Hematoxylin II-081128.doc

苏木精染色液（Mayer法） 分类号 760-2021使用须知用途本试剂主要用于体外诊断（IVD）。 苏木精染色液（Mayer法）是一种改良的Mayer苏木精，用于对切片中的细胞核染色，切片含冰冻组织、福尔马林固定切石蜡包埋的组织或细胞制剂。要合理解释任何染色结果的临床意义必须同时结合形态学观察和适当的对照。由资深的病理学家参考病人的临床病史以及其它实验室检查结果进行评估。注意：美国联邦法律规定本器材仅限由医生或遵医嘱销售。摘要和说明苏木精可对多种组织成分（包括细胞核、线粒体、粘蛋白、血红蛋白、弹性纤维以及胶原）进行染色。染料组分（氧化苏木精）通过媒染剂硫酸铝直接结合组织。原理和操作一般而言，在IHC染色中，首先是特定抗体（一抗）与抗原结合，随后二抗（连接抗体）和一抗结合，最后酶复合物和显色底物相结合，这些反应之间插入洗涤步骤，使抗原显色。酶激活显色剂使反应产物在抗原位点显色。随后使用苏木精溶液在切片上复染标本。苏木精通过媒染剂复合物结合异染色质中的核酸以及组蛋白将细胞核染成蓝色。每个孵育步骤结束时，Ventana自动切片染色机清洗切片，使反应停止并去除未结合的试剂。同时还对标本进行蓝化并盖上载玻片。使用光学显微镜读取结果，此结果有助于鉴别与特定抗原有无关联的病理生理学过程。材料和方法提供的试剂1 25 ml小瓶苏木精；含有乙二醇和醋酸稳定溶液。使用方法不需溶解、混合、稀释或滴定。本试剂针对结合Ventana一抗、检测试剂盒和辅助试剂一同在Ventana自动切片染色机上的使用进行了优化。所需的材料和试剂（未提供）以下列出了可能要用到，但本试剂盒中未提供的试剂和材料：1. 阳性或阴性组织对照2Ventana阴性对照试剂* 3Ventana兔阴性对照*4. 一抗5. 显微镜载片，带正电荷6. 能将温度保持在70C 5C的干燥炉7. 条码标签（适用于阴性对照和一抗）8. 10%中性缓冲福尔马林9. 染色缸或染槽 10. 定时器11. 二甲苯12. 乙醇或梯度酒精13. 去离子水或蒸馏水14. Biocare Medicals Decloaking Chamber* （NexES IHC自动切片染色机）15. ES, NexES IHC、BenchMark XT 自动切片染色机16. iVIEWTM DAB, AEC, V Red (ALK PHOS) or Enhanced V Red detection kits 17. Endogenous Biotin Blocking Kit* 18. Detection kit specific software (ES automated slide stainer only) 19. APK Wash Solution* (ES and NexES IHC automated slide stainers) 20. Liquid CoverslipTM solution (ES and NexES IHC automated slide stainers) 21. EZ PrepTM solution* (BenchMark and BenchMark XT automated slide stainers) 22. Reaction Buffer* (BenchMark and BenchMark XT automated slide stainers) 23. LCS (BenchMark and BenchMark XT automated slide stainers) 24. Cell Conditioning 1 (CC1), Cell Conditioning 2 (CC2) or Cell Conditioning 3 (CC3) (BenchMark and BenchMark XT automated slide stainers)* 25. Protease I, II, or III* 26. Bluing Reagent 27. 封固剂28. 盖玻片29. 光学显微镜（20-80X）* 适用于特定检测。储存和处理储存于2-8 C。不可冷冻。对于不属于包装插页中列出的储存条件，使用者必须加以检验。为确保正确的试剂传送和试剂盒成分的稳定性，每次运行后必须更换盖子，且必须立即将分配器垂直放置在冰箱里。每个分配器都标有有效期。如储存适当，本试剂可稳定至标签上标示的日期。一旦试剂过期，规定的储存方法将不再适用。表示本品不稳定的迹象是在清洗溶液时试剂出现沉淀。一旦发现试剂不稳定，请立即联系您当地的Ventana办事处。标本的收集和准备冷冻切片推荐的步骤是将新鲜组织放入OCT包埋介质中，并在液氮或干冰冷却的异戊烷中快速冰冻。在制作切片前将冰冻组织储存于-80C。活检切片厚度为4 - 6 m，并放置到干净的载玻片上，然后立即放入冷丙酮（0-8C）中10- 30分钟。在从丙酮中拿出后，可将载玻片风干10分钟- 1小时。细胞学样本应按照标准实验室步骤来准备细胞离心涂片和血液涂片：1. 风干载玻片30分钟。2. 在冷丙酮（0-8 C）中固定10 30分钟。3. 从丙酮中拿出后风干10分钟- 1小时。4. 放置在带有干燥剂的干燥器中最多10天。如果切片的储存时间超过10天，用铝箔包紧并储存于 -80C。5. 在从-80C 中拿出后可将载玻片放置在室温下，（对于铝箔包裹的载玻片，在除去铝箔之前可放置在室温下以避免样本冷凝）。6. 将条码标签应用于载玻片，并加载到自动切片染色机上。福尔马林固定、石蜡包埋组织当和 Ventana 一抗、检测试剂盒、辅助试剂和自动切片染色机（见所需的材料和试剂（未提供）一节）一同使用时，常规处理、福尔马林固定、石蜡包埋组织适合与本试剂搭配使用。推荐的组织固定液为10%中性缓冲福尔马林。1 如结果出现变化，可能是由固定过长或特殊工艺 如骨髓制备品的脱钙所造成的。各切片必须具有适当的厚度，并放置在一个带正电荷的载玻片上。含有组织切片的载玻片可在70 C 5 C的干燥炉中烘干至少2小时（但不可超过24小时）。人工脱蜡步骤当使用ES或NexES IHC自动切片染色机或未在BenchMark 或BenchMark XT自动切片染色机上选择脱蜡时需进行人工脱蜡：1. 有关何时为载玻片加贴条码标签的说明，请参见特定的自动切片染色机的“使用说明”一节。2. 按顺序将载玻片浸入3个二甲苯槽中各5 1分钟。3. 将载玻片转移至100%酒精中，并按顺序浸入2个酒精槽中各3 1分钟。4. 将载玻片转移至95%酒精中，并浸在1个酒精槽中3 1 分钟。5. 将载玻片转移至80%酒精中，并浸在酒精中3 1 分钟。6. 将载玻片转移至一个去离子水或蒸馏水槽中，并浸泡1分钟，至少10次。7. 在适当时将载玻片转移至APK洗涤液（1X）或缓冲液中。对于APK洗涤液，应将载玻片留在该溶液中，直到您准备好进行染色。对于缓冲液，应将载玻片留在该溶液中，直到您准备好执行抗原修复。不要让载玻片变干。在BenchMark或BenchMark XT自动切片染色机上染色的载玻片可在分析仪上进行脱蜡。如果已选择该选项，为载玻片加贴条码并放置到分析仪上。如果未选择该选项，请遵照上述的“人工脱蜡步骤”进行。警告和注意事项1. 在处理试剂时应采取合理的预防措施。在处理可疑致癌物或有毒材料（如二甲苯或甲醛）时需戴上一次性手套。 2. 避免试剂接触眼睛和粘膜。如果试剂沾到敏感区域，立即用大量清水冲洗。3. 病人样本和所有与之接触的材料都应按照生物危险材料来处理，并在处置时采取适当的预防措施。不得用嘴移液。4. 避免试剂感染细菌，一旦感染细菌可能导致结果不准确。 5. 超出规定范围的孵育时间和温度可能得出错误的结果。使用者必须对此类更改加以检验。6. 本试剂已经过最佳稀释，如对本品进一步稀释将造成抗原染色损失。使用者必须对此类更改加以检验。7. 过度曝光症状包括刺激皮肤和眼睛，以及刺激粘膜和上呼吸道。ACGIH（TLV）：无；OSHA（PEL）：N/A；IARC：未列出；NTP：未列出。8. 有关推荐的处置方法，请咨询地方或全国性相关机构。使用说明详细程序步骤苏木精II已经过优化，应用Ventana自动切片染色机，与Ventana一抗、检测试剂盒和辅助试剂一同使用时，孵育4分钟即可实现均一的核染色。程序设定请参见操作手册。自动化程序的参数可按照操作手册中列出的步骤来显示、打印和编辑。自动切片染色机的其他操作参数在出厂前已经过预设置。 Ventana自动切片染色机的染色程序如下所示（欲了解更详细的说明和额外的协议选择，请参见操作手册）。ES和NexES IHC自动切片染色机需进行抗原修复：1. 将载玻片脱蜡并经过一系列二甲苯和梯度酒精入水和相应的缓冲液。实施抗原修复程序并将载玻片转移至APK 洗涤液（1X）中。 2. 将一抗、相应的检测试剂盒分配器和所需的配套试剂放到试剂托盘上，并将其放置到自动切片染色机上。检查液体瓶和废物缸。3. 在载玻片干燥的一端粘贴与试验方案对应的条码标签。4. 将已经过脱蜡、抗原修复、加贴标签的载玻片放入APK洗涤液（1X）中。避免组织干燥。不需进行抗原暴露：1. 将条码标签贴于载玻片一端。再经一系列二甲苯脱蜡和梯度酒精入水，然后放入APK 洗涤液（1X）。2. 将一抗和相应的检测试剂盒分配器和所需的配套试剂放到试剂托盘上，并将其放到自动切片染色机上。3. 从APK洗涤液（1X）中加载经脱蜡和加贴标签的载玻片。避免组织变干。BenchMark或BenchMark XT自动切片染色机1. 使用载玻片条码标签，该标签与待执行的试验方案相对应。2. 将一抗、相应的检测试剂盒分配器和所需的配套试剂放到试剂托盘上，并将其放置到自动切片染色机上。检查液体瓶和废物缸。3. 将载玻片放到自动切片染色机上。针对所有分析仪1. 开始染色。2. 染色结束后，将载玻片从自动切片染色机上拿下来。3. 对于iVIEW DAB和Ventana Red试剂盒，用温和的洗涤剂或酒精进行清洗，以去除盖玻片上的溶液；在脱水和清洁后，常规封片。4. 对于AEC显色，不要脱水和透明。用水溶性封固剂封片。应在染色后的2-3天内阅片，染色片于室温（20 - 28 C ）下可保存至少2年。 质控程序阳性组织对照每次染色流程必须包含阳性对照。阳性对照的目的是为了确定试剂和仪器功能的可靠性。用于对照的组织可同时包含呈阳性和阴性染色的细胞或组织成分，以便同时提供阳性和阴性对照。用于对照的组织应为新鲜的尸检、活检或外科手术切除标本，并采用与试验切片相同的方法尽快制备或固定。对照组织的目的是为了监控程序的所有步骤，包括从标本制备到染色的各个环节。使用与试验样本不同固定或处理方式的组织切片可对除固定和组织处理以外的所有试剂和方法步骤进行质控。 可使用阳性染色较弱的组织来优化质控和检测轻微的试剂降解。 阳性对照只能用于评价实验步骤和试验试剂的正确性，而不能用来辅助评价病人样本的诊断结果。如果阳性对照出现阴性结果，则实验标本的结果无效。阴性组织对照可将用于阳性对照的同一组织用于阴性对照。由于在大多数组织中细胞类型多样，故可同时提供内部阴性对照位点，但使用者应对此进行检验。如果阴性对照中出现特异性染色，那么病人样本的结果应被视为无效。 疑难解答 当对照试验有任何问题，请立即向您当地的 Ventana 办事处报告。如果对照试验缺乏特异性，那么病人结果将视为无效。详情请参见本说明书的“疑难解答”一节。在明确和解决问题后重复检测病人样本。阴性试剂对照 对于免疫组化而言，为正确评判结果，每次试验都应设立阴性试剂对照。阴性试剂用于取代一抗来评估非特异性染色。在适当时载玻片应使用单克隆阴性对照或多克隆阴性来染色。如使用了其他阴性试剂对照，应使用Ventana抗体稀释剂将其稀释至与一抗同样的浓度。稀释剂本身也可作为阴性试剂对照。阴性试剂对照的孵育时间应与一抗的孵育时间相同。 当在一组连续切片上使用多个抗体时，应用一个阴性试剂对照即可。 检测方案正确性检验每当初次制定检测方案，都应首先进行阳性或阴性对照检验，用以验证方法的特异性（参照本产品说明书中的“质控程序”一节，以及美国病理家学院实验室认可体系、解剖病理检查表和NCCLS批准指南中的质控建议）。在更换抗体批次或更改检测参数时均应重复此类质控程序。结果解释Ventana自动免疫染色程序会产生显色反应产物，从而在被一抗定位的抗原位点出现沉淀。有关预期的显色反应信息请参见相应的检测试剂盒包装插页。将苏木精II应用于复染将致使细胞核中的异染色质蓝染色。在免疫组织化学程序上有经验且资深的病理学家必须在解释结果之前对阳性和阴性对照进行评估。阳性组织对照 为明确试剂有效性，应首先观察阳性对照组织。如靶细胞内出现适当的显色反应产物，则表示存在阳性反应。有关预期显色反应的详情请参见检测试剂盒的包装插页。复染的强度取决于所选的孵育时间。 对于IHC复染，视孵育时间长短和所用的苏木精效能的不同，细胞核呈灰白色至深蓝色。复染过多或不充分都可能影响结果的正确判断。 如果阳性对照组织呈现阴性的免疫反应，那么试验样本的任何结果应被视为无效。阴性组织对照应在检测阳性组织对照之后检查阴性组织对照，以明确一抗特异性。如阴性组织对照中缺乏特异性染色，则证明细胞或细胞成分中缺少抗原交叉反应。如在阴性组织对照中出现特异性染色，那么病人样本的结果应被视为无效。非特异性染色常呈现染色弥散现象。在福尔马林固定过久的组织切片中常能观察到结缔组织的散在性的轻度染色。 在解释染色结果时应选择结构完整的细胞。坏死或变性的细胞通常会呈现非特异性染色。病人组织应在最后检查病人样本。应根据阴性试剂对照的背景染色情况对阳性染色强度进行评估。在免疫组织化学测试中如出现阴性结果表示未检测出特异性的抗原，并不能说明待检细胞或组织中不存在该抗原。在必要时，可使用一组抗体来帮助识别假阴性反应。在解释结果时，还应结合苏木精和伊红染色来观察样本的组织形态。只有综合患者样本的形态学发现及相关临床资料，病理学家才能对结果做出正确解释。影响因素 1. 免疫组织化学是一种多步骤诊断过程，在选择适当的试剂、样本、滴定、处理、免疫组织化学载玻片制备和染色结果解释上需要进行专门的培训。2. 组织染色取决于染色之前对组织的处理和加工。不正确的固定、冰冻、融解、清洗、干燥、加热、切片或被其他组织或流体污染都可能产生人工假像、假阳性或假阴性结果。结果的不一致可能是由于固定和包埋方法的不同，或是组织内固有的不规则所造成的。3. 复染过多或不充分可能影响正确的结果解释。 4. 必须结合临床病史、形态学和其他组织病理学标准来评估对任何阳性染色或染色缺乏的临床解释。必须采用形态学研究和适当的对照以及其他诊断试验对任何染色或染色缺乏的临床解释加以补充。本抗体旨在用于一组抗体中。熟悉染色制备所用的试剂和方法是资深的病理学家的职责所在。必须在经认证许可的实验室内进行染色，且由一位负责审核已染色载玻片并确保阳性和阴性对照的充分性的病理学家进行监督。5. 如遵照说明书的步骤进行，Ventana提供的抗体和试剂具备最佳的稀释度。如未按照推荐的测试程序进行，则可能无法达到预期的结果。必须加以适当的质控并将其记录下来。未执行推荐测试程序的使用者必须对病人结果解释承担责任。6. 试剂可能在之前未经测试的组织中显示意料之外的反应。由于抗原表达在肿瘤或其他病理组织中具有生物变异性，因此无法完全消除被测试组织群出现意料之外反应的可能性。5请将您记录的意料之外的反应报告给您当地的Ventana办事处。7. 乙肝炎病毒感染的病人的组织和乙肝炎表面抗原（HBsAg）阳性的组织可能在辣根过氧化物酶检测中出现非特异性染色。6 8. 在使用封闭步骤时，由于可能存在自身抗体或天然抗体，取自与二抗同源动物的正常血清可能导致假阴性或假阳性结果。9. 非免疫学结合蛋白质或底物反应产物可能导致假阳性结果。这种情况也可能是假性过氧化物酶活动（红细胞），内源性过氧化物酶活动（细胞色素C），碱性磷酸酶活动或内源性生物素（如肝脏，大脑，胸腔，肾脏）所引起的，具体视所用的免疫染色类型而定。710. 在免疫组织化学测试中如出现阴性结果表示未检测出抗原，而不是待测细胞或组织中不存在该抗原。11. 蛋白酶1已进行优化，可结合Ventana检测试剂盒和Ventana自动切片染色机一同使用。由于组织处理的差异，可能必须延长或缩短个别样本的蛋白酶1孵育时间。 预期结果摘要1. 在Ventana自动切片染色机上应用苏木精II将致使细胞核中的异染色质蓝染色。有关预期的病人样本结果请参照相应的Ventana一抗包装插页。相应的样本质控结果应能证明试剂和分析仪都运作正常。2. 灵敏度取决于抗原的保存情况。在固定、切片、包埋或储存过程中出现的更改抗原性的任何不正确的组织处理会削弱一抗检测，且可能产生假阴性结果。3. 在应用苏木精的100%的病例中，批间重复性致使细胞核中的异染色质蓝染色。4. 在应用苏木精的100%的病例中，批内重复性致使细胞核中的异染色质蓝染色。疑难解答1. 如果阳性对照的染色结果比预期的要弱，应对同一台分析仪进行的其他阳性对照进行检查，以确定是否是由一抗或其它试剂问题所致。 2. 如果阳性对照结果显示为阴性，应对其进行检查以确保载玻片的条码标签是否正确。如载玻片的条码标签正确，那么应对同一台分析仪进行的其他阳性对照进行检查，以确定是否是由一抗或试剂的问题所致的。当然也要检查样本的选择、固定和脱蜡等步骤。 3. 如果出现过多的背景染色，可能样本中存在较多的内源性生物素。应增加生物素封闭步骤。 4. 如果脱蜡不彻底，应重复脱蜡步骤。5. 如果特异性抗体染色强度过高，应遵循将孵育时间缩短4 分钟的间隔重复测试，直到达到预期的染色强度。 6. 如发生脱片现象，应检查载玻片质量，确保其带正电荷。 7. 有关正确操作，请参照自动切片染色机操作手册的“详细程序步骤”一节，或联系您当地的Ventana办事处。参考1. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology, 2nd Edition. The C.V. Mosby Company, St. Louis, 1980. 2. College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, 2001. 3. NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry: Approved Guideline. NCCLS document MM4-A- (ISBN 1-56238-396-5). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898 USA, 1999. 4. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech Histochem 66(4): 194-199, 1991. 5. Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen. A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 73(5): 626-32, 1980. 6. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: part 1. The technique and its pitfalls. Lab Med 14: 767, 1983. 7. Gill GW, Fros