《生物药物分析》PPT课件.ppt

生物药物分析学概述第一节药物分析的性质和任务一 药物分析的性质二 药物分析的任务 第二节药物的质量标准一 药物质量的评价二 药物的质量标准三 药典与分析方法四 药物分析与生物药物分析的关系 第三节生物药物概述一 生物药物的范围1 生化药物2 生物技术药物3 生物制品二 生物药物的研制发展过程第一代第二代第三代 三 生物药物的分类 一 按生物药物的化学本质和化学性质来分类1 氨基酸及其衍生物类药物类2 有机酸 醇酮类3 维生素4 酶及辅酶类5 酯类 6 多肽和蛋白质类7 核酸及其降解物和衍生物8 糖类9 生物技术药物类10 生物制品类 二 按生物药物的用途分类1 治疗药物2 预防药物3 诊断药物4 用作其它生物医药用品 四 生物药物的性质五 生物药物的特点1 相对分子质量的测定2 生物活性检查3 安全性检查4 效价测定5 生化法确证结构 第四节生物药物的科学管理一 药品质量标准制定原则 一 药品质量标准制定原则 二 药典的内容1 国家药典2 部颁药品标准和副药典3 地方药品标准 二 生物制品的标准化 一 生物制品规程 二 生物制品的国家标准品和国家参考品三 生物药物的科学管理 第五节生物药物的分析检验一 生物药物质量检验的程序与方法1 药物的取样2 药物的鉴别试验3 药物的杂质检查4 药物的安全性检查5 药物的含量 效价 测定6 检验报告的书写 二 生物制品的质量检定 一 生物制品的理化检定1 物理性状检查 1 外观检查 2 真空度及溶解时间2 蛋白质含量测定3 防腐剂含量测定4 纯度检查 5 其它测定项目 1 水分含量测定 2 氢氧化铝与磷酸铝含量测定 3 磷含量测定 二 生物制品的安全检定1 一般安全性检查2 杀菌 灭活和脱毒情况的检查3 外源性污染检查4 过敏性物质检查 三 生物制品的效力鉴定1 动物保护力试验2 活疫苗的效力测定3 抗毒素和类毒素的单位测定4 血清学试验 三 生物药物常用的定量分析方法1 酶法1 酶活力测定法 测定酶的含量或活性2 酶分析法 以酶为分析工具测定待测物质2 电泳法3 理化测定法4 生物检定法 利用药物对生物体的作用来测定效价或生物活性的方法 1 药物的效价测定2 微量生理活性物质的测定3 某些有害杂质的限度检查 生物药物分析信息的获取一 常用参考书二 各国药典三 常用期刊四 数据库资源 第二章酶分析法在生物药物分析中的应用一 以酶为分析对象 通过底物或者产物浓度的改变来测定生物样品中所含的酶量或者酶活力的测定 称为酶分析法二 以酶为分析试剂 测定需要检测的物质 称为酶法分析 酶法分析的优点 1 专一性强2 效率高3 反应温和4 方法简便 第一节酶法分析的原理一 酶的定义和性质 1 蛋白质2 专一性的催化功能3 活性受到多种因素的影响商品化酶测定试剂盒 二 酶反应的动力学米氏曲线 低浓度时 产物浓度随底物浓度的增加而增加 高浓度时 酶和底物结合饱和 产物浓度保持不变 米氏常数米氏方程 第二节酶试剂的动力学原理一 酶试剂的主要类型1 单酶法 应用单一酶测定底物2 多酶法 需要两个或者两个以上的酶耦联起来测定 二 酶法分析的测定方法 一 测定酶反应的速率1 连续监测法 每隔一段时间读取一下数据 求出酶反应的速率2 固定时间法 在反应途中加入终止剂终止反应 求出这段时间内反应的速率 主要用于测定酶活力 二 测浓度1 终点法 反应完全结束后测定底物或者产物的浓度2 固定时间法 在固定的反应时间终止反应 测定反应物或者产物浓度 主要用于测定底物 第三节酶法分析的检测方法酶反应中底物的减少 产物的增加量必须借助一定的检测方法进行检测 一 紫外 可见分光光度法酶反应中 当底物或产物在紫外 可见光区有吸收峰时 可应用此法进行检测 紫外 可见分光图谱中 吸收峰的峰值与浓度成正比 二 荧光光度法酶反应中 当底物或者产物有荧光吸收时 可用此法进行检测 检测灵敏度较高 专一性强 三 氧电极法酶反应过程中 产物有二氧化碳和氧气时 可以通过这些气体的改变量来进行检测 灵敏度较高 四 固定化酶和酶电极法固定化酶 电极 有传感功能 酶电极酶反应过程中产生的离子含量 如氢离子 的变化导致电流量的改变 通过酶电极显示的电流量的改变测定底物的浓度 固定化酶的优点 1 可以反复使用2 比较稳定3 利于产物提纯 五 放射性同位素测定酶反应过程中对底物 产物或者酶进行放射性同位素标记 通过测定同位素的含量来测定底物浓度 有污染性 第四节终点测定法酶法分析是以酶作为试剂分析非酶类物质 反应使底物完全转化为产物 通过测定底物的减少量 产物的增加量来定量待测物的方法称为终点测定法 一 应用终点法的条件 一 有作用于待测物质的酶和酶制剂 二 能够确定使酶反应接近进行完全的条件 三 反应中底物的减少 产物的增加可用某种检测方法进行测定 二 终点法的种类 一 单酶反应测定法1 利用底物量的减少进行测定2 利用产物量的增加进行测定3 辅酶变化量进行测定 二 多酶耦联测定当被分析的底物或者反应产物没有易于检测的方法时 可以借助加入另一种酶 使之产生易于检测的产物或者底物 被耦联的酶起指示剂的作用 称为指示酶 第五节反应速率法测定反应的初速率 从而计算被测物质的浓度 一般此种方法很少用 第六节酶循环放大分析法用于测定体液中的微量物质 酶循环法是利用酶的底物特异性来放大靶物质 被测物质 的测定方法 此法循环靶物质 增加了靶物质的量 利于测定 减少干扰 缺点 1 工具酶的用量为普通酶法的10倍 费用较高 2 酶循环法中所需的试剂价格较高 3 体液中某些微量物质的测定缺少合适的工具酶 第七节生物传感器与酶传感器一 生物传感器1 概述传感器 能感受一种信息并可将这种信息转变成可以测量的信号的器件 测量的信号一般为电子信号 生物传感器 利用生物功能物质作为识别器件而制成的传感器 敏感元件 酶 抗体 微生物 测定物理量 化学量的变化 检测信号 电信号优点 选择性好干扰少 2 生物传感器的组成 1 可以选择性识别被测物质的部分 感受器用能识别被测物质的功能物质酶 抗体等用固定化技术固定到适当的膜上 形成功能性生物敏感膜 2 发出电信号的电化学装置 把发生在敏感膜上的生物反应产生的变化转化成电信号输出 3 生物传感器的分类 1 按照敏感材料分类 酶 微生物 免疫 细胞器 组织传感器 2 按照信号转换器分类 电化学 半导体 测光型 测热型 测声型生物传感器 4 生物传感器的特点 1 具有分子识别元件 不需要样品的预处理 2 体积小 可以实现连续监测 3 响应快 样品用量少 且敏感材料是固定化的 可以反复多次使用 4 传感器成本远低于大型仪器 便于推广普及 5 生物传感器的应用 1 酶传感器 葡萄糖 氨基酸 尿素 2 细胞器传感器 NADH 3 微生物传感器 葡萄糖 醋酸 4 免疫传感器 梅毒抗体 蛋白质 二 酶传感器 一 概述底物 待测对象 酶膜 产物 转换元件 光信号 电信号 二 结构1 酶固定化2 与电化学传感器相连 酶固定法的方法 1 吸附法 酶分子通过极性键 氢键 疏水力等作用吸附在不溶性载体上 常用载体 活性碳 多孔玻璃 氧化铝优点 步骤简单 对酶损失小缺点 生物活性物质易从电极中渗出举例 脂肪酶 过氧化物酶 2 凝胶或聚合物包埋法将酶分子包埋在凝胶或者聚合物的细微格子里制成固定化 常用凝胶 聚丙烯酰胺 海藻酸钙等缺点 1 孔径的大小导致高分子量的底物反应受阻 2 使小分子量的酶漏出举例 木瓜蛋白酶 纤维素酶 3 交联法用双功能基试剂将酶和凝胶结合 将吸附在膜表面的活性分子之间进行交联 可以避免解吸附和酶从网格中漏出 缺点 反应条件苛刻 不易掌握 双功能试剂 戊二醛 4 共价键的连接采用共价键结合优点 酶不易脱落 二 酶传感器的分类 测定电流 测定电位1 电流型酶传感器酶催化反应的反应物或产物在电极上发生氧化还原反应产生电流 产生的电流与被测物的浓度成比例 使用的酶为氧化还原酶 1 O2 2 H2O22 电位型 检测离子浓度 四 酶传感器应用 第一节概述一 电泳定义 带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象 分析带电的生物大分子 蛋白质核酸 电泳法分析 电泳法 带电荷的样品在惰性支持介质中 在电场的作用下 向对应的电极方向按照各自的速度进行泳动 使组分分离程狭窄的区带 进行性质和质量的分析 二 电泳技术的分类 纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳2 按凝胶形状分水平电泳垂直电泳 1 按支持物分 第二节基本理论迁移率 带电颗粒在单位电场强度下移动的速率 1 带电颗粒的性质1 带电荷多 迁移快2 体积小 迁移快 影响迁移率的主要因素 2 电场强度电压的大小 电场强度高 迁移快常压电泳 100 500V 电泳时间长高压电泳 500 1000V 电泳时间短 电流大 需要冷却装置 3 溶液的pH值pH值影响带电颗粒解离的程度 决定物质所带的电荷数目 蛋白质是两性电解质 pH值离等电点越远 颗粒所带电荷就越多 迁移快 4 溶液的离子强度离子强度高 迁移慢 在保持足够缓冲能力前提下 离子强度较小为好 通常缓冲液离子强度为 0 05 0 1mol L5 电渗作用液体对固体支持物的相对移动 第三节纸电泳法 应用最早 目前不太用 电泳介质 滤纸 1 仪器2 操作法1 电泳缓冲液 枸橼酸盐缓冲液pH3 02 滤纸处理 甲酸浸泡漂洗烘干3 点样湿点 浸泡取出加样干点 点样于滤纸上吹干喷湿 4 电泳 电压梯度 18 20V cm时间 1 2小时吹干 检查5 含量测定 紫外灯下检视 剪下斑点 测定吸光度分离小分子电荷物质 如氨基酸 短肽 核酸等 适用 第四节琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶具有较大的孔径 适于大分子物质的分离 主要用来检测核酸 核酸在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率取决于 1 琼脂糖浓度 浓度小 迁移快2 核酸分子大小 分子大 迁移慢3 核酸的形状 形状紧密成球形 迁移快 全自动凝胶成像分析系统 SyngeneGeneGenius全自动凝胶成像系统 第五节醋酸纤维素薄膜电泳法优点 1 电泳后区带界限清晰2 通电时间短 20min 1h 3 对各种蛋白几乎不吸附 因此无拖尾现象4 对染料也没有吸附 无样品处几乎完全无色 适用范围 分离极性大分子操作 1 仪器装置 2 试剂 1 缓冲液 巴比妥PH8 62 染色液 氨基黑3 漂洗液 乙醇 冰醋酸4 透明液 冰醋酸 乙醇 3 操作法 1 处理薄膜2 点样3 电泳 10 12V cm电压梯度4 染色5 透明 5 含量测定 洗脱法 吸干剪下区带测定吸光度 扫描法 干燥色谱扫描仪扫描区带大小应用 血清蛋白 血球蛋白 球蛋白 糖蛋白等分离分析 第六节聚丙烯酰胺凝胶电泳法以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质 优点 1 对样品的吸附作用小 电渗作用小2 可以通过调整聚丙烯酰胺的浓度来调整空隙大小 筛选特定分子量的物质3 对热稳定 凝胶透明 电泳结果易于观察缺点 神经毒 1 仪器装置 垂直电泳2 试剂 缓冲液聚丙烯酰胺染色液 考马斯亮蓝脱色液 乙醇 冰醋酸 3 操作法 1 制胶2 电泳3 染色和脱色4 观察定量检测 扫描区带面积 第七节SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 分离蛋白质 SDS使蛋白质变性 形成一级结构 电泳只取决于分子量的大小 用于测定蛋白质的分子量 第八节等电聚焦定义 在电泳槽中放入载体两性电解质 当通直流电时 两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH值梯度 分离蛋白样品时 不同的蛋白质移动到与其等电点相当的pH值位置上 优点 分辨率高 可直接测定蛋白质的等电点缺点 1 要求用无盐溶液 而无盐溶液中 蛋白质可能发生沉淀2 不适用在等电点不溶或者发生变性的蛋白质 载体两性电解质的条件 1 在等电点处有足够的缓冲力 不致被其它物质改变pH值2 分子量要小 使之可与被分离的高分子物质分离3 化学组分不同于被分离物质 不干扰测定4 应不与分离物质反应或变性 pH梯度支持介质 聚丙烯酰胺凝胶 最常用 琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶染色 不可用染色剂直接染色 因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合 因此应先将凝胶浸泡在5 的三氯醋酸中去除两性电解质 然后再以适当的方法染色 适用范围 分离蛋白质和多肽 仪器 第九节高效毛细管电泳法HPCE highperformancecapillaryelectrophoresis 以弹性石英毛细管为分离通道 以高压直流电场为驱动力 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的分析方法 优点 毛细管表面积大 利于高电压下的热量扩散 高分辨率 快捷 仪器化 类型多样 1 单根毛细管电泳空管填充管2 陈列毛细管电泳3 芯片式毛细管电泳4 联用 毛细管电泳的研究 应用 方法研究 应用 1 氨基酸 肽 蛋白质分离2 糖分析 手性药物等的快速分析3 核酸序列分析4 单个细胞和病毒的分析 使分析科学从微升进入纳升水平 使单细胞 单分子分析成为可能 一 毛细管电泳分离模式1 毛细管区带电泳 CZE分离机理 基于被分离物质的荷质比的差异用于分析荷电粒子 氨基酸多肽蛋白质等 2 1984年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱 MEKC 不仅能测离子 而且能测中性分子 手性对映体等 二 毛细管电泳的特点弹性聚酰亚胺涂层 熔融石英管 内径25 100微米 1 容积小 表面积大 散热快 可承受高电场2 可使用自由溶液 凝胶等为支持介质 优点 1 高效2 快速 几十秒至十几分钟3 微量 1微升进样量消耗体积1 50微升之间4 多模式分离 却仅需一台仪器5 应用范围广 从无机离子到中性分子到单个细胞 均能分析 6 自动化程度高7 洁净 通常使用水溶液 对人和环境无害 8 经济 实验中使用的缓冲液量少 总结高灵敏度 高分辨率 高速度 低成本 低耗样 应用范围广 三 毛细管电泳法的基本装置 一 毛细管电泳仪的基本结构1 毛细管2 进样器 电动进样3 检测器 常用紫外 可见检测器4 电渗与吸附作用5 毛细管清洗6 电源 7 温度控制1 冷风2 液冷四 毛细管电泳法的应用1 分离分析生化样品 无机离子 小分子有机物 氨基酸 肽 蛋白 核酸 2 单细胞分析3 临床分析较少 样品 血 尿 成分复杂 分析前处理复杂 第十节蛋白质组学研究中的核心技术 双向凝胶电泳 TwoDimensionalElectrophoresis 2DE 蛋白质组研究旨在揭示基因表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能 双向电泳是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一 另两种是质谱技术和蛋白质组信息学 操作过程 1 2DE的第一向电泳 等电聚焦电泳 Iso ElectricFocusing IEF 在IEF中 蛋白质因等电点不同而被分离2 2DE的第二向电泳 SDS PAGE电泳 在SDS PAGE中 不同分子量的蛋白质相互间被分离开3 用考马斯亮兰或银染进行检测 经Pdquest等软件对结果进行比对 解析 意义 由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重要性质 而2DE同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差异分离蛋白质 因此2DE的分离能力非常强大 它甚至能将细胞中的5000种蛋白分离开 2DE在分离蛋白混合样品 比较差异方面有不可替代的作用 结合质谱鉴定技术可查明大型蛋白复合物各组组分 与其它生物技术如分子生物学 分子遗传工程 免疫学 微量蛋白质的自动氨基酸序列分析相结合 可以快速准确地发现和鉴定新的蛋白质 双向电泳高分辨率和高灵敏度已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具 第三章免疫分析法第一节概述是以特异性抗原 抗体反应为基础的分析方法 1959年 首次将放射性核素示踪技术与抗原抗体识别相结合 建立了放射免疫分析法 RIA 免疫分析法的优点 1 高灵敏度2 高特异性3 适于特定复杂体系中的微量组分 应用 1 药物代谢动力学参数的测定2 超过安全剂量易发生严重不良反应的临床药物血液浓度监测3 从发酵液或细胞培养液中快速测定有效组分的含量4 对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价 第二节抗原一 全抗原和半抗原 一 定义 在机体中引起特异性免疫应答反应的物质 包括两层含义 免疫原性 促使动物产生抗体抗原特异性 能与抗体结合全抗原 同时具有免疫原性和抗原特异性半抗原 只有抗原特异性 没有免疫原性 二 药物分子的抗原性1 药物分子的免疫原性大分子药物 蛋白 多肽 全抗原小分子药物 半抗原 半抗原药物 载体蛋白 合成抗原 免疫动物 产生抗药物分子的抗体 利用半抗原药物的抗原特性 免疫分析 二 人工抗原合成针对半抗原小分子药物 将其人工合成抗原 早期工作 利用重氮化反应将芳香胺类化合物通过酪氨酸残基与蛋白质结合 形成结合蛋白质 与之结合的蛋白质称为载体蛋白 人工抗原合成的方法 化学反应检测 定性定量 第三节抗体定义 抗体是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白 IgG在血清免疫求蛋白中的含量最高 高达70 是最常用的抗体 一 抗体的制备1 抗血清 多克隆抗体 由抗原直接免疫动物获得2 单克隆抗体 小鼠免疫脾细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 一 抗血清的制备1 免疫原的制备 免疫物质 佐剂2 动物免疫 兔 羊3 试血及效价测定4 免疫动物血液采集和抗血清的分离 二 单克隆抗体的制备 二 抗体的纯化1 非专一方法 化学方法 提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白2 专一方法 利用免疫吸附剂和亲和层析色谱的方法得到免疫学上专一性的抗体 一 IgG的化学分离1 冷酒精沉淀法2 中性盐分段沉淀法简便 常用利用硫酸铵或硫酸钠沉淀免疫球蛋白 3 DEAE 纤维素柱层析法IgG不被柱子保留 被洗脱下来 其它血蛋白组分均被保留 二 利用免疫吸附剂纯化特异性抗体1 利用特异性抗原纯化特异性抗体抗原与不溶性载体结合 制成特异性的免疫吸附剂 2 利用特定的细菌蛋白纯化特异抗体从葡萄球菌中分离出的A蛋白和从链球菌中分离出的G蛋白在一定条件下可与各种免疫球蛋白的Fc端相结合 A蛋白与不溶性载体结合后可以纯化免疫球蛋白 商品A蛋白载体 Sepharose4B 第四节免疫分析方法及应用一 RIA放射免疫分析法最早建立经典有毒害 二 荧光免疫分析FIA1 荧光淬灭有荧光的抗体 不发荧光的半抗原 能量从抗体转移至半抗原 荧光消失2 荧光增强有荧光的抗原吸收抗体中蛋白质色氨酸转移过来的光能 三 克隆酶给予体免疫分析法CEDIA利用DNA重组技术合成 galactosidase 半乳糖苷酶 的两个独立存在时无酶活性的蛋白质片段 小片段ED大片段EA当样品半抗原多 ED标记半抗原与抗体结合少 ED与EA结合 产生酶活性增强 优点 反应灵敏精确度高 四 酶联免疫分析法ELISA抗体或抗原包被技术微孔板 聚苯乙烯板和蛋白类抗体或抗原有较强的相互作用ELISA的灵敏度10 8 10 12g 基本原理 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面 并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性 又保留酶的活性 ELISA可用于测定抗原 也可用于测定抗体 在这种测定方法中有3种必要的试剂 固相的抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体 酶作用的底物 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 操作步骤如下 1 将特异性抗体与固相载体连接 形成固相抗体 洗涤除去未结合的抗体及杂质 2 加受检标本 使之与固相抗体接触反应一段时间 让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合 形成固相抗原复合物 洗涤除去其他未结合的物质 3 加酶标抗体 使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 彻底洗涤未结合的酶标抗体 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关 4 加底物 夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量 根据同样原理 将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物 即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体 显色系统 辣根过氧化物酶固 液抗原 抗体 第四章高效液相色谱法第一节概述Highperformanceliquidchromatograhpy HPLC 分离溶解于溶液中的混合物 高压输液泵输入流动相 装有固定相的色谱柱 监测器检测色谱信号 室温下操作 流动相性质温和适于分离分析沸点高 分子量大 热稳定性差的物质和生物活性物质 主要应用于下列产物的分离和鉴定 氨基酸 蛋白质 酶 多肽 甾体化合物 糖类 核酸 脂类 高效液相色谱仪中的主要部件 1 高压泵2 高灵敏度的检测方法紫外监测器 荧光监测器3 色谱柱 第二节高效液相色谱的分离模式根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力 分配系数 离子交换作用 分子尺寸大小和亲和力的差异进行分离 根据分离原理不同可以分为 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 体积排阻色谱法 亲和色谱法 第三节液 固色谱法 又称吸附色谱法 载体为硅胶 分离组分与吸附剂性质相近易吸附保留时间长 第四节键合相色谱法 液 液色谱法 将固定相共价结合在载体颗粒上 根据键合相与流动相之间相对极性的强弱 可将键合相色谱法分为正相色谱合反相色谱 正相色谱法 结合到载体上的基团是极性基团 用于分离极性化合物反相色谱法 固定相是直链饱和烷烃 为非极性 流动相为极性物质 用于分离极性小的组分 第五节离子交换色谱Ionexchangechromatography IEC以离子交换树脂作为固定相 适于分离蛋白质 多肽物质 第六节体积排阻色谱法 又称空间排阻色谱或凝胶色谱法 葡聚糖Sephadex 大分子先洗脱下来小分子后被洗脱按照分子量大小 体积大小进行分离 第七节亲和色谱法 利用生物分子之间的专一性作用进行分离 如抗体与抗原酶与抑制剂药物与细胞受体等 用硅胶做为刚性基质 特异性高 第八节色谱分离方法的选择1 了解各种色谱方法的特点及应用范围 2 了解样品的有关性质 分子量大小 溶解度 极性 稳定性 化学性质 第五章生物质谱法第一节概述生物大分子质谱分析法一 基质辅助激光解吸离子化质谱法Matrix assistedlaserdesorptionionizationmassspectromerty MALDI MS 1 用激光束轰击样品2 基质的作用 吸收激光 防止激光直接照射样品造成破坏3 无碎片离子峰4 可以是正离子峰 也可以是负离子峰 二 电喷雾离子化质谱法Electrosprayionization ESI MS1 也没有碎片离子2 正离子质谱 蛋白质合多肽负离子质谱 寡核苷酸3 可以与高效液相色谱联用 第二节多肽和蛋白质分析一 测定分子量 MALDI MS或ESI MS直接测定MALDI TOFMS飞行时间质谱仪测定的分子量没有理论上限 二 鉴定目标蛋白质1 蛋白质分子量2 测定肽图谱及氨基酸序列测定方法 1 用酶降解蛋白质2 用HPLC进行分离3 用质谱仪测定酶解后的片段分子量 第三节糖蛋白和寡糖分析糖蛋白的分析包括 分子量含糖量连接在多肽链上的寡糖结构糖蛋白的结构分析非常困难 一 糖蛋白的分子量测定MALDI TOFMS二 糖连接部位的分析1 在分析部位降解蛋白2 测定片段质谱三 寡糖的序列分析 将蛋白用一系列的酶酶解 结合MALDI MS分析 可以解析出寡糖的连接顺序 第四节核苷酸分析比蛋白质与多肽的分析要困难得多 因为核苷酸极性较大 难以形成气相离子 需要对色谱仪进行改进 用改进后的MALDI TOFMS可以测定核苷酸的分子量大小 应用 MALDI TOFMS与蛋白水解相结合用于蛋白 DNA复合物分析 习题 1 生物药物的分析方法有哪些 2 简述ELISA双抗体夹心法的操作步骤 检测未知抗体的间接法 第五章生物检定法Biossay定义 利用药物对生物体 整体或者离体 的作用来测定其生物活性的一种定量方法 1 以药物的生物学作用为基础2 采用适当的实验设计方法3 应用生物统计学工具4 用效价单位表示 优点 结果直接反应药物的活性和药效 更能说明问题 缺点 由于生物的个体差异性的存在 结果精密度差 操作麻烦 难以重复和控制 适用 没有恰当的理化方法进行检测的药物 随着现代分析手段的进步 将逐渐被新的理化检测方法所代替 生物检定的方法学研究 实验技术上的改进1 小动物代替大动物2 反应类型由质反应改为量反应3 离体代替整体测定 应用 1 药物效价测定 适用于结构复杂 理化方法不能测定含量或生物活性的药物 如抗生素 胰岛素 2 药物的毒性成分及有害杂质的限度检查 如内毒素致热物质 3 新药研究 有效成分未知的中药品种 以其疗效为基础设计生物检定法来控制质量 第六章氨基酸 多肽和蛋白质类药品检验第一节氨基酸类药品检验氨基酸 是治疗蛋白质代谢紊乱 蛋白质缺损所引起的一系列疾病的重要生化药物 也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂 有着广泛的生化作用和临床疗效 新的生化药物 甲基酪氨酸治疗嗜铬细胞瘤乙酰羟脯氨酸治疗风湿性关节炎偶氮丝氨酸治疗白血病 理化性状 白色晶状体熔点高溶于强酸强碱盐能溶于水具有等电点 一 氨基酸的定性鉴别 一 化学鉴别法1 最常用的方法 茚三酮显色法氨基酸与茚三酮结合显蓝紫色2 对某种氨基酸加以鉴别 可以借助特定的显色反应 P201 二 薄层色谱鉴别法1 薄层板的制备2 溶液的配置3 层析4 显色 吲哚醌显色剂茚三酮 硝酸钠显色剂 三 紫外 红外光谱鉴别1 紫外吸收光谱法适用鉴别三种有紫外吸收的氨基酸名称最大吸收波长 nm 酪氨酸275色氨酸280 288肩峰 苯丙氨酸258 257 264小吸收峰 2 红外吸收光谱法先制成溴化钾片 测红外吸收光谱与标准图谱进行比较 二 氨基酸杂质和安全性检查1 特殊杂质 一般为其它种类的氨基酸 可以用薄层色谱法进行限量检查 显示的杂质斑点的颜色不能深于对照液的主斑点 2 安全性检查 热原的含量家兔法 静脉注入供试品 观察家兔的体温的升高情况 三 氨基酸的含量测定 一 茚三酮法最广泛使用的方法根据蓝紫色的深浅来测定氨基酸0 5 50ng 二 三硝基苯磺酸法吸收峰420nm偏碱性溶液中340nm偏酸性溶液中0 05 0 4umol 三 蓝色氨基酸 铜复合物的紫外吸收50 500umol ml 四 甲醛滴定法 酸碱滴定法 利用甲醛促进使氢离子释放释放的一个氢离子 一个氨基氮用氢氧化钠来滴定 五 非水溶液滴定法 较为常用 氨基酸有氨基和羧基 在水中显中性 加入冰醋酸就显示出碱性 再利用高氯酸等强酸进行滴定 六 HPLC或氨基酸自动分析仪HPLC进行分析时 多数氨基酸无紫外吸收 不能用紫外检测仪进行检测 需要进行化学衍生化 包括柱后和柱前衍生化法 第二节蛋白质 多肽类药品的检验1 多肽和蛋白质类药物是非常重要的生化药物 2 多肽 小分子化学性质类似氨基酸性质差异大 3 蛋白质 两性解离的电解质亲水 溶于水活性易受外界的影响变性沉淀 一 多肽类药物的检验原则 根据药物的结构和特性选择合适的测定方法如胰岛素的测定P2121 小鼠血糖法2 RP HPLC 二 蛋白质的快速定量方法 1 依靠蛋白质本身的发色基团2 显色剂反应产生的紫外吸收目前常用方法 直接紫外吸收法Bradford法Lorry法 一 紫外吸收法原理 蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸 280nm紫外吸收峰 蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度成正比 优点 迅速 简便 不消耗样品 低浓度盐类不干扰测定 缺点 有一定的误差 实验室一般不采用 适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质 二 Bradford法原理 蛋白质与染料考马斯亮蓝G 250结合 使染料最大吸收峰从465nm变为595nm 在一定的线性范围内 反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比 三 Lorry法原理 蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2 络和使得肽键伸展 从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应 产生蓝色 在一定浓度范围内 其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比 由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同 因此在测定时需使用同种蛋白质作标准 二 蛋白质类药物检验方法原则 根据药物的结构和特性选用不同的方法 如 人血丙种球蛋白的测定P125利用人血丙种球蛋白的左旋性质 用旋光仪进行测定 比用经典的凯氏定氮法简便 快捷 又如 缩宫素的效价测定利用生物检定法 离体大鼠子宫收缩作用 二 特殊杂质和安全性检查1 杂质检查 聚丙烯酰胺凝胶电泳法液相色谱法2 安全性检查 致敏性检查 第七章酶类药品检验第一节酶的分离纯化要分析检验一个酶 就需要先进行分离纯化 所以酶分离纯化工作是酶类药品研究的重要组成部分 一 常用的方法和技术基本原则 1 酶的化学本质 蛋白质 用于蛋白质分离纯化的方法都适用于酶的分离纯化 2 酶具有催化功能 与底物 底物类似物 抑制剂等具有特异的亲和力 可以利用亲和色谱技术进行分离 一 沉淀法1 盐析法 原理 酶在低离子强度介质中表现为溶解 酶在高离子强度介质中表现为析出 盐析 不同蛋白质盐析所需的离子强度不同 盐析用的盐 硫酸铵优点 在水中溶解度大 对酶无害 对酶有稳定的作用 分级效果好 价廉易得 2 PEG沉淀法利用有机高分子聚合物优点 效果好 对蛋白质的活性结构起到稳定的作用PEG分子量越高 用量越少 但粘度大 不方便操作 一般使用PEG4000和PEG6000 3 有机溶剂沉淀法 加入有机溶剂 使介质的介电常数下降 使蛋白质分子间的静电作用力增强 降低蛋白质分子表面的水合程度 使蛋白质溶解度下降 沉淀下来 4 等电点沉淀法调节pH值与某蛋白的等电点pI相等 沉淀蛋白 5 热变性沉淀法该法条件剧烈不适合对热敏感的目的酶 适于对热稳定的酶 如酵母细胞酶 通过控制一定的温度 使大量杂蛋白沉淀去除 二 色谱法1 凝胶过滤色谱 条件温和 操作简单 色谱柱可以反复使用 用于测定蛋白质的分子量 固定相 具有一定孔径的多孔材料交联葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶 2 离子交换色谱原理 蛋白质是两性电解质依据蛋白质带电荷的数目 根据静电吸附能力的大小进行分离 离子交换剂基质 葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶纤维素凝胶聚丙烯酰胺凝胶合成树脂 离子交换剂二乙基氨基乙基基团 DEAE 分离中性或酸性蛋白质羧甲基纤维素 CM 分离中性或碱性蛋白质 3 亲和色谱原理 将配体共价连接到基质上 用此种基质填充成层析柱 利用配体与对应目的物的专一亲和力 将目的物与其它杂质进行分离 基质 琼脂糖 交联葡聚糖 聚丙烯酰胺凝胶 配体的种类很多 优点 分辨率高 收率高 可以一步纯化 4 疏水色谱蛋白质分子表面的非极性氨基酸侧链密集一起形成疏水区 原理 根据疏水吸附剂与蛋白质疏水区相互作用的强弱 达到分离蛋白质的目的 5 吸附色谱吸附剂表面存在许多随机分布的吸附位点 通过静电 范德华力等与蛋白质分子结合 结合力德大小与蛋白质的结构和吸附剂的性质密切相关 利用这种结合力的差异 通过色谱将蛋白质分离开来 该技术缺乏一般性的指导原则 目前较少应用 6 高效液相色谱 三 电泳法最常用 聚丙烯酰胺凝胶电泳 四 离心机法利用离心机产生的离心力来分离不同物质 五 膜分离法1 分离分子量差异显著的蛋白质2 用于样品的脱盐 浓缩 超滤 依据溶液中分子的大小和形状进行选择性过滤 外加压力 驱动酶液中的溶剂分子和较小的溶质分子穿过膜 截留分子量的溶质分子 用于酶液的脱盐和浓缩优点 条件温和 无需耗费任何化学试剂和设备 运作费用低廉 透析 用于脱盐 浓缩 透析袋 半透膜制成 允许小分子溶质通过 大分子溶质被截留在袋内 驱使小分子物质穿过膜的力量是扩散压 扩散压由横跨膜的浓度梯度形成 在这种力作用下 小分子不断通过膜 直至浓度梯度等于零 六 双水相系统萃取法利用溶质在溶液两相系统分配系数的差异 可将溶质分离 传统液液两相系统中含有有机溶剂 易使生物大分子变性失活 双水相系统用两种水溶性高聚物的水溶液混合 或一种水溶液高聚物的水溶液加上一种盐的水溶液混合 水溶性高聚物 PEG 葡聚糖盐 磷酸钾 硫酸铵第二节酶活力测定对酶进行追踪和各种分离纯化方法效果的鉴别都要使用酶活力测定方法 方法设计要求 一定的专一性快速 方便 一 酶活力测定的作用和意义酶活力是研究酶的特性 进行酶制剂生产及应用时的一项必不可少的指标 1 测定酶的质量2 控制酶的保质期3 评价蛋白质类原料的质量好坏 二 酶的活力单位和比活力酶活力定义 指酶催化某一特定化学反应的能力 酶活力单位定义 1个酶活力单位是指在规定条件下 1分钟内能转化1微摩尔底物所需要的酶量 反应温度为25度 其它条件如pH值 缓冲液等采用最适条件 1961年国际生化联合会酶学委员会 用以衡量酶活力的大小 所以 要对测定时的条件加以注明 酶的比活力 每克或每毫升酶制剂有多少酶活力单位 U ml 比活力高 说明酶的纯度高 三 酶活力测定方法酶活力增加催化速度增加测定酶活力 测定酶反应的速度酶反应速度测定 1 单位时间内2 单位体积中3 底物减少量4 产物增加量 一 固定时间法反应体系1 定量酶2 一定时间3 终止酶反应4 测定产物生成量或底物减少量间接推算酶的含量缺点 酶的作用速度开始快 后来慢 不稳定 二 连续监测法连续记录不同时间时的底物消失量或产物生成量 从而计算初速度1 紫外分光光度法 1 用NAD或NADP作指示原理 NADH和NADPH还原型辅酶340nm紫外吸收NAD 和NADP 氧化型辅酶没有紫外吸收 A 直接光度法测定需NAD NADP 参加的脱氢酶如 乳酸脱氢酶 P228根据340nm处的吸光度变化 计算酶的活力 B 偶联反应光度法酶的催化反应不需要NAD或NADP但产生的产物可与NAD或NADP参与反应C 三联酶反应光度法酶的反应不需要NAD或NADP产物也不直接参与NAD或NADP反应产物的另一反应的产物可与NAD或NADP反应需引入另一个辅助的酶反应 2 不用DNA或NADP作指示的光度法原理 底物无色产物有色吸光度的增加计算酶的活力如 碱性磷酸酶 P229磷酸对硝基苯酚酯对硝基苯酚底物无色产物405 415nm吸收 碱性磷酸酶 2 荧光分析法酶反应的底物或产物有荧光通过荧光的减少或增加推算酶速率3 旋光度法酶反应过程中伴随旋光的改变 三 固定浓度法产物达到一定的浓度反应时间与酶浓度成反比时间短 酶浓度高 酶活力高时间长 酶浓度低 酶活力低 四 影响酶活力的因素1 温度 双向作用升高酶活力增加太高酶失活要求最适温度 恒温2 pH值最适pH值3 底物浓度 底物浓度高 酶速度高到一定浓度 不再增加 4 辅酶和无机补充物5 抑制剂第三节酶活力测定方法设计一 酶促反应的条件最适条件 底物 pH值 温度 辅助因子1 空白 指杂质反应或自发反应引起的变化量 提供的是未知因素的影响 例 测定过程中要终止反应空白 先加终止试剂后加酶 不做终止反应缺底物的空白缺酶样品的空白 2 对照 指用纯酶或标准制剂测得的结果作为比较或标定的标准 二 酶反应的分析方法某些酶反应的产物本身或产物与其它物质反应后产生的产物易于测定 称为酶反应的指示剂 1 酸 碱2 ATP3 二氧化碳4 过氧化氢5 磷酸盐6 NAD NADP NADH NADPH7 氨气8 氧气P234表11 5 第四节药用酶的活力测定酶试剂种类多 在临床应用很广泛 酶类药物的效价测定一般以其生物学作用为基础 应用酶反应测定酶活力 一 糜蛋白酶的活力测定从牛 猪胰脏中提取性质 分解蛋白质作用 激活血纤维蛋白溶酶分解血纤维 炎性物质 表现抑制血液凝固或消炎作用 效价测定 N 乙酰 L 酪氨酸乙酯N 乙酰 L 酪氨酸无色有色二 溶菌酶的活力测定 P242鸡蛋清中提取作用革兰氏阳性菌 使胞壁中的肽聚糖分解 导致细菌溶解 有抗菌 抗病毒 促进血液凝固 分解脓液 修复组织的作用 酶 效价测定 底物 溶酶小球菌酶 溶菌酶反应 胞壁经溶菌酶水解结果 菌体破裂溶菌溶液的吸光度下降酶活力测定 一定条件下 每分钟引起吸光度下降0 001为一个酶活力 三 天 门 冬酰胺酶的活力测定从大肠杆菌中提取功能 杀死癌细胞临床上用于治疗急性白血病 恶性淋巴瘤 效价测定 底物 天冬酰胺酶 天冬酰胺酶反应 水解产生天冬氨酸 氨气结果 用碘化汞钾比色法测定氨的含量 四 超氧岐化酶的活力测定SOD P248SOD是重要的氧自由基清除剂临床应用广泛 测定方法有数十种1 黄嘌呤氧化酶 细胞色素C法一定条件下 3毫升的反应液中 每分钟抑制氧化型细胞色素C还原达50 的酶量定为一个活力单位 2 微量连苯三酚自氧化法一定条件下 1毫升反应液中 每分钟抑制连苯三酚在325nm波长处自氧化的速率达50 酶量为一个活性单位 第八章糖类 脂类和核酸类药品检验第一节多糖类药物的结构分析研究 糖是一大类多羟基醛或酮化合物单糖分子具有还原性 含有醛 酮 多糖的分子量大 水合度较大 水溶液有一定的粘度 能降解为单糖 三种主要单糖 葡萄糖 果糖和半乳糖三种主要二糖 蔗糖 麦芽糖和乳糖 果糖 葡萄糖 半乳糖 蔗糖 麦芽糖 乳糖 氧 其余原子为碳 葡萄糖简化形式 葡萄糖 糖原 淀粉 纤维素 直链 支链 多糖 多糖分子中单糖组成不同 分子量不同 多糖结构多样 具有不同的生理活性 多糖类药物的化学结构与生理活性密切相关 多糖类结构分析内容 单糖组成分子量 一 多糖中单糖的组成分析1 确定单糖组成 定性 多糖水解纸上色谱薄层色谱颜色反应 2 测定各单糖的组分比例 定量 HPLC高碘酸氧化生成甲酸比色法 一 定性鉴别1 多糖单糖脱水糖醛有色物质2 糖结构中含有不对称碳原子具有旋光性不同的糖具有特定的旋光度 酸水解 浓酸加热 萘酚 鉴定 3 硫酸软骨素 大分子粘多糖 半缩醛结构 还原性 氧化亚铜红色沉淀 加热 碱性酒石酸铜 二 单糖的分离鉴定多糖水解水解液离心过滤滤液分离鉴定1 纸上色谱分离P251滤液 多糖水解液 滤纸上纸层析喷雾显色根据样品和对照品的比移值及斑点颜色进行鉴定 硫酸 加热 碳酸钡 中和 滴于 加单糖对照品 2 薄层色谱法3 HPLC差示折光监测器4 气相色谱 质谱联用 GC MS 水解液气相色谱MS定性测定单糖之间的摩尔比 硅烷化衍生物 三 各单糖的含量测定及组成比1 HPLC色谱峰的面积2 化学测定法根据不同单糖的各自特性P252 二 分子量的测定 一 凝胶过滤HPLC原理 排阻凝胶色谱 根据分子量大小进行分离注 对仪器的要求色谱柱 多糖专用的凝胶柱监测器 差示折光监测器 二 其它测定法1 粘度计 推算分子量2 超速离心法 根据沉降系数 推算相对分子量三 糖苷链连接方式的测定 一 红外吸收光谱 型糖苷键840cm 1 型糖苷键890cm 1 二 NMR核磁共振谱四 糖苷键连接位置测定 一 高碘酸氧化高碘酸氧化1 2 二羟基甲酸1 2 3 三羟基甲醛不同位置的缩合 被氧化生成的甲酸 甲醛 的量不同 测定甲酸 甲醛 的量可以测定多糖中各单糖的连接位置 推算出支链数 二 甲基化反应产物分析多糖羟基甲基化水解GC鉴定甲基化水解产物推算单糖间的结合位置 如果多糖分子中带有支链甲基化水解后可生成二甲基单糖根据生成的二甲基单糖的分子数即可推算有几个支链 甲基化试剂 甲酸 三氟醋酸 第二节多糖类药物的理化性质分析一 物理常数测定 一 溶解度测定大多数多糖在水中溶解度小 不溶于有机溶剂 能溶于稀碱 二 比旋度测定均有一定的比旋度 三 粘度测定二 纯度分析 一 有关杂质的测定从动植物 微生物及海藻中分离提取过程中可能引入的杂质 有关杂质测定方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳凝胶HPLC 紫外分光光度法多糖在200nm或 200nm处有最大吸收 紫外分光光度法于200nm 400nm处进行扫描 在260nm和280nm处无吸收 如有吸收峰表示可能混有核酸或蛋白质 检查部分可能水解的低聚糖 二 常规杂质检查无机物 重金属 铁盐 砷盐等的限度检查 三 含量测定比色法紫外分光光度法HPLCGC生物测定法 柱前衍生化 例如 1 硫酸软骨素水解产物288nm最大吸收专属性强2 肝素生物检定法 抗凝血作用 延长新鲜兔 猪血凝结时间的作用 过量酸 第三节糖类药品检验一 硫酸软骨素来源 猪的喉骨 气管等组织中提取的酸性粘多糖药物 功能 维持组织免疫机能 一 含量测定 1 比色法 酸水解氨基已糖产物红色2 紫外分光光度法过量酸水解产物288nm吸收峰二 香菇多糖1 单糖测定香菇多糖碘液滴定测定无水葡萄糖的含量 不得超过15 碱性 乙酰丙酮 二甲氨基苯甲醛盐 不水解 碘液滴定 2 香菇多糖含量测定香菇多糖同1法碘液滴定总的单糖含量 1的结果 香菇多糖的含量香菇多糖经酸水解后无水葡萄糖量不得少于85 酸水解 三 灵孢多糖来源 赤芝子实体产生的担孢子经提取制成的灭菌水溶液 功能 调节植物神经功能紊乱 改善微循环 增强机体免疫力 多糖620nm吸收峰 蒽酮 四 绒促性素性质 糖蛋白激素来源 怀孕45 90天的孕妇尿液中提取生物检定法测定 对幼小鼠子宫增重的作用 五 肝素来源 猪 牛 羊肠粘膜提取功能 天然抗凝血物质结构 六糖或八糖重复单位组成的线性分子效价测定 1 天青A法 含氨基的碱性染料天青A结合了肝素后本身的最大吸收向短波移动 2 色原底物法 肝素 抗凝酶 复合物 对凝血酶有抑制作用 量与肝素呈负相关 用色原底物测出 六 肝素钠来源 兔 牛肠粘膜中提取结构 硫酸氨基葡聚糖的钠盐粘多糖物质生物检测法 兔 猪血浆凝结时间的延长作用 七 低分子肝素功能 抗血栓药物来源 肝素分级或降解获得平均相对分子量 8000药典规定至少有60 量的低分子肝素并且抗FXa活性不得低于70U mg 一 抗FXa活性测定 二 平均相对分子质量的测定第四节脂类药品检验一 熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸分子结构含有羧基用酸碱滴定法 二 谷固醇谷固醇沉淀过滤洗涤干燥称重每1克沉淀物相当于0 253g谷固醇 洋地黄皂苷 乙醇液 三 大豆磷脂含有磷磷酸磷钼酸钼蓝620nm吸收四 辅酶Q10递氢体 免疫增强剂1 紫外分光光度法氧化型Q10还原型Q10275nm吸收减弱 酸 加热 钼酸 对苯二酚 还原剂 还原 2 HPLC五 亚油酸乙酯降血脂药GC直接分析六 胆红素胆红素偶氮染料 有色 对氨基苯磺酸 重氮盐偶联 七 多烯酸乙酯从海洋鱼类的鱼油中提取主要成分二十碳五烯酸乙酯EPA二十二碳六烯酸乙酯DHA降血脂药GC 第五节核酸和核苷酸类药品检验一 定性鉴别1 显色或沉淀反应如 三磷腺苷白色沉淀玫瑰红色肌苷绿色复合物 氯化钡 间苯三酚 酸 加热 3 5 二羟基甲苯 酸 2 紫外 红外肌苷254nm紫外吸收二 特殊杂质检查纸色谱纸电泳薄层色谱 三 含量测定核酸具有共轭双键的嘌呤或嘧啶碱基 有强烈的紫外吸收 多采用紫外分光光度法 一 三磷酸腺苷二钠 ATP辅酶类药物参与体内脂肪 蛋白质和核酸的代谢 是机体能量的重要来源 从家兔肌肉中分离纸色谱分离后进行分光光度测定 二 辅酶A酰基转移酶的辅酶对人体的糖 脂肪及蛋白质的代谢起重要的作用 从酵母细胞中提取生物体内还原型 活化型 与氧化型 非活化型 并存 药物为还原型 活化型 效价测定方法很多 广泛采用的是磷酸转乙酰化酶 PTA 紫外分光光度法原理 乙酰磷酸盐 还原型辅酶A乙酰辅酶A 磷酸 PTA 233nm吸光度低 233nm吸光度大 三 聚肌胞单链聚肌苷酸 聚胞苷酸 双链聚核苷酸免疫增强剂抗病毒1 定磷法样品中的磷酸磷钼酸钼蓝蓝色660nm 聚合 钼酸铵 还原剂 2 地依酚法荧光探针溴化乙啶EB聚肌胞双链碱基形成荧光 插入 四 肌苷微生物发酵法制得的辅酶类药物参与糖代谢 促进体内能量代谢和蛋白质合成9 D 核糖次黄嘌呤248nm吸收峰 基因工程药物质量控制第一节基因工程药物概述一 基因工程与制药1 生命科学 21世纪