n g e rd r i v i n gf o r c ef o rn d wa n t i p o r t e ra n daw i d er a n g eo fs e c o n d a r y a c t i v et r a n s p o r tp r o c e s s e s l e a d i n gt oo s m o t i ca d j u s t m e n ta n de l i m i n a t i o no fi o n t o x i c i t y w i t hl o w e ro s m o t i cp o t e n t i a lo ft h ec e l ls a p ss a l s ap l a n t sc a nm a i n t a i nt h e n o r m a lg r o w i n gs t a t eu n d e rs a l ts t r e s s 3 s u b u n i tc o m p o s i t i o no ft o n o p l a s th 一a t p a s ef r o ms u a e d as a l s al t h et o n o p l a s tv e s i c l e sw e r eo b t a i n e df r o ml e a v e so fs u a e d as a l s ap l a n t sb yt h e d i s c o n t i n u o u ss u c r o s eg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n b ys o l u b i l i z i n gt o n o p l a s tv e s i c l e sw i t h t r i t o nx 一1 0 0 2 v v a n dp u r i f y i n ga t p a s ec o m p l e xb yi m m u n o p r e c i p i t a t i o n t h e p a r t i a lp u r ee n z y m ew a so b t a i n e d w e s t e r nb l o ta n a l y s i sw i t ht h ea n t i s e r aa t p 9 5a n d a t p 8 8d i r e c t e da g a i n s tt h ev a t p a s eh o l o e n z y m el c a d st ot h es i m i l a rr e s u l t s 血a t v a t p a s ec o n s i s t so fa b o u t1 2s u b u n i t s t h ev is u b c o m p l e xi sp r o b a b l yf o r m e db y t h es u b u n i t s a b c d e f g a n d h a n d t h e v 0s u b c o m p l e xb ya d ea n dc o rc t h es u b u n i ta ga n dew e r ef i r s t l yi d e n t i f i e di nt h ep r e s e n ts t u d yi ns u a e d as a l s al 4 e f f e c t so fn a c it r e a t m e n to ns u b u n i te x p r e s s i o no fh a t p a s ei nt o n o p l a s t v e s i c l e sp r e p a r e df r o ml e a v e so f s s a l s a w e s t e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no f a a ba n dcs u b u n i t sw a s s i g n i f i c a n t l yu p r e g u l a t e db y2 0 0m m o l ln a c it r e a t m e n t m o r e o v e r t h ee x p r e s s i o n o fbs u b u n i tw a sc o o r d i n a t e dw i t hcs u b u n i to fv h 一a t p a s ea tt r a n s c r i p ta n d t r a n s l a t i o nl e v e l su n d e rn a c ls t r e s s t h e nt h en u m b e ro fv a t p a s eh o l o e n z y m e w o u 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t h t h eg e n ee x p r e s s i o n sa n dt r a n s l a t i o n sa n dn ra c c u m u l a t i o ni nc e l ls a p s t h e v h 一a t p a s em i g h tp l a yav e r yi m p o r t a n tr o l ei nn a s e q u e s t r a t i o ni n t ov a c u o l e u n d e rs a l te n v i r o n m e n t s t o n o p l a s t 一 a t p a s ef r o mss a l s ac o n s i s t so fa b o u t12 s u b u n i t s b yi m m u n o p r e c i p i t a t i o n s d s p a g e a n dw e s t e r na n a l y s i s t h ev j s u b c o m p l e xi sp r o b a b l yf o r m e db yt h es u b u n i t sa b c d e f ga n dh a n dt h ev 0 s u b c o m p l e xb ya d ea n dc o rc t h es u b u n i t sa ga n d ew e r et e s t e df i r s t l yi ns s a l s at h ee x p r e s s i o no fs o m es u b u n i t so fss a l s a a n dt h ee x p r e s s i o no fs o m e s u b u n i t sa tt r a n s c r i p ta n dt r a n s l a t i o nl e v e l sw e r es i g n i f i c a n t l yu p r e g u l a t e du n d e r n a c ls t r e s s k e t w o r d s s u a e d as a l s al v h a t p a s e n a c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n s u b u n i ta n a l y s i s c l a s s i f i c a t i o nn u m b e r q 9 4 5 7 8 v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果 也不包含为获得 注 如没有其他需要特别声 明的 本栏可空 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料 与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 学位做作者虢以i 塾 导师签字 z7 二 矿 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本人授权 堂 圭奠可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印 或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 三亲 导师签字 2办辛 签字日期 2 0 06 年6 月牛日签字日期 2 0 0年月目 山东师范大学硕士学位论文 文献综述 土壤盐渍化对农业的影响是一个全球性的问题 全球近2 0 的耕地和近半数 的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁 j 0 8 我国有3 亿多亩盐荒地和1 亿多亩 盐渍化土壤 约占全国可耕地面积的2 5 随着我国工农业生产的飞速发展 人 口的不断增加 粮食需求的日益高涨 以及耕地资源的愈趋缺乏 可耕地面积急 剧减少 而不合理灌溉又造成了大量良田的次生盐渍化 5 因而快速开发和有效 利用盐渍化土壤以提高作物产量在我国农业生产中具有十分重要的现实意义 长 期以来 国内外对盐碱土地的改良和利用开展了广泛的研究 虽然已经取得了长 足的进展 但许多问题亟待解决 除了利用合理的灌溉技术对盐碱地进行改造 提高植物尤其是经济作物的耐盐性是开发利用盐碱地最有效的方法之一 也是现 代和未来农业发展的重要方向 目前已经对植物盐害和植物的耐盐机理进行了较 为深入的研究 为提高植物的耐盐性提供了大量有价值的资料 但是 由于植物 耐盐机制的多样性和复杂性 致使植物耐盐机理尚未完全搞清楚 生长于盐渍环境中的植物会不同程度地受到盐分胁迫的影响 而土壤中过多 的盐分对大多数植物的生长发育都有抑制作用 因而限制了作物产量 对植物盐 害机理的研究表明 盐分过多抑制植物生长的原因主要有两个方面 水分胁迫和 离子胁迫1 4 9 j 1 6 7 盐渍环境中含有较多可溶性盐分导致土壤水势较低 植物生长 在盐渍环境中 会因吸水困难而导致生理干旱 此外 胞质内盐离子如n a c l 的过多积累会对植物体造成离子毒害 同时对其他离子的吸收产生影响 植物细 胞及某些大分子损伤 从而引发生理生化代谢的紊乱1 4 使植物生长减缓甚至 死亡 然而有一些植物可以在这种盐渍环境中自然分布 生长 并能完成其生活 史 这类植物为盐生植物 泌型盐生植物在盐渍环境中有的能够通过盐腺或盐囊 泡等将吸收的盐分主动的排到体外 有的通过将吸收的盐分转移到老叶中积累 最后叶片脱落等方式 防止过多盐分在体内的积累1 6 稀盐型盐生植物之所以能 在盐渍土壤中正常生长 原因在于能够把土壤溶液中的n a 等无机离子吸收并积 累在液泡中进行渗透调节 从而在高盐环境中仍能维持水分的吸收 j 同时维 持植物细胞的离子稳态 避免了离子在细胞质中过多积累而引起干扰植物正常生 理生化代谢的问题1 7 j n 1 n a k 稳态的构建 高盐条件下由于盐分吸收过多 会造成植物体内离子毒害 同时对其他离子 的吸收产生拮抗作用 导致植物体内离子不平衡及个别离子的积累 从而引发生 理生化代谢的紊乱 4 9 1 随着n a 等无机离子大量涌入细胞内 不仅破坏了植物 山东师范大学硕士学位论文 细胞中业已形成的n a c l 平衡状态 而且也影响k 和c a 2 在细胞内的分布 7 2 所以在盐胁迫环境中 植物必须建立新的离子稳态来提高其耐盐能力 以能正常 生长 并完成其生活史 盐胁迫条件下植物依赖于p mh a t p a s e h a t p a s e h 一p p a s e c a 一a t p a s e n a h 逆向转运蛋白 载体和各种离子通道蛋白等的参 与以形成胞外 胞质和液泡三者间离子的平衡 从而重建和维持植物细胞内的离 子稳态 n a 与k 的化学性质有很多相似性 但生物功能却完全不同 n a 对大多数 陆生植物来说并不是生长所必需的 由于n a 和k 的水合半径相似 运输蛋白很 难把它们区分开 现在一般认为n a 的吸收是通过高亲和及低亲和的k 转运系统 完成的 如h k t 类蛋白峭5 j 及非选择性的阳离子通道 n o n s e l e c t i v ec a t i o nc h a n n e l s n s c c 掣 l k 是植物所必需的三大营养元素之一 在正常生理条件下 植物 细胞胞质k 浓度相对较高 1 0 叽1 5 0m m o l l 并且是唯一一种植物所必需的以相 对高浓度存在的阳离子1 4 2 而n a 浓度相对较低 1 1 0m m o l l 1 7 2 有较高的 k n r 比 因此 保持胞质中高于一特定值的贮浓度 对于植物的生长及耐盐性 都是非常必要的 2 7 3 2 1 l 植物胞质中低n a 高k 水平的维持需要质子泵 p m h 7 a t p a s e v h 一a t p a s e v 旷一p p a s e 和n a h 逆向转运体等的协同作用 驱 动n a 排出细胞和将n a 区域化入液泡中 从而降低细胞质中的n a 浓度 保持细 胞k 浓度 维持植物细胞的离子稳态 盐胁迫条件下植物液泡膜和质膜的质子 泵活性及n a h 逆向转运效率的高低可能是决定植物耐盐性的关键 2 8 1 1 n a n a 上是某些盐生植物的有益元素 其主要的生理作用是增大植物细胞的渗透 势 降低细胞水势 促进细胞吸水 而其它非盐生植物并不需要n a l 早期的 研究结果表明 n a 是许多c 4 盐生植物所必需的 2 6 王宝山等 1 0 5 1 的研究结果表 明n a 也是c 3 盐生植物最佳生长所必需的 由于n a 千和k 水合离子半径相似 可以竞争c 跨膜运输进入细胞 从而会影响k 的正常吸收 导致k 缺乏而n r 过量 进而抑制植物生长 4 h 因此 在盐渍化土壤中 植物要想正常生长 发 育并完成其生活史 必须保持相对较低的胞质n a 十浓度 要想保持较低的胞质 n a 浓度 植物细胞应限制n a 内流 增加n a 的外排 或者把n a 区域化至液泡 中 图1 1 4 9 9 8 1 山东师范大学硕士学位论文 丽忑忑忑丽i 1 忑焉 i 百i 1 8 y p a 图1 高等植物中影响耐n a 能力的n a 转运过程 引自t e s t e r 2 0 0 3 f i g 1 n f t r a n s p o r t p r o c e s s e s i n f l u e n c i n g n a t o l e r a n c e i n h i g h e r p l a n t s 注 红箭头表示n a 运输 箭头越细越能提高耐盐性 绿色箭头代表n a 运输 箭头越粗越 能提高耐盐性 图中彩色形状分别代表叶绿体 绿色 线粒体 橙色 过氧化物酶体 红色 内质网 深蓝色 n a 十进出上述细胞器的过程并不清楚 黄色形状代表液泡 1 1 1n a 的外排 n a 的外排是减少n a 在细胞质中积累的一种直接途径 n a 从细胞内排出需 要逆着其电化学势梯度 是一个主动运输的过程 某些海藻的质膜上存在 n a 一a t p a s e 水解a t p 驱动n a 向胞外运输 2 3 但到目前为止 在高等植物中 尚未发现n a 十一a t p a s e 的存在 在高等植物中 n a 的外排主要是通过质膜上的n a h 逆向转运蛋白实现的 p mh a t p a s e 水解a t p 产生能量把h 从细胞质中泵出细胞 产生跨质膜的质子电 化学势梯度 驱动质膜上的n a h 逆向转运蛋白 使一顺其电化学势进入细胞 同时n a 逆其电化学势排出细膨7 6 1 大洋洲滨藜叫t r i p l e xn u m m u l a r i a 质膜 n a h 逆向转运蛋白的活性随n a c i 浓度的升高而增强 在拟南芥中 n a 的外排 主要是由质膜上的n r h 逆向转运蛋白s o s l s a l to v e r l ys e n s i t i v e1 来完成 吲 s o s l 为1 2 7k d a 的多肽 能够在s o s 信号传导通路中的s o s 3 s o s 2 调控下刺激 n a p l 排 从而建立新的离子稳态 1 1 4 实验表明 s o s i 的突变使得突变体对 n a 非常敏感 m 6 1 而在拟南芥中过量表j 盘 a t s o s l 明显增加了植物的耐盐性 这进 一步证明 如s j 及n a 外排对于植物耐盐性的重要作用 g a o 等1 4 5 的工作表明 在拟南芥中过量表达s o d 2 也能够提高其耐盐性 山东师范大学硕十学位论文 1 1 2n a 的区域化 将n a t 区域化入液泡是减少n a 在细胞质中积累的另一有效机制 此过程主 要通过液泡膜上的n a h 逆向转运蛋白实现 2 3 1 2 4 7 4 该载体的运转依赖于液泡 膜上的质子泵 即液泡膜h a t p a s e 9 5 1 和h p p a s e 8 它们分别水解细胞质中的 a t p 和p p i 将胞质中的h 逆电化学梯度泵入液泡中 建立跨液泡膜的质子驱 动力 p r o t o nm o t i v ef o r c e p m f 从而驱动离子跨液泡膜的次级主动转运 6 将n a 及时区域化至液泡 如此一方面可以避免过多的n a 对细胞质中酶的毒害 作用 另一方面降低了植物细胞的水势 促进植物从外界吸水 从而有利于植 物在盐渍化土壤中的生存 1 2k k 是植物所必需的三大营养元素之一 是植物所必需的唯一一种以相对高浓 度存在的阳离子 4 1 4 2 在各种类型植物细胞的生长及代谢中发挥重要作用 能 够参与酶活性调节 蛋白质合成和渗透调节等生理过程 6 5 k 十作为细胞内的平 衡离子可中和细胞内大量蛋白质和核酸所带的负电荷 在甜土植物中 k t 还起调 节液泡和胞质渗透势的作用 气孔的开 关与保卫细胞中k 内流和外流有关 植物叶片的感夜运动是由于叶褥细胞膨压产生的变化 也与k 流动有关 k 还 可以通过调节细胞膨压而参与细胞生长调节等口8 1 k a 赢 k i r i p 一 1 耘 o m r g 譬 皇 呈望 m p 托 一 v d o一 一 一 y c n一 一 m一 t p v 一 墨涵 一一一 蹲 一 k 图2 植物质膜 a 和液泡膜 b 的k 转运机制 引白s h a b a l a 2 0 0 3 f i g 2 p o t a s s i u mt r a n s p o r tm e c h a n i s m sa tp l a n tp l a s m am e m b r a n ea n dt o n o p l a s t 注 幽a 质膜上存在4 种类型的k 一通道 内向整流k 通道 k i r c s 外向整流k 通道 k o r c s 微弱电压依赖性k j 砬道 w d k c s 张力激活k 通道 s a s s 同时质膜上还存在 北选抒性同f 离子通道州s c c s l l 两个高亲和转运体 h k t 利h u k 它们的门控属性如插入 山东师范大学硕士学位论文 图中符号所示 k 表示被外部和内部的因素激活和抑制 表示门控属性不消楚 m p 膜势 c n 环核苷酸 p o l 多胺 r o s 活性氧 图b 液泡膜上存在5 种类型介导k 吸收的通道 慢 s v 激活非选择离子通道 快速 f v 激活非选择离子通道 k 选择 v k 通造 外向整流k i 砬j 萱 k o r c s 张力激活k 通道 s a s s y l p b 至少存在两种转运体 h u ka n dn h x 也可以介导k 吸收 一般认为跨越质膜的k 吸收主要存在两种系统 图2 a 系统1 一高亲和k 吸 收系统 k 1 0 3 0i t m o l l 在外界低浓度k 0 1n n n o l l 条件下介导k 吸收 系统2 低亲和k 吸收系统 在外界高浓度k 1 1 5r e t o o l l 条件下介导k 吸收 8 9 1 质膜上存在两个高亲和k 运输蛋白家族 1 t r k h k t 运输蛋白 它包括高 亲和k 运输蛋白h k t 及其同源蛋白 h o m o l o g s 起初认为小麦th k t l 是k h 协同运输体 k h s y m p o r t e r 后来发现t a h k t l 在微摩尔n a 浓度下为n a 十 k 协同运输体 n a k s y m p o r t e r 在毫摩尔n a 浓度下为低亲和n a 运输体 8 3 2 k u p m a k 依t 运输蛋白 首先是在大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l i 中发现 命名为k u p 签u 卫t a k e 情 在土壤酵母s c h w a n n i o m y c e so c c i d e n t a l i s 命名为h a k l h i g h a f f i n i t y k 2 0 1 植物中的同源蛋白 h o m o l o g u e s 称为k u p h a k 或k t 醛 在拟南芥基因组中有13个基因 删 在水稻的基因组中至少有17个基 transporter 因f 1 9 1 已确定的低亲和k 转运体大致可分为五种类型 内向整流k 通道 k 1 r c s k i n w a r d l yr e c t i f y i n gc h a n n e l s 和外向整流k 通道k o r c s k o u t w a r d l y r e c t i f i n gc h a n n e l s 电压不依赖型阳离子通道v i c s v o l t a g ei n d e p e n d e n t c h a n n e l s 微弱电压依赖性k 十通道 w d k c v o l t a g e d e p e n d e n tk c h a n n e l s 张力激活r 通道 s a s s t r e t c h a c t i v a t e dk c h a n n e l 非选择性阳离子通道 n s c c n o n s e l e c t i v ec a t i o nc h a n n e l 8 9 1 液泡膜上大约存在5 种不同类型的k 上通道 图2 b 其中 慢激活液泡膜 通道 s l o w a c t i v a t i n gv a c u o l a rc h a n n e l s s vc h a n n e l s 和快激活液泡膜通道 f a s t a c t i v a t i n gv a c u o l a rc h a n n e l s f vc h a n n e l s 含量最丰富 s v 通道允许单 价和二价阳离子透过 受细胞质c a 2 和液泡膜去极化激活 f v 通道只允许单价 阳离子透过 受膜的去极化激活 s v 通道和f v 通道在植物不同组织中是普遍 存在的 包括叶肉细胞和保卫细胞的液泡膜 7 5 1 1 9 9 1 此外 保卫细胞还有一种 液泡膜k v k 通道 1 6 是电压依赖型的 可被c d 8 7 细胞质碱性化 所 激活 最近从拟南芥克隆了一个外向整流器k c 0 1 这个通道是 双孔 k 通道 家族的成员 在每个亚基上有两个p 结构域 在叶肉细胞和保卫细胞液泡膜中都 存在这个通道 8 7 在液泡膜上可能还存在一种可以感受机械力的s a s 通道1 1 5 j 2 n a i r 逆向转运蛋白 植物有两种类型n a h 逆向转运蛋白 n a p r t a n t i p o r t e r 一种是质膜n a h 1 a n t i p o r t e r 如拟南芥s o s l 另一种是液泡膜n r h a n t i p o r t