传染性支气管炎.doc

传染性支气管炎综述传染性支气管炎（infectious bronchitis）,是由传染性支气管病毒（infectious bronchitis virus IBV）引起鸡的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道和生殖道甚至消化道传染病。其特征是气管罗音、咳嗽和打喷嚏；没有获得母源抗体的雏鸡由于呼吸道或肾脏感染可引起死忙；雏母鸡感染IBV病毒后可引起永久性的输卵管损伤，到性成熟丧失产蛋能力；蛋鸡感染后抵抗力降低，产蛋数量和品质下降；此外该病还可能侵害肾脏以及造成病鸡肾脏肿大、苍白，有大量尿酸盐沉积，胃肠道病变，肌肉损伤等。鸡部分年龄性别和品质均易感，但主要侵害1-4周龄的幼鸡。传染性支气管炎可引起鸡的增重、饲料报酬以及生产性能降低，也易引起混合感染而提高鸡群的死亡率。病原学传染性支气管病毒（infectious bronchitis virus IBV）属于冠状病毒科冠状病毒属。病毒颗粒略呈球状，直径80120nm，有时呈多形性，有囊膜及许多梨状纤突，呈放射状排列，纤突长约20nm，末端呈球形，纤突之间有较宽的间隙，易从病毒粒子上脱落，核衣壳螺旋状对称。基因组为单分子线状正链单股RNA，大小为2700032000nt，是已知RNA病毒中基因组最大的，因而易发生突变，产生许多抗原性及致病性的变异株。IBV含有三种病毒特异主要结构蛋白，即纤突（S）、膜(S)糖蛋白及内部核衣壳（N）蛋白。S蛋白由两种糖多肽S1和S2各2-3个拷贝构成，血凝抑制和大多数中和抗体都是由S1引起。M蛋白仅有10%暴露于病毒外面。N蛋白缠绕RNA基因形成核糖核蛋白体（RNAP）。此外，还有第四种蛋白，即小膜蛋白（E），它以很小的量结合在囊膜上，可能与病毒子形成有关。病毒主要存在于病鸡呼吸道渗出物中。肝、脾、肾和法氏囊中也能发现病毒。本病毒能在10-11日龄的鸡胚中生长，还能在鸡胚肾细胞、肝细胞以及鸡肾细胞培养上生长，也能在非洲绿猴肾细胞株中连续传代。但最常用的事鸡胚肾细胞，多次继代后（6-10代后）可产生细胞病理变化作用，使细胞出现蚀斑，表现为胞浆融合，形成合胞体，继而细胞坏死。传染性支气管炎病毒的热稳定性随毒株的不同而异，如新分离毒株可被5615-30min灭活，而适宜于鸡胚的毒株可在此温度下存活3小时以上，研究表明，鸡胚传代适应的病毒耐热力很强。病毒对一般消毒剂敏感，如0.01%高锰酸钾、1%福尔马林、70%酒精，均可在室温下几分钟杀死病毒。在细胞培养中，IBV在PH6.0-6.5的环境中最稳定。流行病学本病仅发生于鸡，各种年龄和品种的鸡均易感，以14周龄的鸡最易感。IBV的传染力极强，特别容易通过空气在鸡群中迅速传播，数日内即可波及全群。感染鸡从呼吸道分泌物排出病毒的时间长达周。本病主要通过病鸡咳出的飞沫经呼吸道传播，也可通过病毒污染的饲料、饮水和用具等间接地经消化道传播。鸡群拥挤、鸡舍通风不良和冷应激都可促进本病的发生。病鸡耐过后有免疫力。不同的IBV具有不同的组织嗜性，有嗜呼吸道、生殖道的，有嗜肾的，还有嗜肠型等。自然情况下如果感染IBV，特别是小鸡，通常会在48内出现症状；而人工接种后，从第小时到第天始终可从鸡气管、肾脏、法氏囊中分离出病毒。雏鸡感染后症状严重，死亡率取决于病毒株的毒力及鸡群抵抗力，一般为20%30%；有报道腺胃型雏鸡死亡率可达95。影响本病发病和死亡的因素包括：感染株的毒力，鸡群的年龄、免疫状态、应激（例如低温、封闭、拥挤）。而继发性的细菌感染往往会导致衰竭而死亡。致病机理IBV具有上皮亲嗜性，通过病毒固定进入上皮细胞。IBV主要通过口、眼鼻途径入侵宿主，首先在上呼吸道繁殖，接着发生病毒血症并向其他组织分布。免疫荧光、免疫过氧化物酶和电镜技术已经表明病毒是在纤毛上皮细胞和黏液分泌细胞中复制。临床上鼻腔和气管中病毒的最高滴度是在感染后的23，但病毒至少可以存在25。病毒也可以在肺泡和气囊的上皮细胞中复制，并发现较高的病毒滴度。感染鸡肺部可看到小的肺炎灶，气囊出现云雾状或黄色干酪样渗出物。IBV对呼吸道感染毒力的强弱随不同毒株而异，无并发感染的病例，死亡率通常不高，主要由于黏膜栓子阻塞下呼吸道造成呼吸困难引起死亡。除上呼吸道组织的上皮细胞内出现病毒外，肾脏、输卵管、消化道的许多部位（食道、前胃、十二指肠、空肠、盲肠扁桃体、直肠、排泄腔）、法氏囊等的上皮细胞内也能定位到病毒。虽然IBV对肠道组织有广泛的亲嗜性，但肉眼和显微镜观察不到肠管的临床变化。感染IBV 的肾脏病变主要是间质性肾炎。该病毒可引起肾小管上皮细胞颗粒变性、空泡化及肾小管上皮脱落，在急性期还可看见间质组织中有大量异嗜性细胞浸润。在某些病例中，退行性病变可持续存在，并引起单个肾单位或整个肾区严重萎缩。由于肾脏损伤引起饮水增多、肾小管上皮结构改变引起水分和电解质运输下降，导致急性肾衰竭，出现死亡。对感染肾组织的超微研究发现，IBV复制的主要靶部位是肾单位下段和导管的上皮细胞。感染上皮细胞内的线粒体肿胀、高尔基囊泡扩张以及粗面内质网数量增多。用肾型IBV毒株接毒后6左右，鸡开始出现死亡，10左右达到死亡高峰，最后死亡时间一般在接毒后16左右。IBV感染蛋鸡后会对输卵管漏斗部和容纳部产生一定的病变，其表皮纤毛和颗粒细胞以及管状腺分泌表皮细胞是IBV 的靶细胞。输卵管感染IBV引起上皮细胞变短，纤毛减少或完全消失，腺泡区发育不良，从而导致产蛋量下降等。IBV株感染的蛋鸡，与正常母鸡比较输卵管漏斗部和容纳部的超显微变化显示：感染后28没记录到病理变化；1014部分纤毛受损；1624部分蛋鸡的输卵管漏斗部和容纳部的肌层中都没有观察到纤毛受损和淋巴小结；在感染后1012中，病毒粒子主要在粗面内质网和高尔基复合体中检出；在感染后1014中，多种细胞器发生病理变化。容纳部比漏斗部易受感染，而且受感染细胞的粗面内质网病毒粒子增加。不同毒株产生的细胞变化在不同毒株不同，如株比株感染产生的病变更剧烈。受感染蛋鸡产水样蛋白蛋，可能是因为容纳部颗粒状上皮细胞和管状腺上皮细胞的病变，导致了白蛋白的合成减少。能引起全部功能性输卵管部分的病变，而且可以持续到感染后30。同时，导致部分产蛋鸡停止产蛋，漏斗部和容纳部纤毛受损，会造成二次细菌感染，并且影响种鸡繁殖率。临床症状本病潜伏期17 天，平均为3 天。由于病毒的血清型不同，鸡感染后出现不同的症状。呼吸型病鸡无明显的前驱症状，常常突然发病，出现呼吸道症状，并迅速波及全群。幼雏发病表现为伸颈、张口呼吸、咳嗽，有“咕噜”音，尤以夜间最清楚。随着病情的发展，全身症状加剧，病鸡精神萎靡，食欲废绝、羽毛松乱、翅下垂、昏睡、怕冷，常拥挤在一起。2 周龄以内的病鸡，还常见鼻窦肿胀、流粘性鼻液、流泪等症状，常甩头。产蛋鸡感染后产蛋量下降25%50%，同时产软壳蛋、畸型蛋或砂壳蛋。感染肾型支气管炎病毒后其典型症状分3 个阶段。第1 阶段是病鸡表现轻微呼吸道症状，鸡被感染后2448 小时开始气管发出锣音，打喷嚏及咳嗽，并持续14 天，这些呼吸道症状一般很轻微，有时只有在晚上安静的时候才听得比较清楚，因此常被忽视。第2 阶段是病鸡表面康复，呼吸道症状消失，鸡群没有可见的异常表现。第3 阶段是受感染鸡群突然发病，并于23 天内逐渐加剧，病鸡挤堆、厌食，排白色稀便，粪便中几乎全是尿酸盐。腺胃型传染性支气管炎其主要表现为病鸡流泪、眼肿、极度消瘦、腹泻和死亡并拌有呼吸道症状，发病率可达100%，死亡率3%5%不等。 病理变化呼吸型主要病变见于气管、支气管、鼻腔、肺脏等呼吸器官。表现为气管环出血，管腔中有黄色或黑黄色栓塞物。幼雏鼻腔、鼻窦黏膜充血，鼻腔中有粘稠分泌物，肺脏水肿或出血。患鸡输卵管发育受阻，变细、变短或成囊状。产蛋鸡的卵泡变形，甚至破裂。肾型传染性支气管炎，可引起病鸡肾脏肿大，呈苍白色，肾小管充满尿酸盐结晶，扩张，外形呈白线网状，俗称“花斑肾”。严重的病例在心包和腹腔脏器表面均可见白色的尿酸盐沉着。有时还可见法氏囊黏膜充血、出血，囊腔内积有黄色胶胨状物；肠黏膜呈卡他性炎变化，全身皮肤和肌肉发绀，肌肉失水。腺胃型腺胃肿大如球状，腺胃壁增厚，黏膜出血、溃疡，胰腺肿大、出血。IBV的检测方法病毒的分离 可无菌采取数只急性期的病鸡气管渗出物和肺组织，制成悬浮液，每毫升加青霉素和链霉素各一万IU，置四度冰箱过夜，以抑制细菌污染。离心后取上清经尿囊腔接种于10-11日龄的鸡胚。初代接种的鸡胚，孵化至19d，可使少数鸡胚发育受阻，而多数鸡胚能存活，这是本病毒的特征。若在鸡胚中连续传几代，则可使鸡胚呈现规律性死忙，并出现特征性病理变化。也可收集尿囊液经气管内接种易感鸡，如有本病毒存在，则被接种的鸡在1836小时后可出现临诊症状，发生气管罗音。还可将尿囊液经1%胰蛋白酶37作用4小时，在做血凝及血凝抑制试验进行初步鉴定。血清学诊断1、琼脂扩散实验( AGP) :以感染16 20 h的材料制备抗原最佳。AGP具有足够的灵敏性和特异性。AGP抗体阳性率与病毒的致病性、病毒的感染剂量、鸡的日龄及感染时抗体的存在状态有关。2、中和试验( VN ) : VN 实验是鉴定IBV的经典方法, 鉴定结果有很强的实际意义。中和试验可在鸡胚、鸡胚肾细胞( CEKC )或气管环培养物上进行, 广泛用于IB野毒株的分离和鉴定及血清分型。通过对IBV 在CEKC 和气管环组织培养物上的适应性的比较, 认为比CEKC 更适用。但其也有操作复杂、费时、费力、价格昂贵、结果判断具有主观性等缺点。3、 酶联免疫吸附试验( ELISA ): 自1981年Junquardt 首次成功应用ELISA 以来,EL ISA 广泛应用于IBV 抗体的检测。它比其他方法要灵敏, 有研究证实它是VN 实验的2 3倍、AGP实验的188 倍。江经纬以致病性较强的传染性支气管炎毒株IBV M41株为研究对象, 通过免疫保护试验, 抗体检测试验说明IBV 人工发病模型可用于评价IB毒株的致病性和评价弱毒疫苗的保护效力,该EL ISA 方法可以用作检测IB 疫苗抗体水平。4免疫荧光法( IFA ): 该法可用于抗原检测及抗原组织定位的研究。检测抗原的步骤: 将病料滴在载玻片上, 固定后, 滴加IBV抗体, 37 下在湿盒内作用1 h, 冲洗20m in,加入荧光素标记的二抗, 室温下作用1 h, 冲洗如上, 镜检。免疫荧光抗体法在检测鸡传染性支气管炎中具有快速、便捷的特点, 尤其在IBV 的抗原定位中应用更为广泛, 而且结果的判定具有直观性。朱建国选用了一株反应谱广的单抗作一抗, 建立了单抗介导的间接荧光抗体法, 用于检测鸡胚尿囊细胞中的IBV, 其具有很高的特异性, 能够迅速做出定性检测, 应用IFA 鉴定IBV 型特异性和群特异性抗原, 准确率达70%。分子生物学诊断技术1、RT - PCRRT - PCR技术是一种选择性体外扩增DNA 或DNA 片段的方法, 具有特异、快速、灵敏、简便等优点, 目前该方法在NDV 检测和诊断中的应用也很广泛。将从商品肉鸡场采取的IBV 样品, 反转录成DNA 后, 用PCR扩增, 然后用荧光定量PCR + HRM 系统, 检测IBV 3 UTR 从而得到了230 435 bp的目的产物。而对华东地区鸡传染性支气管炎病毒M、N基因用RT - PCR 检测方法证明RT- PCR 技术具有敏感、特异、快速等特点, 适用于不同来源及不同血清型IBV 的检测。2、核酸探针该技术具有很高的敏感性。原理是利用合成的特异核酸探针与PCR 扩增的待检IBV 基因片段杂交, 如果IBV 基因片段与已知核苷酸并标记同位素的探针互补, 则两者结合, X底片就会显影; 反之则不显影, 具有很高的敏感性。Kwon应用PCR 和生物素标记的DNA探针检测了接种IBV 的SPF鸡气管中的IBV 基因组, 证实此法比电镜( EM )观察病毒法要灵敏。以地高辛( D IG )标记鸡传染性支气管炎病毒( IBV ) po l基因的保守片段制成核酸探针, 结果表明, 利用DIG 探针检测IBV 的RT - PCR 产物, 特异性和敏感性强, 可重复, 能克服RT - PCR 非特异性反应和探针N orthern杂交的不稳定性。利用核酸探针的群特异性, 根据传支病毒基因组中相对最为保守的N 基因设计引物, 检测结果稳定, 重复性好, 且在检测时, 不需要特殊的仪器设备。因此, 特别适宜于基层对IBV的诊断和流行病学调查。IBV 疫苗研究现状IBV 是长期以来困扰养禽业发展的主要疾病之一, 全世界IBV 有30 多个血清型, 不同血清型毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在很大差异, 不同毒株之间交叉保护效果差, 变异株不断出现和流行, 且IBV 的变异常常是基因型变异和血清型变异交替发生或同时存在, 另外组织嗜性也在不断的发生变化,这些特性使IBV 的免疫预防难度加大, 鸡群常因免疫失败而导致IBV 的暴发。研制安全、高效的IB 疫苗成为亟待解决的难题, 成为科研工作者的研究热点。随着对IBV 分子生物学特性、变异机理及免疫机制的深入研究, IB 疫苗研究工作取得了一定的进展, 现将近年来IBV 疫苗研究进展进行简要概述。灭活疫苗王红宁对IBV 进行了分子流行病学调查, 指出用多价灭活疫苗预防本病更为有效, 并研制了多种多价油乳剂灭活疫苗, 经区域试验证明该疫苗安全, 并能有效预防IB。但灭活疫苗副作用大, 免疫后能够造成较严重的和持续时间较长的局部反应,况且灭活疫苗对冠状病毒感染的免疫效果不确实 。2 弱毒疫苗长期以来, 一般是采用弱毒活疫苗对传染性支气管炎( IB) 进行预防控制, 取得了一定的效果。在我国使用的弱毒疫苗中H120 和H52 应用最广泛,但该疫苗对肾型传染性支气管炎的预防无效。原因在于肾型和呼吸道型支气管炎的免疫机制存在很大差异, 因此在较大程度上影响了疫苗的保护作用。中国兽药监察所王志伦、肖玉芳等专家经多年努力,从国内分离、筛选并成功研制了肾型IBW93 疫苗,该疫苗不仅对肾型传染性支气管炎有良好效果, 对呼吸型和变异性传染性支气管炎也有良好预防效果 。但IB 弱毒疫苗可在感染机体中引起持续的潜伏感染, 并有可能成为IBV 突变的主体和重组变异的供体。另外, 弱毒疫苗还存在着一个隐患就是在使用过程中容易毒力返强。由于IBV 具有高度的变异性, 病毒基因组RNA 的点突变、缺失和插入突变以及不同毒株( 包括疫苗毒株) 基因组间