1-第八章 花药和花粉培养.doc

第八章 花药和花粉培养 植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半，叫做单倍体细胞。用离体培养花药的方法，使其中的花粉发育成一个完整的植株，叫做单倍体植株。利用雄蕊的花药离体培养获得的再生植株，是由不同基因型的配子发育而来，具有十分丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，利用茎尖培养扩大繁殖，经过经济性状鉴定后，选出优良者配制杂交组合，可获得优良杂交种子。目前，花药培养这一细胞工程技术已经成为植物育种和种子生产的重要手段，我国在花药培养和单倍体育种工作上，一直处于国际先进水平。 利用单倍体植株进行育种好处表现在“快”，能比常规的杂交育种方法缩短育种周期。以芦笋为例，利用雄性雌性株（Mm）培育纯系，需连续自交6代，而通过花药培养的方法，可以节省6代自交时间，大大缩短育种年限，一般杂交育种要810年才能得到稳定后代，而花药培养只需要2年时间。另外，花药单倍体育种法的育种程序比常规杂交育种的程序要简化。第一节 花药与花粉培养的意义一、花培概况 在60年代中期印度德里大学的两位植物学家古哈（Guha）和马赫施瓦里（Maheshwari）偶然发现，他们培养的毛叶曼陀罗花药中长出的胚状体是来源于花粉的单倍体植株。从此以后，很快引起了各国遗传育种工作者的重视。接着有人在烟草和水稻上相继进行了离体培养花药的试验，并得到了单倍体花粉植株。据不完全统计，现在已有250多种植物获得了单倍体植株。我国自“六五”首次育成花药培养小麦新品种京花1号在育种史上取得重大突破以来，已育出小麦品种10多个，水稻品种20多个，还有玉米、油菜、烟草、果树、蔬菜等作物新品种，总计种植面积已达数200多万公顷，已成为世界上花药和花粉培养品种应用最广的国家。纵观10多年，与其它高新技术相比，花药和花粉培养育种育出的新品种（品系）最多，成果应用最广，取得的社会经济效益最大，而资金的投入最少。事实证明，这是一条经济、有效、快速的育种途径。我国花药培养和单倍体育种的研究成绩是巨大的，但离育种实践的高效率要求还有相当的距离。如作物不同品种的性状有很大差异，离体花药对于相同培养基的反应差异很大，还存在诱导频率较低，染色体加倍技术不甚理想，白化苗等问题。二、花粉植株的诱导途径 1营养细胞发育途径（A途径） 在花药离体培养中，花粉第一次有丝分裂形成不均等的营养核和生殖核。生殖核较小，一般不分裂或只分裂1-2次，就逐步退化。而体积大的营养核经多次分裂且形成了细胞壁，最后变成了多细胞团，迅速生长，很快就突破花粉壁，细胞不断分裂，可以产生胚状体或愈伤组织。 2生殖细胞发育途径（B途径） 在这种途径中营养核只分裂12次就退化了，而生殖核经多次分裂发育成多细胞团。3营养细胞和生殖细胞同时发育的途径（C途径） 在花粉第一次有丝分裂形成的营养核和生殖核同时进行多次分裂，因此最后形成的多细胞团包括两部分，一部分细胞较大的是由营养细胞分裂而来的，另一部分细胞较小的则由生殖细胞分裂而来。4花粉均等分裂途径（D途径） 花药培养中花粉进行均等分裂形成两个均等的子核，以后二核间产生壁，形成两个子细胞。由两个子细胞形成多细胞团，迅速生长，穿破药壁而形成胚状体或愈伤组织。从花药培养分化产生植株有两种方式。大多数情况下是从愈伤组织分化产生植株。就是经脱分化，从花粉发育成多细胞，产生愈伤组织；然后经再分化产生芽，而形成植株。这种方式易产生遗传变异和染色体的倍性变化，除单倍体外，还经常会有各种混倍体出现。再有一种方式是从胚状体直接产生植株。即花药培养中直接从花药中产生胚状体，长出小植株。这种方式不经过愈伤组织，可保持遗传上的稳定性，得到的植株大多为单倍体，且成苗快，成苗多。究竟是愈伤组织再分化成苗，还是直接产生胚状体成苗，因培养条件而异，不同的培养基其结果就不相同。三、花培的意义1纯合育种材料2缩短育种年限 8-10年（杂交育种）2年（花培育种）3提高选择效果 AAbbaaBB F1 AaBb1/4AB 、 1/4Ab 、 1/4aB 、 1/4ab F2 1/16 AABB 4特殊用途：DH群体（指用F1产生的各种花粉培养成的各种花粉植株的统称），也称永久分离群体。第二节 花药培养技术 一、取材 （一）植株的培养 花药培养所用的材料取自大田的要比从温室来的好，因为大田生长的材料一般生长比较健壮，发育好。供体植株的环境温度会显著影响花药培养效率，温度的敏感期在减数分裂期至四分子期，削弱花药培养效率的具体温度则依作物种类而定。植株生长时其它条件也会影响花药培养效率。水稻供体植株在强光和较长日照时数下具有较高的愈伤组织诱导率。水稻供体植株在强光高氮下生长，有利于提高愈伤组织诱导率和愈伤组织的绿苗分化率。适当增加供体植株的碳、氮营养是有益的。 （二）花粉发育阶段的选择 花药培养材料的选择，关键在于选取花粉处于合适发育期的花药，以便离体培养后能启动花粉发育。花粉发育的适宜阶段因作物不同而不同。一般用花粉发育处于单核期的花药培养较易取得成功。花药在接种以前，一般应预先用醋酸洋红或碘化钾染色，再压片进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间的相应关系。所以掌握这一时期的特征颇为重要。如烟草，此时花蕾的花冠大约与其萼片等长。对禾谷类作物来说，此时尚处于孕穗期。例如水稻，此时颖片通常已达最后大小，淡绿色，剥出的花药也呈淡绿色，如果花药白色则过嫩，黄色或黄绿色则偏老。但不同的品种，相应的外部形态特征也常有一定的差异，所以在取用新的材料以前还是镜检一下为好。二、 培养基的选择（一）基本培养基 在花药培养中常用的基本培养基有Murashige和Skoog（1962）、Nitsch（1969）、Miller（1963）、B5（1968）、N6（1975）、马铃薯II等。由于花药培养的不同阶段，以及细胞的增殖、生长和分化，对无机盐会有不同的需求，对愈伤组织诱导和生长有利的基本培养基就并不一定能保证愈伤组织一定具有较好的分化能力。水稻花药培养于N6基本培养基的，有较高的愈伤组织诱导率，但愈伤组织分化潜力则是花药培养于MS的高；小麦花药的愈伤组织分化率是改良马铃薯培养基高于N6，但愈伤组织的绿苗分化潜力则相反。 糖在基本培养基中起着碳源和提供渗透压的作用。在花药培养中，通常以蔗糖为好。蔗糖浓度对诱导花粉生长具有一定作用。多数作物的花药培养中，均需适当提高培养基中蔗糖浓度，但对于不同作物，适宜的蔗糖浓度是不同的，如水稻的适宜浓度为3%6%，小麦为6%10%，大麦和黑麦草为12%，玉米为12%15%，油菜和烟草为3%。除了蔗糖以外，也有用葡萄糖、麦芽糖的。花药培养方式有固体培养和液体培养两种，固体培养的琼脂用量一般为0.6%0.8%。液体漂浮培养有时加入水溶性聚蔗糖（Ficoll）效果可能更好。（二）激素 花药培养中，外源激素的供应是必不可少的。通常，诱导愈伤组织和花粉胚胎发生时以生长素为主，愈伤组织分化芽时以细胞分裂素为主，发根时则需供应适量的生长素。培养基中常用的生长素有二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸（IAA）和吲哚丁酸（IBA），常用的细胞分裂素有6-苄基腺嘌呤（BA）、激动素（KT）和玉米素（ZT）。高浓度的生长素往往会抑制花粉的发育，且诱使二倍体的体细胞组织（药隔、药壁）的生长，低浓度时则体细胞不发育，而诱导花粉产生愈伤组织，某些情况下花粉的发育还可不经愈伤组织的途径，直接产生胚状体。诱导愈伤组织以使用二氯苯氧乙酸(2,4-D)为好。具体应用中，激素的种类、浓度和配比十分复杂，只能进行筛选，以求得最适激素的种类、浓度和配比。 此外，有的还在培养基中加入椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白等，它们对提高诱导频率也有明显的效果。（三）分化培养基 大多数情况下花药培养后产生愈伤组织，故还需进一步转移到分化培养基上，诱导分化产生芽和根，才能得到完整的植株。分化培养基的成分基本上与基本培养基相同，只是改变其中的激素。从基本培养基到分化培养基，为诱导芽的分化，通常是提高细胞分裂素的含量而降低生长素的用量，有的甚至不用生长素。 三、材料的低温预处理 花药培养中为了促进愈伤组织或胚状体的形成，提高花粉的诱导率，可以对花药进行各种预处理，如低温、高温、辐射、黑暗等处理，其中以低温处理的效果最显著。低温预处理促进花药培养效率已在水稻、小麦、大麦、玉米、黑麦、小黑麦、油菜等作物得到肯定。预处理温度一般最低为2C，最高为14C，处理时间短的仅6小时，长的达35天。水稻大体为810C，714天左右；小麦为35C，37天左右；大麦为35C，1525天左右；玉米为48C，714天左右。花药培养中的低温预处理措施，在许多作物都显示出良好的效果，因此，在水稻、小麦、大麦的花药培养中，低温预处理已经成为许多研究者所普遍采用的一项常规措施。但是，由于作物材料本身差异很大，性状又受供体植株的环境影响，低温预处理的配合因素又较复杂，要使低温预处理更好地发挥效果，还需继续研究低温预处理的作用规律和机理。四、消毒 花药培养时，作物材料的表面消毒通常比较方便，因为未开放的花蕾中的花药为花被所包裹，本身处于无菌状态之中。花蕾或幼穗的表面消毒一般用70%的酒精在表面擦试或浸一下（1030秒钟），无菌水洗3次，再在10%的漂白粉溶液中浸20分钟，或用0.1%升汞溶液消毒10分钟，然后用无菌水洗35次即可。在操作熟练的情况下，也有仅用70%酒精将花器表面擦净即取花药的。消毒时间一般不宜过长，否则漂白粉溶液会逐渐渗入花蕾或颖花内，如果花药接触到灭菌药液，又冲洗不净，会影响培养后的生长。五、接种 取出花药应在无菌条件下进行。应注意整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应剔除。因为损伤常常会刺激花粉壁形成愈伤组织。以花药较大的作物作材料时，可用解剖刀或镊子剥开花蕾，以镊子夹住花丝，取出花药。禾谷类作物的幼穗摘下各个枝梗或切成若干小段，用小剪刀剪去颖壳上半部，再用镊子取出花药；也可用小剪刀剪去颖壳基部，用镊子夹住颍壳顶部并敲打培养瓶口，使花药从颖壳剪口处直接进入培养瓶。 六、培养 （一）愈伤组织的培养 愈伤组织的培养一般在黑暗、恒温条件下进行，温度2328C左右。离体培养材料在培养基上培养一段时间以后，就会从花粉形成愈伤组织（或胚状体）。当这种愈伤组织及时转移至合适的培养基上时，即可诱导形成芽、根器官，并形成植株。（二）培养基的转移 花药培养中凡花粉形成愈伤组织的，多数需要转移到分化培养基上进行照光培养，一般每天给以1116小时的日光灯照明，光照强度20004000lx，以诱导形成芽和根。掌握花粉愈伤组织转移的时机，对于有效地分化出芽是十分重要的。对于水稻和小麦，一般在愈伤组织出现后达到23毫米大小时转移比较适宜。愈伤组织太小，转移后不易成活；太大则不易分化，因其中分生细胞的比例已大为降低。愈伤组织转移后1020天左右，一般即可看到芽的分化，快的甚至在57天后即分化。七、移植 由愈伤组织长出的幼苗，在具45片叶时即可移植到室外或温室。如果温差太大，需要经过炼苗后再移植。第三节 单倍体植株的二倍化染色体加倍为了得到可育的纯合二倍体，必须把单倍体植株的染色体组加倍。加倍的途径有自发加倍（或称天然加倍）、人工加倍和花粉愈伤组织的再生三种。自发加倍的优点是不会出现核畸变，但加倍的频率极低；而后二条途径可显著提高加倍频率，但易引起核畸变。1自发加倍 自发加倍的频率在不同的植株上是不同的。烟草自发加倍的频率低，约1%2%。水稻自然加倍的频率高达70%以上。2人工加倍 用秋水仙碱处理单倍体可使加倍频率提高。最简单的方法是（以烟草为例）：烟草花药中刚刚长出来的小苗，在分苗的同时，浸泡在秋水仙碱溶液中，浓度以0.2%0.4%为宜。浸2448小时后再移植到新的培养基上。也可将秋水仙碱调制在羊毛脂中，浓度为0.4%，涂在烟草成年植株的腋芽或顶芽上。或用棉花球蘸了0.20.4%秋水仙碱的水溶液，放在烟草成年植株的腋芽或顶芽上。为了防止药液挥发，每隔一定时间滴一次相同浓度的秋水仙碱溶液。处理时间2448小时。再去掉棉花球，用清水冲洗干净。但是，秋水仙素的处理会造成染色体和基因的不稳定。如经秋水仙碱处理的烟草都有核畸变发生，多数花序发育不正常；又如一个甘蔗杂种的细胞用50mgL-1秋水仙素处理4天，进行培养后，获得了1000多个再生植株，其中大约45%的染色体数目加倍。3从愈伤组织再生 从单倍体烟草上切下的茎或叶柄等组织，放在琼脂培养基上使它诱发愈伤组织，然后再移到分化培养基上，使它再分化出芽和根。由于愈伤组织中核内有丝分裂频率较高，因此再生的植株二倍体占的百分率也提高。一般以烟草茎愈伤组织的加倍效果最好，加倍的比例可达40%左右。此方法对F1花粉植株效果更好，可达60%左右。问题是由茎愈伤组织分化的苗中常有大量多倍体产生。在已分化的植物细胞（皮层、髓等）和长期培养的愈伤组织中，染色体常能自发加倍。做法是，把单倍体植株的茎、叶柄或根的节段，置于一种适当的培养基中，诱导形成愈伤组织，经过反复继代后，诱导频率增加。把这种愈伤组织转移到分化培养基上，在再生植株中将出现许多二倍体植株。在细胞培养中也存在着染色体自发加倍的现象。第四节 禾谷类作物花药培养技术要点一、 水稻花药培养技术（一） 取材与处理1鉴定花粉发育时期 花粉处单核中、晚期之间是最佳接种期，此时颖花为浅绿色，花药长至颖壳的五分之二左右。一般花粉处于单核早期以前的花药不易出愈，且诱导时间长，二核期以后的花药因接近成熟而较难脱分化，再生植株也多为白苗。2采集幼穗 选择处于适宜接种期的健壮植株，剪取包含幼穗的上半部分植株，剪去叶片，留下部分叶鞘包裹幼穗。3低温预处理 用70%的酒精进行材料表面消毒，然后用保湿纸裹上材料，再包上铝箔，放置于810C的低温下处理714天。将处理后的花药接种，能提高愈伤组织和花粉植株诱导率。（二） 接种与培养1消毒与接种 取出由铝箔包裹的材料，经过表面消毒后，放进超净工作台中。在超净工作台中，剥去叶鞘，取下幼穗。把幼穗浸在70%的酒精中消毒后，用剪刀剪下带颖花的幼穗枝梗，再剪下颖花。剪去颖壳的上半部，然后用镊子夹住颖花，在培养瓶口敲打，使花药从颖壳剪口处直接进入培养瓶。2选择培养基 水稻花药培养常用的基本培养基有Miller、MS、White、N6、LS、B5等。不同的基因型对培养基有不同的反应。如果培养材料比较广泛，最好用多种培养基同时接种，以获得较好的培养效果。N6培养基与MS培养基的有机成分和微量元素结合，附加2mg/L 二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1.5mg/L 萘乙酸(NAA)和5%蔗糖较适合于粳型或籼/粳杂交的花药培养；在LS、B5基本培养基中添加3mg/L 二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1g/L 酵母浸出液（YE）、500mg/L 水解乳蛋白（LH）和5%的蔗糖，适用于籼型材料。固体的、液体的均可酌情采用。3愈伤组织的培养 花药接种后，置于黑暗中培养，保持27C温度，一般20天可见愈伤组织。愈伤组织在无光条件下增殖较快，但长期无光则导致过度的增殖而影响分化能力，或者虽能分化但叶绿素形成受阻；相反，在光照条件下能成苗的愈伤组织很快现绿，但光照又比较容易引起愈伤组织老化坏死。因此，采取前暗后光的培养方法较好。（三） 分化培养1分化培养基选择 粳稻的分化培养基多采用MS培养基（添加3%的蔗糖）。愈伤组织进行分化时对激素的要求较简单，一般只要去掉二氯苯氧乙酸(2,4-D)，增加激动素（KT）即可。也可用1mg/L 萘乙酸(NAA)+2mg/L 激动素（KT）+0.5mg/L吲哚乙酸（IAA）相配合，或者用2mg/L 萘乙酸(NAA)+4mg/L 激动素（KT）。2愈伤组织的转移 水稻花药接种后15天开始产生愈伤组织，大量出现是在培养后的3035天，并一直延续到75天。从愈伤组织的年龄来看，以出现愈伤组织后10天左右转移分化效果较好。从愈伤组织的大小来看，以2mm左右转移为合适。愈伤组织的质地是影响分化的决定因素。愈伤组织呈乳白色、结构致密、表面光滑滋润、增殖慢、膨大快的分化力强。而黄至深黄色、结构松散易碎、干松似面包粒一样的愈伤组织，增殖快、无分化能力，不论其大小，都不必转移。3适宜的光照和温度 当转移分化培养后，先置暗室培养35天，待愈伤组织增大后给以10002000勒克斯的光照，每日1416小时。分化培养期间，温度仍以27C为好。过低温度生长太慢，也影响分化。过高温度，培养室干燥，愈伤组织增殖快，易老化，白苗率增加。（四） 壮苗再培养 愈伤组织转移分化培养，有分化能力的愈伤组织不断增殖，陆续分化幼苗，致使在同一器皿内的幼苗大小不一，为增加实际成苗数，应采取分管壮苗再培养。壮苗培养基以半量的MS大量元素，铁盐全量，15g/L蔗糖，pH值6，附加4mg/L秋水仙碱，以使单倍体再行加倍。当幼苗长至3cm左右高时，可分苗转管，大苗取出，小苗留下再培养。这样不断壮苗，陆续移栽，每个组合能有100管壮苗，就能有足够数量的花粉植株供选择。（五） 试管苗的培植与管理 当试管苗长至15cm左右，真叶3片以上，根系新鲜发达的，可出管移植。幼苗出管，用水洗净根系，将较长的卷曲老叶、黄根剪去。将苗放在清水中养根炼苗数天。待新根新叶伸出时定植。土温2530C，相对湿度85%以上。（六） 单倍体花粉植株的二倍化 水稻花粉植株的加倍频率较高，在70%以上。用于水稻单倍体植株染色体人工加倍的方法主要有以下三种：一是在含秋水仙碱的诱导培养基上诱导出愈或将愈伤组织转入含秋水仙碱的分化培养基上诱导分化以扩大二倍体植株的频率。二是用秋水仙碱（0.040.1%）处理单倍体分蘖。三是单倍体组织离体培养，利用单倍体细胞容易加倍的特点获得加倍植株。二、 小麦花药培养技术要点（一） 花粉发育时期 花粉发育时期是影响花药培养效果的重要因素。从四分体到二核期都有可能诱导出愈伤组织，而以单核中期时接种效果最好，这时植株的外部形态为：旗叶的叶耳和其一叶叶耳之距在1020cm（因品种和气候而异）。（二） 培养基 培养基是诱导花粉产生愈伤组织和花粉植株的主要外因条件。常用的培养基有N6、LS、马铃薯II、C17、W14等（表8-1）。一般加入2mg/L的2,4-D。 蔗糖浓度是诱导花粉植株的一个重要因素，它不仅能调节培养基的渗透压，而且是重要的碳源。小麦花药培养最适宜的蔗糖浓度为8%9%。也可用葡萄糖代替蔗糖。（三） 培养温度 培养温度对花粉愈伤组织和花粉植株的诱导有较大影响。以2528C的温度为合适。（四） 低温预处理 接种前将花药置于35C低温下处理37天，将处理后的花药接种，能提高愈伤组织和花粉植株诱导率。（五） 高温后处理 高温后处理是将刚接种的花药放置在较高温度下适时培养，然后在常温下培养。在一定范围内进行高温后处理，主要是有助于提高冬小麦花粉愈伤组织诱导率，对愈伤组织的再分化也能起到一定作用。这种作用既表现在提高绿苗分化率方面，又表现在提高白苗分化率方面。高温后处理以接种后经32C处理36天的效果较好。温度过高和处理时间过长，均会导致绿苗诱导率的降低。花粉植株的越夏 当花粉植株在培养室中长至67cm高时，因培养室的高温不利于花粉幼苗健壮生长，应转移到4C的冰箱或低温室中越夏。低温能起蹲苗的作用，促使根系充分发育，幼苗茁壮成长，这是保证花粉幼苗能移栽成活的重要因素。在低温室中储藏时间一般为两个月，到秋分时节移栽入土。（六）愈伤组织和试管苗的染色体加倍 进行花药培养时，在愈伤组织增殖过程中，有时通过核内有丝分裂，使小麦染色体加倍。其自然加倍率一般在2030%，而70%左右的单倍体，必须进行人工加倍。 最常用于染色体加倍的药剂是秋水仙碱。愈伤组织的处理方法：无菌条件下，将挑选生长旺盛的胚性愈伤组织块转入秋水仙碱浓度为5070mg/L的MS液体继代培养基中，置4C冰箱中12天，再转入分化培养基中分别培养。愈伤组织和再生植株的加倍率可达2040%。另外，延长愈伤组织的培养时间，可以引起染色体数目自发地加倍。 再生植株的处理方法很多，主要有四种：（1）浸泡分蘖节及根系；（2）浸泡分蘖节；（3）分蘖节穿线；（4）生长点上方切口。浸泡分蘖节及根系的具体做法是：将幼苗分蘖节及根系浸入简化营养液+0.05%秋水仙碱+1.53%二甲基亚砜、pH值7的溶液中10小时（弱光照，1416C），自来水冲洗23小时后移栽至营养钵中（覆盖塑料薄膜，保持温度410C，湿度98%100%，57天），25天后连钵移栽大田。成活率90%以上，加倍率50%左右。小麦试管苗染色体加倍，通常于秋季10月下旬至11月上旬进行效果较好。表8-1 LS、马铃薯II 、C17和W14培养基单位：mg/L成 分LS马铃薯IIC17W14KNO31900100014002000(NH4)2SO4100NH4NO31650300NH4H2PO4380KCl35K2SO4700KH2PO4170200400MgSO47H2O37